降解纖維素凝結(jié)芽孢桿菌的分離鑒定及生物學(xué)特性研究

余祖玲， 余祖華， 賈艷艷， 廖成水， 李 旺， 李元曉， 何萬(wàn)領(lǐng)， 丁 軻,

(1.河南科技大學(xué) 功能微生物與精準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室，河南 洛陽(yáng) 471023; 2. 洛陽(yáng)市活載體生物材料與動(dòng)物疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 河南 洛陽(yáng) 471023)

0 引言

纖維素酶是一類可以使纖維素分解成纖維二糖和葡萄糖的酶系的總稱，包括羧甲基纖維素酶、微晶纖維素酶和β-葡萄糖苷酶。動(dòng)物飼料中含有大量的纖維素，但除反芻動(dòng)物外，其他動(dòng)物很少分泌纖維素酶消化分解纖維素[1]。因此，篩選具有纖維素酶活的菌株，并將其用于單胃動(dòng)物生產(chǎn)，能夠促進(jìn)單胃動(dòng)物對(duì)飼料中纖維素的利用率，也能夠提高飼料中纖維素的添加量，從而提高經(jīng)濟(jì)效益[2]。自1912 年首次從土壤中分離出可降解纖維素的微生物[3]以來(lái)，陸續(xù)有學(xué)者分離鑒定出能降解纖維素的微生物，包括真菌、細(xì)菌以及原生動(dòng)物[4-5]等。文獻(xiàn)[6]分離的暹羅芽孢桿菌(Bacillussiamensis)H-7 羧甲基纖維素(carboxymethyl cellulose, CMC)酶活和濾紙酶活(filter paper activity, FPA)最高分別可達(dá)0.18 U/mL 和0.44 U/mL。文獻(xiàn)[7]篩選的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilies)Lu14的CMC酶活為1.106 U/mL， FPA酶活為0.76 U/mL。但由于產(chǎn)酶量較低等原因，無(wú)法滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求。因此，在自然界中篩選纖維素降解能力強(qiáng)的菌株仍然是一件必要且有意義的工作。文獻(xiàn)[8]報(bào)道過(guò)產(chǎn)酶菌株,凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)便是其中之一。凝結(jié)芽孢桿菌進(jìn)入腸道可以分泌多種有益物質(zhì),如α-半乳糖苷酶、蛋白酶、木聚糖酶等[9],還可以通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)乳酸，具有耗能少、產(chǎn)率高、經(jīng)濟(jì)效益高等優(yōu)點(diǎn)[10],可以替代抗生素調(diào)控機(jī)體腸道菌群生態(tài)平衡，抑制腸道有害菌群，提高消化吸收能力,從而提高動(dòng)物機(jī)體免疫力和生產(chǎn)性能[11]。凝結(jié)芽孢桿菌屬嗜熱菌,生存彈性優(yōu)良，可在較高溫度環(huán)境下發(fā)酵[12]，較適合生產(chǎn)需要，因此受到廣泛關(guān)注。美國(guó)飼料管理協(xié)會(huì)與中國(guó)農(nóng)業(yè)部相繼將凝結(jié)芽孢桿菌列為養(yǎng)殖生產(chǎn)中可直接飼喂的微生物制劑[13]，同時(shí)也將凝結(jié)芽孢桿菌作為新資源食品公示[14]。早在2005 年，中國(guó)食品和藥品監(jiān)督管理局授予了青島東海藥業(yè)有限公司凝結(jié)芽孢桿菌活菌片的新藥證書[15]。本文主要根據(jù)益生菌的生物學(xué)特性，以從土壤中分離出來(lái)的芽孢桿菌為研究對(duì)象，將其降解纖維素能力及耐酸耐高溫能力作為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，輔以對(duì)人工胃液、膽鹽脅迫的耐受性以及耐藥能力進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，以期為芽孢桿菌的新型飼料微生態(tài)制劑產(chǎn)品的開發(fā)提供研發(fā)素材。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品：采集于河南科技大學(xué)玉米試驗(yàn)田及紅葉李樹林根際的深度2～5 cm的不同位置土壤樣品。

分離培養(yǎng)基(1 L)：硫酸亞鐵0.01 g，磷酸氫二鉀0.4 g，氯化鉀0.5 g，硝酸鈉3 g，羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)10 g，七水硫酸鎂0.5 g，121 ℃高壓滅菌25 min。

