雷珠單抗球內(nèi)注射治療視網(wǎng)膜靜脈阻塞并發(fā)黃斑水腫血清細(xì)胞因子變化及意義的研究

單俊杰，繆麗萍，葉 軍，曹國(guó)平

（泰州市人民醫(yī)院 眼科，江蘇 泰州 225300）

視網(wǎng)膜靜脈阻塞（retinal vein occlusion，RVO）是繼糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）之后第二大最常見(jiàn)的視網(wǎng)膜血管疾病，黃斑水腫（macularedema，ME）是RVO常見(jiàn)的并發(fā)癥，是RVO患者視力受損的主要原因之一。促血管生成細(xì)胞因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）被認(rèn)為是導(dǎo)致視網(wǎng)膜疾病中血管滲漏的主要因素，導(dǎo)致ME的形成。與VEGF一樣，各種炎癥因素也被認(rèn)為參與了RVO-ME的發(fā)病機(jī)制[1,2]。許多研究表明RVO-ME患者玻璃體中VEGF、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-8、IL-6、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblastgrowth factor，b-FGF）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平顯著升高[3,4]。

抗VEGF治療已被廣泛應(yīng)用于臨床，并被證明是治療視網(wǎng)膜血管疾病的有效途徑。雷珠單抗（Lucentis）是單一的含有對(duì)人源性VEGF-A發(fā)揮靶向作用的單克隆抗體Fab片段，并阻礙血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，避免新生血管生成，消除水腫和炎癥反應(yīng)的作用，短期內(nèi)可顯著減輕黃斑水腫的程度，提高患眼視力。雷珠單抗的眼部ME治療還存在復(fù)發(fā)、耐藥性、藥品的價(jià)格高、藥品使用次數(shù)多、治療時(shí)間間隔不確定等問(wèn)題。因此基于雷珠單抗治療的現(xiàn)狀，制定適合患者的個(gè)體化治療是臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的方向。研究一種有效預(yù)測(cè)RVOME發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)、評(píng)估抗VEGF治療后視力的方法成為抗VEGF治療RVO并發(fā)黃斑水腫所需要面對(duì)的一個(gè)重要問(wèn)題。目前未見(jiàn)有對(duì)RVO-ME患者抗VEGF治療前后血清中炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的系統(tǒng)研究，因此，我們測(cè)量了RVO-ME患者血清中IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-8，IL-10，IL-17A，IL-1b，IL-12p70，TNF-a，干擾素-γ（interferonγ，IFN-γ），IFN-a，VEGF，血管生成素II（angiopoietin II，ANG-II）等14種炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的水平，以確定RVO患者血清中炎癥因子水平是否與抗VEGF治療的預(yù)后相關(guān)。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象本研究經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（KY202004301），且患者及家屬均同意治療并簽署治療同意書(shū)。隨機(jī)選取2021年1月至6月在江蘇省泰州市人民醫(yī)院眼科就診確診的RVO繼發(fā)黃斑水腫患者20例20眼（男11例，女9例，平均年齡61.50±15.49，21～79歲），對(duì)照組為健康體檢者20例。入組標(biāo)準(zhǔn)為:（1）通過(guò)詳細(xì)的癥狀、體征、最佳矯正視力（best corrected visual acuity，BCVA）、眼壓、裂隙燈、間接眼底鏡、眼底彩照、光學(xué)相干斷層掃描技術(shù)（optical coherence tomography，OCT）、熒光素眼底血管造影術(shù)（fluorescein fundus angiography，F(xiàn)FA）檢查確診RVO，并伴有明顯的黃斑水腫（CMT≥300μm）;（2）首次診斷為RVO-ME，并接受玻璃體內(nèi)注射0.05ml雷珠單抗，并按要求參加所有隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)如下:（1）視網(wǎng)膜新生血管和/或新生血管性繼發(fā)性青光眼;（2）DR、青光眼或其他嚴(yán)重?fù)p害視力的眼部疾病;（3）眼科手術(shù)史。

1.2 方法

1.2.1 手術(shù)方法 手術(shù)在標(biāo)準(zhǔn)層流手術(shù)室進(jìn)行，患者仰臥位，內(nèi)眼手術(shù)常規(guī)消毒、鋪巾后，開(kāi)瞼器打開(kāi)患眼瞼，奧布卡因表面麻醉2次，稀釋后的聚維酮碘浸泡結(jié)膜囊1分鐘，避開(kāi)角膜，生理鹽水沖洗結(jié)膜囊2次，專用針頭抽取10mg/mL雷珠單抗0.05mL（0.5mg），更換無(wú)菌針頭，避開(kāi)球結(jié)膜的血管于角鞏膜緣后3.5或4mm處即睫狀體平部穿刺注射，去除針頭后，立即用無(wú)菌棉簽壓迫1分鐘，檢查注射眼眼壓、有無(wú)光感、瞳孔對(duì)光反應(yīng)情況，觀察無(wú)活動(dòng)性出血及玻璃體嵌頓等后遮蓋術(shù)眼至次日。所有患者手術(shù)均順利，無(wú)術(shù)中眼壓升高及前房穿刺操作，無(wú)其他術(shù)中及術(shù)后并發(fā)癥的出現(xiàn)。術(shù)后予以左氧氟沙星滴眼液4次/日，點(diǎn)術(shù)眼7天。定期復(fù)診。

