不同楊梅品種的耐低溫能力比較

張淑文，梁森苗，朱婷婷，任海英，鄭錫良，戚行江

(浙江省農(nóng)業(yè)科學院 園藝研究所，浙江 杭州310021)

楊梅(MyricarubraSieb.et Zucc)是特色常綠亞熱帶果樹，我國楊梅主要分布在長江流域以南，18°N～33°N，比較適于栽培在年平均氣溫為15～21 ℃的地區(qū)[1]。大多數(shù)來源于熱帶亞熱帶的植物，處于低溫(0～12 ℃)條件時，生長和發(fā)育都會受到不同程度的影響，各個生理過程也會受到干擾。浙江作為楊梅主產(chǎn)區(qū)，2—4月份經(jīng)常遭受低溫陰雨天氣，甚至是0 ℃以下的冰凍天氣，對楊梅授粉和生長極為不利，進而影響產(chǎn)量、品質(zhì)和經(jīng)濟效益。目前，尚無楊梅耐低溫種質(zhì)篩選的報道。本研究以12個楊梅主栽品種為研究對象，通過模擬早春低溫環(huán)境，測定8個耐低溫相關的生理指標，采用主成分分析法對主栽品種的耐低溫能力進行綜合評價，旨在填補楊梅耐低溫種質(zhì)篩選的空白，為栽培生產(chǎn)奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以浙江蘭溪楊梅基地為采集地，選擇長勢良好、8～10年生健康植株進行取樣。12個主栽品種資源分別為紫晶、早鮮、早色、遲色、荸薺種、水晶種、深紅種、瑞光、早佳、木葉梅、東魁和早大梅，其果色、熟期和采集地等基本信息如表1所示。于2019年2月(最低氣溫3 ℃，楊梅處于休眠期)采集長度10 cm和粗度一致(莖粗周長2.5 cm)的1年生枝條，低溫4 ℃保存，再在0 ℃低溫處理24 h后作為實驗材料。

表1 不同楊梅品種介紹Table 1 Introduction of different Chinese bayberry varieties

1.2 指標測定

將采集的12個品種整理編號，0 ℃低溫處理24 h后，測定枝條的丙二醛(malondialdehyde， MDA)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase， SOD)活性、過氧化物酶(peroxidase， POD)活性(以上指標采用上海索橋生物科技有限公司試劑盒測定)和過氧化氫酶(catalase， CAT)活性(采用南京建成生物研究所試劑盒測定)。采用蒽酮法測定枝條的可溶性總糖(soluble sugars， SS)含量[2]，采用考馬斯亮藍比色法測定可溶性蛋白(soluble proteins， SP)含量[2]，采用茚三酮比色法測定脯氨酸(proline， Pro)含量[3]。同時選取低溫處理后的枝條，避開芽眼剪成3～5 mm的薄片，混合均勻后稱取2 g，分別置于15 mL去離子水的刻度試管中，蓋上玻璃塞置于室溫下浸泡處理12 h，用電導儀測定浸提液電導率(R1)；然后沸水浴加熱30 min，冷卻至室溫后搖勻，再次測定浸提液電導率(R2)。計算相對電導率(relatively electrical conductivity， REC)，RREC(%) =R1/R2×100。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本試驗使用標準化法對測定的數(shù)據(jù)進行無量綱化，利用軟件SPSS 22對標準化的數(shù)據(jù)進行聚類分析和主成分分析，得到品種的聚類分析結果和主成分分值Fjn，采用綜合得分公式：綜合分值F綜=∑Fjn×Ej。F綜為因子分析法得到的各樣品耐低溫性的綜合分值，F(xiàn)jn為第n個樣品第j個特征值>1的公因子的分值，Ej為第j個公因子的方差貢獻率[4]。