增菌培養(yǎng)基(1 L)：氯化鈉5 g，牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，馬鈴薯浸出粉5 g，葡萄糖15 g，氯化鈉5 g，115 ℃高壓滅菌20 min，加入用無(wú)水乙醇溶解的0.02%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的硫酸鏈霉素。

發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基(1 L)：硫酸銨2 g，磷酸二氫鉀4 g，羧甲基纖維素鈉10 g，蛋白胨3 g，七水硫酸鎂0.3 g，酵母膏0.2 g，121 ℃高壓滅菌25 min。

濾紙培養(yǎng)基(1 L)：定性濾紙(長(zhǎng)6 cm、寬1 cm)3條/錐形瓶，硫酸銨1 g，七水硫酸鎂0.5 g，磷酸氫二鉀1 g，酵母浸粉0.1 g，121 ℃高壓滅菌25 min。

MRS(de Man,Rogosa,Sharpe)培養(yǎng)基(1 L)：葡萄糖20 g，胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，牛肉膏10 g，四水硫酸錳0.25 g，七水硫酸鎂0.58 g，Tween-80 1 mL，磷酸氫二鉀2.6 g，乙酸鈉5 g，檸檬酸銨2 g。

固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%～1.5%的瓊脂粉。

主要試劑為模擬胃液(1 L)：胰蛋白胨8.3 g，葡萄糖3.5 g，氯化鈉2.05 g，氯化鈣20.11 g，氯化鉀0.37 g，磷酸二氫鉀0.6 g，豬膽鹽 0.05 g，溶菌酶 0.1 g，胃蛋白酶13.3 g，用鹽酸分別調(diào)pH值至1.5和2.5。

其他試劑：0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))剛果紅染液、 1 mol/L NaCl洗脫液、 0.1 mol/L-pH4.5乙酸-乙酸鈉緩沖溶液、3，5-二硝基水楊酸、 1.0 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

微量生化發(fā)酵管：葡萄糖、蔗糖等36種發(fā)酵管購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)試劑：Taq酶(5 U/μL)、DL2000、Goodview核酸染料、瓊脂糖凝膠，購(gòu)自北京方寶生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離篩選

將采集的土壤樣品進(jìn)行編號(hào)，分別稱取5 g樣品與100 mL生理鹽水混勻，37 ℃、200 r/min振搖1 h。然后，各取 1 mL上述處理組，用生理鹽水進(jìn)行10倍稀釋，每個(gè)稀釋梯度取 100 μL菌液涂布于分離培養(yǎng)基中，挑選生長(zhǎng)良好的菌株轉(zhuǎn)接至增菌液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)24 h，離心取沉淀與100 μL生理鹽水于1.5 mL試管中吹吸混勻，然后吸取10 μL轉(zhuǎn)接于分離培養(yǎng)基中， 37 ℃培養(yǎng)2～3 d。取出后，滴加5 mL、0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的剛果紅染液染色，用1 mol/L的氯化鈉溶液脫色，最后根據(jù)有無(wú)水解圈，初步得到纖維素降解菌，通過(guò)油鏡觀察菌株的顯微形態(tài)，將符合芽孢桿菌的菌株進(jìn)行傳代純化并保存。

1.2.2 濾紙降解測(cè)定

觀察并記錄菌落周圍的透明圈直徑(H)與菌落直徑(C)比值的大小。將H/C值較大的菌株接種到增菌液體培養(yǎng)基中，于37 ℃搖床培養(yǎng)制備菌懸液。將菌懸液分別以2%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種到100 mL濾紙條培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)，并觀察濾紙條崩解情況，每個(gè)菌株設(shè)3個(gè)技術(shù)重復(fù)。根據(jù)濾紙崩解情況對(duì)菌株纖維素降解能力進(jìn)行判斷?！?+++”表示濾紙呈半清狀；“+++”表示濾紙呈糊狀；“++”表示濾紙呈不定狀；“+”表示濾紙邊緣已膨脹[12]。

1.2.3 纖維酶活力測(cè)定

采用3，5-二硝基水楊酸法測(cè)定纖維素酶活(CMC)和濾紙酶活(FPA)，調(diào)整菌株濃度的OD540為0.5，然后以1∶100的比例接種到產(chǎn)酶培養(yǎng)基上制備粗酶液，在50 ℃水浴反應(yīng)條件下，室溫測(cè)量計(jì)算產(chǎn)糖量。1 min水解底物產(chǎn)生1 mg葡萄糖所需酶量，單位為U/mL。