1.2.2 檢測(cè)方法 所有患者于治療前，治療后1周、2周、1月分別用EDTA抗凝管采集靜脈血樣本（3～5ml），樣本采集后的30分鐘內(nèi)于4℃，1000xg離心15min，分離血漿，然后在-80°C下冷凍儲(chǔ)存。

采用ELISA方法檢測(cè)血清中VEGF（Human VEGF-A ELISA試劑盒，ELH-VEGF-1,廣州瑞博奧生物科技股份有限公司）、ANG-II（人血管生成素II ELISA試劑盒，DG11462H,北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司）水平，采用流式細(xì)胞儀（細(xì)胞因子聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，20210301，Cytek DxP Athena，江西賽基生物科技有限公司）檢測(cè)血清中IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-8，IL-10，IL-17A，IL-1b，IL-12p70，TNF-a，IFN-y，IFN-a的表達(dá)水平。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 25.0（SPSS Inc，Chicago，IL，USA）軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究中的定量資料不滿足正態(tài)性，以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，治療前后比較采用相關(guān)樣本的Friedman檢驗(yàn)。RVO的影響因素分析以是否為RVO為因變量，以具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的相關(guān)因子（采用向前：有條件法進(jìn)行自變量的篩選）為自變量，進(jìn)行Logistic多因素回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 RVO組與健康對(duì)照組血清細(xì)胞因子水平的比較RVO組的血清IL-1b、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、TNF-a、IFN-a、VEGF基線水平均顯著高于健康對(duì)照組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RVO患者血清中的IFNγ和ANG-II基線水平也高于健康對(duì)照組，但差異未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。具體見(jiàn)表1。

表1 RVO組與對(duì)照組細(xì)胞因子的比較

2.2 RVO的影響因素分析RVO的影響因素分析以是否為RVO為因變量，以具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的相關(guān)因子（采用向前：有條件法進(jìn)行自變量的篩選）為自變量，進(jìn)行Logistic多因素回歸分析（表2）。結(jié)果表明，IL-8（OR=1.30，95%CI：1.01～1.68）和VEGF（OR=1.16，95%CI：1.00～1.35）是RVO發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

表2 RVO影響因素的logistic回歸分析

表3 治療前后療效和相關(guān)因子的變化

2.3 RVO組治療前后相關(guān)因子的變化研究組檢測(cè)了RVO組在抗VEGF治療前以及治療后1周、2周、1月的最佳矯正視力（BCVA）、中心視網(wǎng)膜厚度（CMT）以及相關(guān)炎癥因子水平。相較治療前0.10（0.05～0.25），RVO患者的視力在抗VEGF治療后有了明顯的提高，治療后1周：0.20（0.10～0.50）、治療后2周：0.30（0.16～0.50）、治療后1月：0.30（0.20～0.49）。RVO患者CMT治療后也有了明顯下降，由治療前的576.00μm（449.50～653.00）依次下降為314.00μm（284.00～397.50）、 282.00μm （237.00～342.00）、271.00μm（241.50～297.00）（圖1）。接 受 抗VEFG治療后，RVO組患者血清VEGF的表達(dá)量也呈現(xiàn)逐步下降的趨勢(shì)（圖2）。然而，與治療前相比，IL-6、IL-8在抗VEGF治療后呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，且組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 抗VEGF治療前后BCVA、CMT變化

圖2 抗VEGF治療前后VEGF變化

3 討論

目前許多研究證實(shí)，在RVO患者的玻璃體或房水中，促炎因子，如IL-6、IL-8、TNF-α、VEGF等，顯著上調(diào)，并與黃斑水腫的嚴(yán)重程度相關(guān)[4-6]。然而，較少研究關(guān)注RVO患者血清中各種炎癥相關(guān)因子與抗VEGF治療的關(guān)系。因此，本研究比較了RVO組與健康組血清相關(guān)促炎細(xì)胞因子水平，以及抗VEGF治療前后，RVO患者的BCVA、CMT以及促炎細(xì)胞因子表達(dá)量的變化。研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，RVO組患者血清中IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、TNF-a、VEGF等炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)均明顯升高，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，IL-8、VEGF還顯示是RVO發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，在疾病的發(fā)展過(guò)程中起到了顯著的作用。本研究還比較了RVO患者在接受抗VEGF治療前，以及治療后1周、2周、1月各項(xiàng)指標(biāo)的變化。研究結(jié)果顯示，相較治療前，RVO患者的視力（BCVA）在治療后顯著提高，CMT以及血清VEGF表達(dá)量在抗VEGF治療后呈現(xiàn)逐步下降的趨勢(shì)。然而，與治療前相比，RVO患者血清中的IL-6、IL-8在抗VEGF治療后呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)。

