黃芩乙醇提取物對(duì)獼猴桃潰瘍病致病菌抑菌機(jī)理研究

裴滬榮　盧明秀　龍力　龍章富

摘要：【目的】探究黃芩乙醇提取物（Ethanol extract of Scutellaria baicalensis，ESB）對(duì)獼猴桃潰瘍病病原菌丁香假單胞菌獼猴桃致病變種（Pseudomonas syringae pv. actinidiae， Psa）的抑菌機(jī)理，為開(kāi)發(fā)新型植物源殺菌劑提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳訮sa為研究對(duì)象，采用瓊脂打孔法評(píng)估Psa對(duì)ESB的敏感性;通過(guò)梯度稀釋法確定液體培養(yǎng)時(shí)ESB對(duì)Psa的最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）。探究1/4MIC、1/2MIC、3/4MIC和MIC下ESB對(duì)Psa的作用效果。通過(guò)菌液光密度繪制Psa生長(zhǎng)曲線、電導(dǎo)率儀測(cè)定培養(yǎng)液上清電導(dǎo)率、考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)胞外可溶性蛋白含量、堿性磷酸酶（AKP）試劑盒檢測(cè)AKP活性、硫酸亞鐵法測(cè)定菌體對(duì)磷的代謝、氧化還原反應(yīng)測(cè)定呼吸鏈脫氫酶活性、0.3%固體培養(yǎng)基檢測(cè)Psa泳動(dòng)能力;掃描電鏡和透射電鏡觀察Psa在MIC處理下的形態(tài)變化。【結(jié)果】5種ESB濃度作用下的抑菌圈直徑均在16.00 mm以上，MIC和MBC均為2.4 mg/mL。ESB能抑制Psa生長(zhǎng)，破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，造成電解質(zhì)、蛋白質(zhì)外泄，干擾菌體正常的物質(zhì)和能量代謝;ESB可顯著抑制Psa泳動(dòng)能力，阻礙細(xì)胞的遷移。掃描電鏡和透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，ESB作用后的Psa菌體形態(tài)出現(xiàn)縮短、凹陷、畸形、破裂，細(xì)胞質(zhì)外泄，菌體大量裂解等現(xiàn)象?！窘Y(jié)論】ESB可破壞Psa的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，干擾物質(zhì)和能量代謝，抑制菌體生長(zhǎng)，具有開(kāi)發(fā)成植物源殺菌劑的潛力。

關(guān)鍵詞： 黃芩;乙醇提取物;獼猴桃潰瘍病致病菌;抑菌機(jī)理

中圖分類號(hào)： S436.634.12? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2022）02-0477-09

Primary antibacterial mechanism of ethanol extract of Scutellaria baicalensis against the pathogens of kiwifruit canker

PEI Hu-rong， LU Ming-xiu， LONG Li， LONG Zhang-fu

（College of Life Sciences， Sichuan University， Chengdu? 610064， China）

Abstract：【Objective】To explore the antibacterial mechanism of ethanol extract of Scutellaria baicalensis （ESB） on? the pathogen of kiwifruit canker against Pseudomonas syringae pv. actinidiae （Psa） and to provide a theoretical foundation for the development of new plant-derived fungicides. 【Method】The sensitivity of Psa to ESB was evaluated by the agar punch method. The minimum inhibitory concentration （MIC） and the minimum bactericidal concentration （MBC）were determined by gradient dilution method in liquid medium. The effect of ESB on Psa at 1/4 MIC， 1/2 MIC， 3/4 MIC and MIC was determined. Growth curre was drawn by monitored optical density of the bacterial cullture. Electric conductivity of culture supernatant was measured by conductivity meter. Extracellular soluble protein content was determined by the Coomassie brilliant blue method. Alkaline phosphatase （AKP） activity was measured with an AKP kit.Phosphorus metabolism was detected by the ferrous sulfate method. Respiratory chain dehydrogenase activity was detected by oxidation-reduction reaction. Swimming motility ability was detected in 0.3% solid medium. Scanning electron microscope （SEM） and transmission electron microscope （TEM） were performed to observe Psa morphology at MIC. 【Result】The inhibition zone diameter of ESB against Psa was above 16.00 mm. The MIC and MBC were 2.4 mg/mL. ESB inhibited the growth of Psa， damaged the cell membrane and cell wall which caused the leakage of proteins and electrolytes. Moreover， the ESB interfered with normal material and energy metabolism. ESB can significantly resist the swimming of Psa and hinder cell migration. ESB can significantly resist the swimming of Psa and hinder cell migration. Scanning electron microscopy and transmission electron microscopy showed that morphology of Psa was shortened， depressed， deformed and lysed with ESB， which caused the leak of cytoplasm and bacterial lysis. 【Conclusion】ESB inhibit the normal growth of Psa by destroying the structure of Psa and interfering with substances and energy metabolism. ESB has the potential to be developed as a plant-derived fungicide.