計(jì)算公式：酶活(U/mL)=(P×V1)/(V2×T)，

其中：P為葡萄糖質(zhì)量濃度，mg/mL；V1為測(cè)定總體積，mL；V2為樣品酶液體積，mL；T為反應(yīng)時(shí)間，min。

1.2.4 菌株鑒定

生理生化鑒定。參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[16]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行，包括運(yùn)動(dòng)性、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖等，以及甘露醇、明膠液化、甲基紅試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、淀粉分解、5% NaCl試驗(yàn)等。

16S 核糖體脫氧核糖核酸(ribosomal deoxyribonucleis acid,rDNA)的測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。取1.5 mL滅過(guò)菌的離心管加入500 μL生理鹽水，挑取單菌落于離心管中混勻，100 ℃以上沸水浴15 min，隨即置于冰盒5 min降溫，使細(xì)胞壁破裂釋放全部基因組。12 000 r/min離心2 min，吸取上清液，即目的DNA。擴(kuò)增16S rDNA，所用引物為細(xì)菌通用引物。16S rDNA反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s；54 ℃ 45 s；72 ℃ 2 min；30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min延伸，4 ℃保溫。擴(kuò)增完成后，用1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳對(duì) PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，電泳結(jié)束后，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察到約1 450 bp處出現(xiàn)明亮條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。將 PCR 產(chǎn)物送至上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。將所測(cè)得的序列在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行 BLAST分析，獲得相似性≥98%的16S序列，利用BLAST軟件進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)Mega7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)樹，以16S rDNA基因序列同源性A>98%為鑒定標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.5 耐膽鹽試驗(yàn)

將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液按6%的接種量分別接種于膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%、1%、2%、3%、4%的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h。取樣0.2 mL，在裝有1.8 mL 0.1%的瓊脂生理鹽水的試管中倍比稀釋，選擇適宜稀釋濃度的稀釋液20 μL點(diǎn)樣于MRS培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)。37 ℃培養(yǎng)10 h，培養(yǎng)結(jié)束后對(duì)平板上的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，取3組重復(fù)組的菌落數(shù)平均值進(jìn)行分析，計(jì)算存活率。

1.2.6 耐酸試驗(yàn)

將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液吸取1 mL于1.5 mL滅過(guò)菌的離心管中，5 000 r/min 條件下離心 10 min，所得菌體沉淀用無(wú)菌生理鹽水洗滌2次，再重新接種于無(wú)菌生理鹽水(調(diào)pH 值分別為 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、7.0)中，于 37 ℃搖床培養(yǎng) 4 h。然后，取 0.2 mL 培養(yǎng)液稀釋于 1.8 mL 0.1%的瓊脂生理鹽水中，進(jìn)行梯度稀釋，取適宜濃度的稀釋液20 μL點(diǎn)樣于MRS培養(yǎng)基上，每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)，在 37 ℃靜置培養(yǎng) 12 h，取3組重復(fù)組的菌落數(shù)平均值進(jìn)行分析，計(jì)算存活率。

1.2.7 耐胃液試驗(yàn)

取稀鹽酸1 moL/mL，加水稀釋，調(diào)節(jié)pH至1.5，每100 mL加入1 g胃蛋白酶，將溶液混勻后過(guò)濾備用。將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液按6%的接種量置于離心管中離心去上清后轉(zhuǎn)接到模擬胃液中，分別在0 min、60 min、180 min后取0.2 mL，與1.8 mL 0.1%的瓊脂生理鹽水倍比稀釋，取適宜濃度20 μL在MRS培養(yǎng)基上點(diǎn)樣培養(yǎng)，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)重復(fù)，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h后取出，取3組重復(fù)組的菌落數(shù)平均值進(jìn)行分析，計(jì)算存活率。

1.2.8 耐高溫試驗(yàn)

準(zhǔn)備滅過(guò)菌的試管分別進(jìn)行編號(hào)，將過(guò)夜培養(yǎng)菌液按6%的接種量接種到試管中，設(shè)置水浴鍋溫度為100 ℃，設(shè)時(shí)間梯度為0 min、3 min、6 min、9 min、12 min、15 min，每個(gè)時(shí)間梯度都設(shè)3個(gè)重復(fù)，在不同的時(shí)間梯度，將相對(duì)應(yīng)的試管取出，取0.2 mL與1.8 mL 0.1%的瓊脂生理鹽水混勻，取20 μL點(diǎn)樣在MRS培養(yǎng)基上，設(shè)3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h后，取3組重復(fù)組的菌落數(shù)平均值進(jìn)行分析，計(jì)算存活率。