采用Excel對全部指標的3次重復進行均值和標準差的計算。

2 結果與分析

2.1 不同楊梅品種的SS、SP和Pro含量比較

植物體內(nèi)SS、SP和Pro含量與其抗逆生理密切相關，在植物受到逆境脅迫時，這些物質(zhì)可作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和防脫水劑[5]，提高細胞內(nèi)滲透物濃度而降低水勢，使細胞保持膨壓[6]，即植物耐逆性越強，體內(nèi)SS、SP和Pro含量越高[7-8]。在本試驗中，低溫處理后不同楊梅品種SS含量為23.068～41.236 mg·g-1，其中荸薺種SS含量最高，遲色含量最低；12個品種的SS含量大小為荸薺種>早鮮>紫晶>早佳>木葉梅>早色>瑞光>早大梅>深紅種>東魁>水晶種>遲色。不同品種的SP含量集中在2.632～3.266 mg·g-1，其中深紅種的SP含量最高，12個品種的SP含量大小為深紅種>木葉梅>早大梅>水晶種>紫晶>早鮮>東魁>遲色>早佳>早色>瑞光>荸薺種。不同品種的Pro含量為96.055～235.026 μg·g-1，其中木葉梅的Pro含量最高，12個品種的Pro含量大小為木葉梅>早鮮>瑞光>東魁>早佳>遲色>紫晶>深紅種>水晶種>早大梅>遲色>荸薺種(表2)。

2.2 不同楊梅品種的REC和MDA含量比較

REC可直觀地反映植物細胞在抗逆環(huán)境中受損傷的程度；MDA作為植物膜脂過氧化產(chǎn)物，可反映細胞膜受損程度和植物耐低溫能力[9]。如表2所示，低溫處理后，不同楊梅品種的REC為29.834%～41.421%，其中，遲色的REC最小，12個品種的相對電導率大小為水晶種>早色>早佳>木葉梅>早鮮>荸薺種>早大梅>紫晶>瑞光>東魁>深紅種>遲色。12個楊梅品種的MDA含量為17.255～33.835 nmol·g-1，其中，荸薺種的MDA含量最高，12個品種的MDA含量大小為荸薺種>紫晶>早鮮>深紅種>瑞光>遲色>早大梅>水晶種>木葉梅>東魁>早佳>早色。

2.3 不同楊梅品種的POD、SOD和CAT活性比較

當植物受到低溫脅迫時，活性氧含量大幅增多，會破壞細胞膜和蛋白質(zhì)，對植物造成傷害，此時植物會通過保護酶系統(tǒng)(SOD、POD和CAT)來清除活性氧，使細胞膜不被過氧化[10]。在本研究中，低溫處理后不同楊梅品種的POD活性為2.012～6.368 U·g-1，深紅種的酶活性最高，12個品種的POD活性大小為深紅種>早色>東魁>水晶種>遲色>早鮮>早大梅>紫晶>荸薺種>早佳>木葉梅>瑞光；不同楊梅品種的SOD活性為3 528.572～9 457.182 U·g-1，早大梅的 SOD活性最高，12個楊梅品種的SOD活性大小為早大梅>水晶種>早佳>木葉梅>早鮮>紫晶>荸薺種>遲色>瑞光>深紅種>遲色>東魁；12個楊梅品種的CAT活性為5.067～19.398 U·g-1，深紅種CAT活性最高，12個品種的CAT活性大小為深紅種>荸薺種>木葉梅>早色>東魁>水晶種>遲色>紫晶>早鮮>早佳>瑞光>早大梅(表2)。

表2 低溫脅迫下不同楊梅品種間生理指標的比較Table 2 Comparison of physiological indexes among different varieties of Chinese bayberry under cold stress

2.4 不同楊梅品種耐低溫能力的綜合評價

采用標準化數(shù)據(jù)和SPSS 22軟件降維模塊的因子分析功能，對12種楊梅品種的8個耐低溫性狀進行主成分分析，提取到4個主成分(表3)，累積貢獻率為85.558%，主成分特征值分布在1.117～2.589。同時計算出4個主成分的因子載荷矩陣(表4)，第1主成分的方差貢獻率為32.365%，具有較大載荷值的性狀為SS含量。第2主成分的方差貢獻率為21.403%，REC具有較大的載荷值。第3主成分的方差貢獻率為17.832%，具有較大載荷值的性狀是MDA含量和CAT活性。第4主成分的方差貢獻率為13.958%，具有較大載荷值的性狀是SP含量。

