不同采收期迷迭香酸含量測(cè)定及響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝研究

王 瑩，王 瑛，曾祥輝，鄧 慧

（邵陽學(xué)院 食品與化學(xué)工程學(xué)院，湖南 邵陽 422000）

迷迭香因具有抗氧化、抑菌、安全無毒等特性利用價(jià)值廣泛，其中藥用價(jià)值、食用價(jià)值和工業(yè)價(jià)值均有概述和研究[1-6]。從迷迭香中可提取多種抗氧化元素，可分為水溶性和脂溶性兩類抗氧化劑，其中水溶性抗氧化劑的組成主要有迷迭香酸和綠原酸等，研究表明水溶性抗氧化劑主要被運(yùn)用于食品加工和醫(yī)藥等方面[7]。

迷迭香被發(fā)現(xiàn)于歐洲及地中海沿岸，于曹魏時(shí)期引種至我國(guó)，在南北方均有栽種，由于我國(guó)南北方氣候差異大、土壤類型各異等環(huán)境影響，已有學(xué)者對(duì)不同產(chǎn)地、不同采收期的植物進(jìn)行研究[8-11]。試驗(yàn)以湖南省邵陽市種植的迷迭香為研究對(duì)象，以熱回流法為提取方法，通過HPLC 法對(duì)迷迭香酸得率進(jìn)行檢測(cè)，篩選出最佳采收期的迷迭香后，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化提取條件，為擴(kuò)大迷迭香資源利用最大化提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

迷迭香，磷酸、甲醇均為色譜純，迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC 純度≥98%），大連美侖生物技術(shù)有限公司提供；無水甲醇、無水乙醇等均為分析純；去離子水為實(shí)驗(yàn)室自制。

SY-1210 型恒溫水浴鍋，南京暢翔儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；3H16RI 型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，湖南赫西儀器裝備有限公司產(chǎn)品；BON-80 型電熱干燥箱，上海三騰儀器有限公司產(chǎn)品；SR-3000 型高效液相色譜儀，Thermo Fisher 公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣本預(yù)處理

將不同采收期的迷迭香置于45 ℃干燥箱中烘至恒質(zhì)量，經(jīng)粉碎機(jī)處理后過篩分別置于密封袋中保存，備用。

1.2.2 提取工藝流程

采用熱回流法[12]。迷迭香粉末→按比例加入溶劑提取→離心→定容→過微孔濾膜→成品→HPLC 檢測(cè)。

稱取定量迷迭香粉末置于燒瓶中，按所設(shè)定的提取條件采取回流法對(duì)迷迭香水溶性物質(zhì)進(jìn)行提取。將提取后的溶液離心并定容，取樣液過微孔濾膜進(jìn)行HPLC 分析。

1.3 提取工藝優(yōu)化

1.3.1 單因素試驗(yàn)

稱取定量迷迭香粉末，以提取溫度（40，50，60，70，80 ℃）、提取時(shí)間（40，50，60，70，80 min）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（40%，50%，60%，70%，80%） 和料 液 比（1 ∶10，1 ∶20，1 ∶30，1 ∶40，1 ∶50（g∶mL）） 為影響因素，在固定其中3 個(gè)提取條件不變的情況下，考查4 個(gè)影響因素在不同水平下對(duì)迷迭香酸得率的影響。

1.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

通過單因素試驗(yàn)得出最優(yōu)的提取條件后，采用Design Expert 8.0.6 進(jìn)行Box-behnken 方法設(shè)計(jì)，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)為四因素三水平，以提取溫度50 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，提取時(shí)間70 min，料液比1∶20 為中心試驗(yàn)點(diǎn)展開試驗(yàn)。

響應(yīng)面優(yōu)化的因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化的因素與水平設(shè)計(jì)

1.4 迷迭香酸含量測(cè)定

1.4.1 色譜條件

參考GB 1886.172—2016，使用高效液相色譜法測(cè)定迷迭香酸的含量[13]。使用C18反向色譜柱（4.6 mm×250 mm×5 μm），設(shè)置流動(dòng)相B 為0.5 %磷酸- 甲醇（體積比為55∶45），檢測(cè)波長(zhǎng)為283 nm，柱溫為40 ℃，流速為0.6 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，檢測(cè)時(shí)間15 min。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精密量取迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品，溶解制成0，0.125，0.250，0.500，1.000 mg/mL 質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，參考1.4.1 色譜條件進(jìn)行色譜分析。以迷迭香酸含量為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以峰面積（Y） 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品濃度（X） 進(jìn)行回歸分析，得到方程Y=322.028 1X-5.027 8，其相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9，此方程可精確計(jì)算出迷迭香樣品中迷迭香酸的具體含量。