1.2.9 藥敏試驗(yàn)

菌種活化后，用滅菌的生理鹽水將菌液稀釋為 1.0× 108cfu/mL的菌懸液，然后吸取 100 μL涂布于MRS平板上，待表面稍干后，放入抗生素藥敏片，每種抗生素藥敏片都做 3 個(gè)重復(fù)。37 ℃培養(yǎng) 24 h，觀察平板上藥物的抗菌活性，記錄各抗生素的抑菌圈直徑大小。試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，按照抑菌圈直徑標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行菌株的藥敏性評(píng)定。

1.2.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

存活率=(試驗(yàn)組活菌數(shù)/對(duì)照組活菌數(shù))×100%。

數(shù)據(jù)采用SPSS22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株初篩結(jié)果

將處理后的樣品稀釋適當(dāng)濃度后涂布于分離培養(yǎng)基，分離出生長(zhǎng)良好的菌株共32株，用剛果紅染色觀察發(fā)現(xiàn)共有7株菌產(chǎn)生酶解圈，通過(guò)計(jì)算水解圈直徑和菌落直徑的比值(H/C)來(lái)初步判定降解纖維素能力較強(qiáng)的菌株，結(jié)果如表1所示。

表1 分離菌株的H/C結(jié)果

2.2 菌株濾紙酶活結(jié)果

纖維素降解菌株的濾紙條崩解試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可知：菌株MRS-913將濾紙條崩解為不完全的糊狀，培養(yǎng)至第5天時(shí)，已經(jīng)完全崩解為糊狀，菌株MRS-19和MRS-04在培養(yǎng)至第6天時(shí)，濾紙條崩解為不完全的糊狀，其余菌株崩解效果較差，只能崩解濾紙邊緣。將7株菌株與對(duì)照組相比，菌株MRS-913崩解效果較為突出。

2.3 菌株纖維素酶活測(cè)定結(jié)果

將濾紙崩解試驗(yàn)得到的7株菌株接種到產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)3～4 d，制備粗酶液并測(cè)定其纖維素酶的活性，篩選出3株產(chǎn)酶活性較強(qiáng)的菌株，測(cè)定結(jié)果見表3。由表3可知：MRS-913的CMC和FPA均最好，挑選其做進(jìn)一步的鑒定。

表2 菌株濾紙條崩解情況

表3 纖維素酶活測(cè)定結(jié)果 U/mL

圖1 菌株MRS-913顯微形態(tài)圖(1 000×)

2.4 菌株MRS-913鑒定結(jié)果

2.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

菌株MRS-913在分離培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落為灰偏白色、圓形，表面濕潤(rùn)有光澤，邊緣整齊，中心突起。顯微鏡下觀察可見菌體呈紫色鏈長(zhǎng)桿狀，端生芽孢，無(wú)鞭毛且芽孢囊沒有明顯膨大(見圖1)。

2.4.2 生理生化鑒定結(jié)果

菌株MRS-913生理生化試驗(yàn)結(jié)果如表4所示，菌株MRS-913接觸酶、過(guò)氧化氫酶、淀粉酶陽(yáng)性；V-P試驗(yàn)反應(yīng)陰性為兼性厭氧菌；吲哚試驗(yàn)呈陰性；7%氯化鈉生長(zhǎng)陽(yáng)性；明膠液化陰性。將上述鑒定結(jié)果與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行對(duì)照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)。

表4 菌株MRS-913生理生化鑒定結(jié)果

2.4.3 16S rDNA鑒定結(jié)果

菌株MRS-913經(jīng)16S rDNA測(cè)序后，登錄Genbank，登錄號(hào)為MZ642313。利用MEGA7.0軟件與芽孢桿菌屬內(nèi)相關(guān)種進(jìn)行同源性比對(duì)，16S rDNA序列同源性在95%以下可以認(rèn)為屬于不同屬；同源性為95%～98%可以認(rèn)為是同屬不同種；同源性大于99%則認(rèn)為屬于同一種。如圖2所示，經(jīng)BLSAT同源性比較，MRS-913菌與凝結(jié)芽孢桿菌的親緣關(guān)系最近，同源性為99.93%，所以此菌株應(yīng)歸屬于凝結(jié)芽孢桿菌。