Key words： Scutellaria baicalensis; ethanol extract; Pseudomonas syringae pv. actinidiae; antibacterial mechanism

Foundation items： The National Key Research and Development Program of China（2017YFD0201105）; Sichuan University-Luzhou Strategic Cooperation Project （2020CDLZ-22）

0 引言

【研究意義】自1984年首次報(bào)道獼猴桃潰瘍病至今，獼猴桃潰瘍病已蔓延至全球，給全球獼猴桃產(chǎn)業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失（Wicaksono et al.，2018）。我國(guó)獼猴桃種植面積廣闊，四川等主要獼猴桃種植區(qū)已受到該細(xì)菌性病害影響（王麗等，2017）。如何有效、安全地控制獼猴桃潰瘍病已受到種植者的廣泛關(guān)注。目前控制獼猴桃潰瘍病的方法主要是施用鏈霉素和含銅化合物，該方法易導(dǎo)致耐藥菌產(chǎn)生、環(huán)境污染和藥物殘留等問(wèn)題（Cameron and Sarojini，2014）。植物中含有豐富的天然活性成分，其毒副作用小，不易產(chǎn)生抗藥性，市場(chǎng)前景廣闊（郜玉鋼等，2019;祁高展等，2020;Simonetti et al.，2020）。因此，研發(fā)新型、高效、安全的獼猴桃潰瘍病殺菌劑對(duì)獼猴桃的安全生產(chǎn)具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】丁香假單胞菌獼猴桃致病變種（Pseudomonas syringae pv. actinidiae，Psa）是一種好氧型革蘭氏陰性植物致病細(xì)菌，是造成獼猴桃潰瘍病的主要原因（Ferrante and Scortichini，2015;Wicaksono et al.，2018;He et al.，2019;Sawada and Fujikawa，2019）。Young（2012）提出采用育種的方法選育抗Psa獼猴桃植株。Monchiero等（2015）研究發(fā)現(xiàn)在獼猴桃生長(zhǎng)階段使用含銅化合物能有效預(yù)防獼猴桃潰瘍病。Scortichini（2018）也發(fā)現(xiàn)氯氧化銅和硫酸銅能有效控制Psa。Brunetti等（2020）通過(guò)體外試驗(yàn)和植物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)三乙膦酸鋁和阿拉酸式-S-甲基2種農(nóng)藥能有效抑制Psa生長(zhǎng)，降低獼猴桃潰瘍病的感染率。抗病植株選育費(fèi)時(shí)費(fèi)力，銅類化合物和農(nóng)藥的大量使用會(huì)導(dǎo)致環(huán)境污染和藥物殘留（Colombi et al.，2017）。有關(guān)學(xué)者正在努力尋找更有效、安全的方法控制獼猴桃潰瘍病，如內(nèi)生細(xì)菌（Wicaksono et al.，2018）、天然產(chǎn)物（Lovato et al.，2019）和特異性噬菌體（Slater and Frankel，2020）篩選等。黃芩（Scutellaria baicalensis）作為我國(guó)傳統(tǒng)中藥，其應(yīng)用廣泛。趙寶穎（2012）采用柱層析等方法獲得黃芩乙醇提取物中的21種單一化合物，抗菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)提取物對(duì)水稻紋枯病菌等植物病原菌有明顯的抑制作用。張偉等（2018）研究證實(shí)豬鏈球菌感染的細(xì)胞在黃芩提取物作用下存活率極大提升。Shen等（2018）采用高效液相色譜法獲得黃芩的主要成分黃酮類化合物及其衍生物，包括黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷和漢黃芩素等。Trinh等（2018）、Da等（2019）發(fā)現(xiàn)黃芩中的物質(zhì)能有效抑制黑曲霉、米曲霉、煙曲霉、白色念珠菌、熱帶念珠菌和光滑念珠菌等病原真菌。郭澤宇（2020）、蔣長(zhǎng)軍等（2021）發(fā)現(xiàn)黃芩苷能抑制嗜水氣單胞菌和大腸桿菌生長(zhǎng)及生物膜的形成。姚雪等（2020）采用90%乙醇回流法提取黃芩中的有效成分，分離鑒定出14種黃酮類化合物。Do等（2021）發(fā)現(xiàn)漢黃芩素在體外能顯著抑制米曲霉生長(zhǎng)，500 μg/mL漢黃芩素對(duì)稻瘟病菌的抑制率高達(dá)63%;黃芩素對(duì)青枯菌在內(nèi)的3種植物致病菌的最低抑菌濃度（MIC）為19 μg/mL?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】Psa是造成獼猴桃潰瘍病的主要原因，獼猴桃感染Psa后致死率高，尚無(wú)有效的控制方法，迫切需要開(kāi)發(fā)新型藥物控制Psa。目前，黃芩對(duì)Psa抑制作用的相關(guān)研究鮮見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】測(cè)定黃芩乙醇提取物（Ethanol extract of S. baicalensis，ESB）對(duì)Psa生長(zhǎng)、細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、物質(zhì)代謝、能量代謝、泳動(dòng)能力及細(xì)胞形態(tài)的影響，揭示ESB抗菌機(jī)理，為黃芩活性物質(zhì)的開(kāi)發(fā)利用和新型植物源殺菌劑的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