1.4.3 迷迭香酸得率的計(jì)算

以HPLC 分析，積分計(jì)算樣品溶液迷迭香酸吸收峰面積，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算迷迭香酸質(zhì)量濃度。按下式計(jì)算迷迭香酸得率（Y）。

式中：c——迷迭香酸樣品質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——試樣溶液定容體積，mL；

m——試樣質(zhì)量，mg。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用Excel、Design Expert 8.0.6.1 等軟件進(jìn)行繪圖、響應(yīng)面優(yōu)化等數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同采收期迷迭香中迷迭香酸含量的測(cè)定

不同采收期迷迭香中迷迭香酸含量見表2。

表2 不同采收期迷迭香中迷迭香酸含量/%

迷迭香酸含量呈先升后降的趨勢(shì)，當(dāng)生長(zhǎng)時(shí)間為10 個(gè)月時(shí)其含量最高，為0.148%；當(dāng)采收期為8 個(gè)月、24 個(gè)月時(shí)，分別為0.138%和0.142%。由此可見，在迷迭香的生長(zhǎng)過程中，當(dāng)采收期為10 個(gè)月時(shí)迷迭香酸含量已達(dá)最高值，考慮到實(shí)際應(yīng)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益，故選取采收期為10 個(gè)月的迷迭香樣品進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 提取溫度對(duì)迷迭香酸得率的影響

提取溫度對(duì)迷迭香酸得率的影響見圖1。

圖1 提取溫度對(duì)迷迭香酸得率的影響

由圖1 可知，在40～80 ℃范圍內(nèi)，迷迭香酸得率隨溫度變化呈上升趨勢(shì)，當(dāng)溫度為50 ℃時(shí)達(dá)到較高值，而后在50～80 ℃范圍內(nèi)迷迭香酸得率相差量小。分析原因可能是，當(dāng)水溫在50 ℃以下時(shí)，未達(dá)到迷迭香酸的溶點(diǎn)，致使迷迭香酸的溶出率較低；但由于迷迭香酸的耐熱性較好，所以當(dāng)水熱在一定范圍內(nèi)時(shí)，迷迭香酸溶出率的差異較小，基于實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，故選取50 ℃為提取迷迭香酸的最佳溫度。

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)迷迭香酸得率的影響

提取時(shí)間對(duì)迷迭香酸得率的影響見圖2。

圖2 提取時(shí)間對(duì)迷迭香酸得率的影響

由圖2 可知，在40～80 min 內(nèi)，迷迭香酸得率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸上升，當(dāng)提取時(shí)間為70 min時(shí)達(dá)到峰值，之后隨時(shí)間的增加而下降。這可能是由于迷迭香酸的穩(wěn)定性較差，長(zhǎng)時(shí)間的提取使其他副產(chǎn)物溶出，造成迷迭香酸含量降低的現(xiàn)象，因此選取70 min 為最佳提取時(shí)間。

2.2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)迷迭香酸得率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)迷迭香酸得率的影響見圖3。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)迷迭香酸得率的影響

由圖3 可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%～80%時(shí)，迷迭香酸得率總體呈先升后降的趨勢(shì)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，迷迭香酸得率達(dá)到峰值，之后迷迭香酸的得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高而下降?？赡苁怯捎诿缘闼釣樗苄晕镔|(zhì)，低體積分?jǐn)?shù)的乙醇更利于其溶出，而高體積分?jǐn)?shù)的乙醇會(huì)使其他的物質(zhì)溶出增多，使得迷迭香酸得率下降[14]，故選取50%為最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)。

2.2.4 料液比對(duì)迷迭香酸得率的影響

料液比對(duì)迷迭香酸得率的影響見圖4。

圖4 料液比對(duì)迷迭香酸得率的影響

由圖4 可知，料液比在1∶10～1∶50 范圍內(nèi)，迷迭香酸得率大致呈先增后減現(xiàn)象，在1∶10～1∶20時(shí)該得率大幅度上升，但當(dāng)料液比大于1∶20 時(shí)，迷迭香酸得率隨料液比的增加變化量小。可能是由于適當(dāng)增加溶劑用量會(huì)提高迷迭香粉末與溶劑的溶解度，有助于溶出迷迭香酸，但當(dāng)料液比超過1∶20時(shí)，迷迭香酸溶出速率達(dá)動(dòng)態(tài)平衡，導(dǎo)致其他活性成分與迷迭香酸產(chǎn)生相互溶出的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，迷迭香酸提取量反而降低，加之過多的提取溶劑會(huì)造成資源浪費(fèi)和成本增加[15]。故選取1∶20 為最優(yōu)料液比。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 響應(yīng)面回歸模型的建立與分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以提取溫度（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、料液比（C） 及提取時(shí)間（D） 為試驗(yàn)因子進(jìn)行四因素三水平Box-behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以迷迭香酸得率（Y） 為響應(yīng)值，得到在不同條件下提取迷迭香酸的結(jié)果。