2.4.4 耐膽鹽試驗(yàn)結(jié)果

凝結(jié)芽孢桿菌MRS-913耐膽鹽試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，由圖3可知：凝結(jié)芽孢桿菌MRS-913在膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%～4%時(shí)，隨著膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，菌株的存活率降低。培養(yǎng)了10 h后，在膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)4%的培養(yǎng)基中菌株存活率依然有32.8%，可見凝結(jié)芽孢桿菌MRS-913對(duì)膽鹽有著較強(qiáng)的耐受力。

2.4.5 耐酸試驗(yàn)結(jié)果

凝結(jié)芽孢桿菌MRS-913耐酸試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。由圖4可知：隨著pH值的降低，菌株的存活率降低。在培養(yǎng)4 h后，當(dāng)pH值為1時(shí)，菌株的存活率為55.9%。與pH值為7時(shí)菌株的存活率對(duì)照，發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH值為5時(shí)，菌株存活率高達(dá)93.4%。由此可見，凝結(jié)芽孢桿菌MRS-913對(duì)酸有較強(qiáng)的耐受力。

圖2 菌株MRS-913基于16S rDNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖3 凝結(jié)芽孢桿菌MRS-913耐膽鹽試驗(yàn)結(jié)果

2.4.6 耐胃液試驗(yàn)結(jié)果

通常動(dòng)物體胃酸pH為1.5～3.0，食物在胃中停留時(shí)間為1～2 h。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了兩組pH，每組設(shè)置了3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，探究凝結(jié)芽孢桿菌MRS-913的胃液耐受力，結(jié)果如圖5所示。由圖5可以看出：凝結(jié)芽孢桿菌MRS-913在pH為1.5的模擬胃液中能夠存活180 min，存活率為62.7%。在pH為2.5的模擬胃液環(huán)境中能夠存活180 min，存活率達(dá)74.8%。由此可見，凝結(jié)芽孢桿菌MRS-913的芽孢耐受胃酸的能力很強(qiáng)。

2.4.7 耐高溫試驗(yàn)結(jié)果

耐高溫屬性賦予了凝結(jié)芽孢桿菌食品加工全新定義的功能，結(jié)合現(xiàn)有文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)本試驗(yàn)。凝結(jié)芽孢桿菌MRS-913的高溫耐受結(jié)果如圖6所示，將溫度設(shè)置為100 ℃，同時(shí)在0～15 min設(shè)置了6個(gè)時(shí)間點(diǎn)。在100 ℃水浴15 min后，凝結(jié)芽胞桿菌MRS-913的存活率為54.0%，說(shuō)明其對(duì)高溫有著較強(qiáng)的耐受力。

2.4.8 耐藥試驗(yàn)結(jié)果

判斷菌株的益生特性，還需要測(cè)試其對(duì)抗生素的敏感性。凝結(jié)芽胞桿菌MRS-913的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果如表5所示。由表5可知：除對(duì)桿菌肽、奧普托欣、林可霉素不敏感；對(duì)阿奇霉素低敏；對(duì)多黏菌素B、鏈霉素中度敏感；對(duì)紅霉素、卡那霉素高敏外，對(duì)其他7種抗生素都極高敏。