表3 楊梅耐低溫評價因子的特征值和方差貢獻率Table 3 Eigenvalue and contribution rate of low temperature resistant factors

表4 主成分在不同性狀上的因子載荷矩陣Table 4 Rotated component matrix of the principle component analysis

以4個主成分和每個主成分對應的特征值占總特征值的比例為權重，計算主成分綜合模型：F綜=0.324F1+0.214F2+0.178F3+0.140F4。12個品種的綜合得分如表5所示，得分高低為荸薺種>早鮮>紫晶>木葉梅>水晶種>早大梅>早佳>早色>深紅種>瑞光>東魁>遲色。

表5 不同楊梅品種耐低溫性的綜合評價Table 5 Evaluation of different bayberry varieties under cold stress

2.5 不同楊梅品種耐低溫性狀的聚類分析

采用SPSS 22對12個楊梅品種的耐低溫性狀進行聚類分析，結果如圖1所示。12個品種根據(jù)耐低溫能力強弱和耐低溫性狀所占比重可以分為5組：第1組為東魁和遲色，耐低溫能力最弱；第2組為木葉梅、早佳、紫晶、早鮮和瑞光，耐低溫能力較強且耐低溫性狀和機制較一致；第3組為水晶種、早色和早大梅，耐低溫能力較弱，易發(fā)生凍害；第4組為荸薺種，單獨為一類，耐低溫能力最強，適應范圍較廣；第5組為深紅種，也是單獨一類，在耐低溫性狀綜合評價中排名第9，耐低溫機制較特殊，POD和CAT活性較高。

圖1 不同楊梅品種耐低溫綜合指標聚類分析Fig.1 Dendrogram of comprehensive index of cold resistance of different Chinese bayberry varieties

3 討論

低溫脅迫可誘導植物體內(nèi)積累更多游離的SS、SP和Pro等物質(zhì)，這些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累可減輕滲透脅迫，降低冰點，增強保水能力，防止膜脂和蛋白質(zhì)的過氧化作用等[11]。在主成分分析中，第1主成分中的SS具有較高的載荷值，表明SS在綜合評價時起到了最為重要的作用；在對SS進行比較時發(fā)現(xiàn)，12個不同品種的SS含量順序與綜合評價的結果較一致，荸薺種最高，早鮮次之；說明在楊梅的耐低溫研究中，SS含量可以最直接地表示其耐低溫能力，這與核桃[12]和石榴[13]中的研究結果相同。植物低溫脅迫下體內(nèi)會積累Pro，Pro是植物蛋白質(zhì)的組成成分之一，并以游離狀態(tài)存在于植物體內(nèi)，是逆境下細胞質(zhì)的滲透調(diào)節(jié)物之一，在穩(wěn)定生物大分子、解毒、增強膜中蛋白質(zhì)分子間的水合力、調(diào)節(jié)滲透壓與保護原生質(zhì)膜等方面具有重要作用[14]。在耐低溫性研究中關于SP、Pro與低溫脅迫的關系有2種觀點，其一是支持低溫導致植物細胞中該物質(zhì)含量變化趨勢是逐漸增加的，即與植物的耐低溫性成正相關；其二是認為該物質(zhì)含量在低溫抗冷過程中并不會發(fā)生改變，或者與抗冷性的增強并不存在因果關系[15]。本研究中Pro在12個不同品種間的含量順序與綜合評價結果有差異，所以在楊梅中關于Pro與耐低溫能力的關系符合第2種觀點，當然這一結論仍需進一步討論。在第4主成分中SP具有較高的載荷值，說明SP在耐低溫能力評價中起到重要作用，而且在不同品種間SP含量的比較中發(fā)現(xiàn)，其含量順序與綜合評價順序大體一致，表明楊梅的SP含量與耐低溫性成正相關，符合第1種觀點，這也與果蔗[16]和花生[17]中的研究結果相同。