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

運(yùn)用Design Expert 8.0.6 進(jìn)行回歸分析得到迷迭香酸得率（Y） 的回歸方程為：

迷迭香酸得率方差分析見表4。

由表4 可知，該回歸模型F=96.44，p<0.000 1，表明該試驗(yàn)的回歸方程呈極顯著水平，表明該模型有較高可信度，該方程可以較好地預(yù)測(cè)迷迭香酸的得率。模型的決定系數(shù)R2=0.989 7，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.979 5，說明該模型可以應(yīng)用于分析迷迭香酸得率變化情況，擬合度較高。失擬項(xiàng)p=0.547 6>0.05，差異不顯著，表明未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較小，模型內(nèi)容合適，可應(yīng)用于對(duì)迷迭香酸提取工藝優(yōu)化進(jìn)行分析。除此之外，由表4 可知，料液比的影響極顯著，乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響顯著，根據(jù)F 值可知，各因素對(duì)迷迭香酸得率的影響情況依次為C>B>A>D；二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2均達(dá)到極顯著水平（p<0.01）。

表4 迷迭香酸得率方差分析

2.3.2 因素間交互作用分析

考查了提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和料液比這4 個(gè)影響因子中各因素間的相互作用對(duì)迷迭香酸得率產(chǎn)生的影響。

各因素間交互作用對(duì)迷迭香酸得率的影響見圖5。

在響應(yīng)面圖中，如果圖中坡度越陡則表示迷迭香酸的提取率受該因素的影響越大，反之則影響次之。由圖5 可知，料液比的增加明顯促進(jìn)了迷迭香酸的得率，當(dāng)料液比為1∶10～1∶20（g∶mL） 時(shí)，迷迭香酸得率顯著增長(zhǎng)，說明料液比對(duì)迷迭香酸得率的影響極大；此外，當(dāng)提取溫度在40～60 ℃時(shí)，迷迭香酸得率較為一致，說明該影響因素的變化對(duì)迷迭香酸得率的影響較小，該結(jié)果與方差分析的結(jié)果相一致。

圖5 各因素間交互作用對(duì)迷迭香酸得率的影響

根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)得出最佳提取條件為提取溫度50.63 ℃，提取時(shí)間69.45 min，料液比1∶23.66（g∶mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)50.94%，迷迭香酸得率預(yù)測(cè)值為1.27%。根據(jù)實(shí)際情況將提取條件整合為提取溫度51 ℃，提取時(shí)間69 min，料液比1∶24（g∶mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)51%，在此條件下進(jìn)行3 次水平試驗(yàn)，平均得率為1.24%，實(shí)際結(jié)果與預(yù)測(cè)結(jié)果誤差為0.03%（<5%），說明模型預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)驗(yàn)證值之間差異較小，證明此模型具有較高可行性。

2.4 方法可行性分析

2.4.1 重復(fù)性試驗(yàn)

定量稱取迷迭香粉末，按上述最優(yōu)工藝參數(shù)進(jìn)行回流提取，分別取6 份提取液供HPLC 分析，經(jīng)計(jì)算可知迷迭香酸得率為1.23%，與預(yù)測(cè)值誤差僅為0.04%，說明重復(fù)性較好[16]。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

以最優(yōu)工藝參數(shù)制作提取液，置于室溫保存，分別于0，2，4，6，8 h 進(jìn)樣檢測(cè)，記錄迷迭香酸樣品量，計(jì)算各樣品間的標(biāo)準(zhǔn)偏差為SD=0.05%，表明該提取液在室溫下8 h 內(nèi)較穩(wěn)定[16]。

3 結(jié)論

通過對(duì)5 個(gè)不同采收期的迷迭香進(jìn)行含量測(cè)定，得到迷迭香酸含量最高的采收期為10 個(gè)月，該采收期的迷迭香中抗氧化物質(zhì)含量高，且采收期較短，可更好地為迷迭香產(chǎn)業(yè)化發(fā)展助力。后又以該采收期的迷迭香進(jìn)行單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析，對(duì)迷迭香酸的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)表明，在提取溫度為51 ℃，提取時(shí)間為69 min，料液比為1∶24（g∶mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)為51%時(shí)，迷迭香酸得率為1.26%，與模型預(yù)測(cè)值1.27%無顯著差異，且該模型調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.979 5，證明該方案具有較高可行性。研究成果對(duì)湖南省邵陽市種植迷迭香的生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義，同時(shí)為該地區(qū)迷迭香生產(chǎn)加工和迷迭香酸提取工業(yè)化提供理論基礎(chǔ)。