IL-6,IL-8是一種重要的促炎細(xì)胞因子，可以直接或間接誘導(dǎo)各種其他炎性細(xì)胞因子的生成。被認(rèn)為通過(guò)誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)來(lái)增加血管通透性和新生血管生成[7]。

視網(wǎng)膜缺血缺氧與RVO-ME的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。缺氧會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）表達(dá)增加，大量研究認(rèn)為VEGF在RVO-ME的發(fā)生及進(jìn)展過(guò)程中起到關(guān)鍵調(diào)控作用，RVO患者玻璃體、房水中VEGF的含量較正常明顯升高，且與ME的嚴(yán)重程度正相關(guān)[8]。

與預(yù)期相同，本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，RVO組患者血清中IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、TNF-a、等炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)以及VEGF均明顯升高，提示炎癥在RVO中發(fā)揮重要作用，且血清與眼內(nèi)液中細(xì)胞因子表達(dá)水平存在一致性。

目前，抗VEGF治療仍是RVO-ME的一線治療方案。針對(duì)RVO組的高VEGF水平，本研究采用了對(duì)VEGF-A亞型有較強(qiáng)的親和力的雷珠單抗來(lái)進(jìn)行治療。雷珠單抗有強(qiáng)靶向性，可針對(duì)性地抑制VEGF-A與其受體VEGFA-1和VEGFA-2結(jié)合，阻礙血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，避免新生血管生成，減輕水腫和炎癥反應(yīng)，短期內(nèi)可顯著減輕黃斑水腫的程度，提高患眼視力。正如本研究結(jié)果顯示，相較治療前，RVO-ME患者的視力（BCVA）在治療后顯著提高，CMT以及血清VEGF表達(dá)量在抗VEGF治療后呈現(xiàn)逐步下降的趨勢(shì)。

然而，抗VEGF藥物對(duì)眼內(nèi)炎癥介質(zhì)的作用似乎有限。在之前的一項(xiàng)研究中，球內(nèi)注射貝伐單抗治療可降低眼內(nèi)VEGF濃度，而對(duì)其他炎癥細(xì)胞因子的濃度沒(méi)有影響[9]。Funk[10]等人研究了RVO患者接受抗VEGF治療時(shí)眼內(nèi)細(xì)胞因子濃度的變化，發(fā)現(xiàn)治療后VEGF和HIF1-a濃度降低，而其他炎癥細(xì)胞因子濃度未見(jiàn)明顯改變。

本研究檢測(cè)了抗VEGF治療前后，RVO-ME患者血清中各炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)水平，結(jié)果顯示大部分細(xì)胞因子表達(dá)水平未見(jiàn)明顯改變。然而，相比較抗VEGF治療前，IL-6、IL-8在治療后1周、2周、1月均顯示表達(dá)增加，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Agawa等[11]檢測(cè)了37例老年性黃斑變性（AMD）患者房水中的23種炎癥細(xì)胞因子，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組玻璃體腔注射貝伐單抗2天后，VEGF水平降低，而IL-6和IL-8明顯升高，推測(cè)玻璃體內(nèi)注射抗VEGF藥物可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，增加炎癥細(xì)胞因子表達(dá)水平，其相關(guān)作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

本研究存在幾個(gè)局限性。首先，樣本量偏小，治療后1月的失訪率較高。此外，沒(méi)有采集眼內(nèi)液，比如房水或玻璃體樣本，因此，無(wú)法研究眼內(nèi)細(xì)胞因子，并將其與血清細(xì)胞因子的表達(dá)變化進(jìn)行比較。

綜上所述，本研究證明了RVO-ME患者的血清中炎癥細(xì)胞因子明顯升高。其中，IL-8、VEGF還顯示是RVO發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，在疾病的發(fā)展過(guò)程中起到了顯著的作用。玻璃體內(nèi)注射雷珠單抗可以降低VEGF的表達(dá)，減輕黃斑水腫程度（CMT）以及提高患者視力（BCVA）。研究顯示抗VEGF藥物對(duì)RVO-ME患者血清炎癥細(xì)胞因子的作用似乎有限，但I(xiàn)L-6、IL-8在抗VEGF治療后反而增加，提示璃體內(nèi)注射抗VEGF藥物可能通過(guò)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，增加炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)水平。因此，針對(duì)RVO炎癥和血管生成相關(guān)因素的進(jìn)一步研究可能會(huì)導(dǎo)致新的治療靶點(diǎn)的開(kāi)發(fā)，以改善目前RVO的治療。