植物在受到逆境脅迫時，細胞膜的結構和功能首先受到傷害，導致膜透性增加，內(nèi)容物外滲。若將受低溫傷害的組織浸入去離子水中，其外滲液中電解質(zhì)的含量比正常組織外滲液高，組織受傷害越嚴重，電解質(zhì)含量增加越多[18]。低溫脅迫會促進胞內(nèi)活性氧(ROS)的產(chǎn)生，過多的ROS易誘發(fā)膜脂過氧化，進而導致膜脂過氧化產(chǎn)物MDA的大量積累，通?？衫肕DA含量的高低來反映膜脂過氧化的水平和細胞膜受損的程度，以及植物抵御逆境能力的強弱[19]。本試驗中，在第2主成分中REC和第3主成分中MDA均具有較大的載荷值，表明在此次基于系列耐低溫指標的楊梅耐低溫能力綜合評價中，REC和MDA起到重要作用。在對REC的比較中發(fā)現(xiàn)，水晶種的REC最大，說明0 ℃低溫處理24 h后，水晶種的膜系統(tǒng)最為敏感，而從表2可以看出該品種的POD、SOD和CAT活性較高，最終綜合評價的結果中水晶種排名第5位，為較耐低溫的品種，推測這可能與其具有較強大的細胞保護酶系統(tǒng)有關，使其能夠快速做出冷激反應，并較好地適應低溫環(huán)境。通過比較MDA含量發(fā)現(xiàn)，荸薺種的MDA含量最高，該品種在本研究中是最耐低溫的種質(zhì)，與前人研究的MDA與耐低溫能力呈負相關這一結論有矛盾[20]，筆者認為這可能與MDA含量的變化會隨著低溫脅迫時間的變化呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢有關[21]，這可能是荸薺種單獨聚為一類的主要原因，這一推測還需進一步驗證。

植物細胞膜應對低溫脅迫的保護酶系統(tǒng)主要包括POD、SOD和CAT等酶類。POD和CAT是清除活性氧的主要保護酶，低溫脅迫期間CAT可分解植物體內(nèi)的過氧化氫，POD可降解過氧化氫，解除細胞內(nèi)有害自由基。通過POD和CAT的協(xié)同作用，使自由基維持在一個低水平，從而防止自由基傷害；SOD可以與超氧化物陰離子自由基反應，阻止氧化的發(fā)生[22-23]。在主成分分析中，第3主成分的CAT活性具有較大的載荷值，表明CAT活性與楊梅耐低溫能力關系密切。12個品種中深紅種、荸薺種和木葉梅具有較高的CAT活性，其中深紅種的CAT活性最高；此外，深紅種的POD活性也是最高，說明深紅種具有較強的POD和CAT保護酶的協(xié)同作用，能夠及時清除細胞中的活性氧，使自由基降低到安全水平，推測深紅種具備較為獨特的耐低溫機制。通過比較SOD活性發(fā)現(xiàn)，早大梅、水晶種和早佳具有較高的SOD活性，與最終的綜合評價結果中三者的得分順序也較為一致。

在果樹生產(chǎn)中，低溫傷害是主要的自然災害，特別是對早花果樹，常因遭受早春寒潮襲擊而影響果實生產(chǎn)。果樹一般為多年生，一旦受害將比其他作物產(chǎn)生的后果更為嚴重。在本研究中，通過8個耐低溫性狀的綜合評價和聚類分析發(fā)現(xiàn)，荸薺種單獨聚為一類，且耐低溫能力最強；早鮮、紫晶和木葉梅聚為一類，也具備較強的耐低溫能力；深紅種由于其獨特的耐低溫機制也單獨聚為一類；遲色和東魁聚為一類，為最不耐低溫的品種，在冬季或初春低溫時需做好防寒措施。