3 討論

本研究通過(guò)采集土壤樣品進(jìn)行篩選，最終篩選出了一株纖維素酶活性較高的菌株MRS-913，其酶活力可達(dá)(59.68±1.43) U/mL，降解纖維素能力較強(qiáng)。探究了凝結(jié)芽孢桿菌MRS-913的耐人工胃液、耐膽鹽、耐高溫、耐酸以及抗生素的敏感性能。發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽孢桿菌MRS-913對(duì)于胃液的耐受能力較強(qiáng)，在pH2.5的胃液環(huán)境中能夠存活180 min，存活率高達(dá)74.8%，高于文獻(xiàn)[17]分離的凝結(jié)芽孢桿菌N1在模擬胃液處理120 min后的存活率。文獻(xiàn)[18]研究發(fā)現(xiàn)，凝結(jié)芽孢桿菌13002在0.3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的膽鹽試驗(yàn)中，作用24 h的活菌總數(shù)出現(xiàn)反彈，存活率不降反升，達(dá)到81.4%，該試驗(yàn)結(jié)果可推測(cè)出凝結(jié)芽孢桿菌可以在腸道存活并且有極大可能增殖。文獻(xiàn)[19]研究證實(shí)凝結(jié)芽孢桿菌最高可耐受3.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))膽鹽，本研究發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽孢桿菌MRS-913最高可耐受4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的膽鹽，在培養(yǎng)了10 h之后存活率依然有32.8%。由此可見，小腸的膽鹽環(huán)境對(duì)此菌株沒有抑制作用。高溫在實(shí)際生產(chǎn)中嚴(yán)重影響益生菌活性，文獻(xiàn)[17]在凝結(jié)芽孢桿菌13002耐高溫試驗(yàn)中，僅探究了最高溫度80 ℃下的耐受性能，且認(rèn)為在60 ℃時(shí)的耐受性能最高。與文獻(xiàn)[20]發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽孢桿菌NJh032在100 ℃處理10 min后存活率65.35%的結(jié)果相較，MRS-913在100 ℃的水浴高溫環(huán)境下可存活15 min,存活率為54.0%，存活率相近但耐受時(shí)間更長(zhǎng)，體現(xiàn)出了優(yōu)秀的高溫耐受性，可以抵御生產(chǎn)過(guò)程中高溫處理的影響。文獻(xiàn)[21]從奶粉中分離出數(shù)株凝結(jié)芽孢桿菌,在pH2.0的酸性環(huán)境下存活率最高，高于本試驗(yàn)結(jié)果，但對(duì)高溫的耐受能力低于本試驗(yàn)結(jié)果。由此分析,在不同環(huán)境下分離出的菌株對(duì)于酸或高溫環(huán)境的耐受能力差異明顯。MRS-913在pH為1.0的酸環(huán)境中可存活4 h，存活率為55.9%，較適應(yīng)工業(yè)食品的發(fā)酵。

凝結(jié)芽孢桿菌是一種在腸道發(fā)揮益生作用的革蘭氏陽(yáng)性菌，文獻(xiàn)[22]發(fā)現(xiàn)畜禽飼料中的抑菌藥可能會(huì)影響飼用凝結(jié)芽孢桿菌的益生效果。人類食用性的凝結(jié)芽孢桿菌的使用更要科學(xué)用藥，規(guī)避“配伍禁忌”。在凝結(jié)芽孢桿菌MRS-913對(duì)抗生素的敏感性試驗(yàn)中，選用的抗生素對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌MRS-913都有較高的抑制能力，凝結(jié)芽孢桿菌MRS-913除對(duì)桿菌肽、奧普托欣、林可霉素不敏感，對(duì)其他常見抗生素均表現(xiàn)敏感性，表明凝結(jié)芽孢桿菌MRS-913不能和這些抗生素共用，否則會(huì)影響凝結(jié)芽孢桿菌MRS-913發(fā)揮益生作用。

分離出的凝結(jié)芽孢桿菌MRS-913可作為活菌添加劑添加到動(dòng)物飼料中，在克服消化道的苛刻條件后，通過(guò)胃液環(huán)境在小腸定植，在腸道內(nèi)定植后會(huì)分泌纖維素酶，促進(jìn)飼料消化吸收，降低料肉比。凝結(jié)芽孢桿菌通過(guò)調(diào)節(jié)微生物群組成、宿主免疫和代謝，對(duì)腸道疾病具有治療作用，如急性腹瀉、腸應(yīng)激綜合征等，此外，毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)和大量臨床觀察表明，凝結(jié)芽孢桿菌是安全的，沒有致突變性致畸性活遺傳毒性[23]。在生產(chǎn)、儲(chǔ)存、運(yùn)輸和管理方面都具高穩(wěn)定性，其孢子形成能力較強(qiáng)，必然將在未來(lái)對(duì)人類腸道疾病的治療中發(fā)揮更重要的作用。

4 結(jié)論

從土壤中分離出一株產(chǎn)纖維素酶的凝結(jié)芽孢桿菌MRS-913，該菌株在100 ℃水浴15 min，其存活率為54.0%，可耐受質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的膽鹽，在pH為1.0的酸性環(huán)境中可存活4 h，存活率為55.9%；在pH分別為1.5、2.5的模擬胃液中能夠存活180 min，存活率分別為62.7%和74.8%。且對(duì)桿菌肽、奧普托欣、林可霉素不敏感；對(duì)阿奇霉素低度敏感；對(duì)多黏菌素B、鏈霉素中度敏感，對(duì)四環(huán)素等極高度敏感。以上結(jié)果可以初步判定，分離出的凝結(jié)芽孢桿菌MRS-913具有優(yōu)良的益生特性，表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐高溫、耐酸、耐胃液、耐膽鹽性能，可作為微生態(tài)制劑進(jìn)一步開發(fā)利用。