1. 1. 1 供試植物材料及預(yù)處理 黃芩購(gòu)自成都武侯區(qū)中藥店，采用冷浸法制備黃芩乙醇粗提物（Lin et al.，2016）。黃芩粉碎過(guò)40目篩，按照溶劑∶干粉=10∶1（v/m）的比例加入無(wú)水乙醇室溫浸泡。收集濾液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在45 ℃水浴下進(jìn)行濃縮，獲得浸膏，4 ℃保存待用。

1. 1. 2 供試菌株 Psa由四川大學(xué)生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏，于28 ℃下180 r/min搖床中培養(yǎng)。采用特異性引物Psa_A1 F2和Psa_A1 R1對(duì)致病菌進(jìn)行鑒定（Andersen et al.，2018）。

1. 1. 3 培養(yǎng)基 KB培養(yǎng)基（固體培養(yǎng)基添加15.0 g瓊脂）：蛋白胨20.0 g，甘油10 mL，K₂HPO₄1.5 g，MgSO₄·7H₂O 1.5 g，去離子水1000 mL，自然pH，121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1. 1. 4 主要試劑與儀器設(shè)備 2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）（生工生物工程（上海）股份有限公司）;堿性磷酸酶（AKP）試劑盒（南京建成生物工程研究所）;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋（濟(jì)南來(lái)寶醫(yī)療器械有限公司）;R-1001N旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）;中藥高速粉碎機(jī)（浙江蘭溪市偉能達(dá)電器有限公司）;AHC電子天平（上海友聲衡器有限公司）;LD-B50L型高壓滅菌鍋（合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司）;SW-CJ-2D超凈工作臺(tái)（上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司）;RGX型人工氣候培養(yǎng)箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）;Thermo Multiskan連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）;UV-5500紫外分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）;DDS-11A電導(dǎo)儀（上海佑科儀器儀表有限公司）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 ESB抑菌活性測(cè)定 用二甲基亞砜（DMSO）溶解黃芩粗提物配制100 mg/mL的ESB母液，過(guò)濾除菌備用。Psa活化并培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用生理鹽水調(diào)整菌體濃度為10⁷CFU/mL。瓊脂打孔法測(cè)定50.000、25.000、12.500、6.250和3.125 mg/mL（DMSO稀釋）ESB的抑菌效果，以等量DMSO作對(duì)照。28 ℃培養(yǎng)24 h，十字交叉法測(cè)量抑菌圈大小。

1. 2. 2 最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）測(cè)定 參考Yang等（2005）采用梯度稀釋法測(cè)定ESB的MIC和MBC。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Psa菌液，液體KB培養(yǎng)基調(diào)整菌體濃度為107 CFU/mL，加入ESB使藥物終濃度分別為0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2、3.6和4.0 mg/mL，另設(shè)對(duì)應(yīng)體積的加藥培養(yǎng)基（不加Psa）作為空白對(duì)照，DMSO為陰性對(duì)照。28 ℃培養(yǎng)24 h，使用酶標(biāo)儀測(cè)定600 nm波長(zhǎng)處的吸光值。試驗(yàn)組與空白組吸光度無(wú)明顯差異的濃度定義為MIC（Lovato et al.，2019）。吸取100 μL上述培養(yǎng)液涂布，28 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落形成情況。將不長(zhǎng)菌落的平板所對(duì)應(yīng)的濃度定義為MBC（Lovato et al.，2019）。

1. 2. 3 細(xì)菌抑菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定 將Psa培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，液體KB培養(yǎng)基調(diào)整菌體濃度為107 CFU/mL。向含菌KB培養(yǎng)基中加入ESB使其終濃度分別為1/4MIC、1/2MIC、3/4MIC和MIC，DMSO為空白對(duì)照，28 ℃下180 r/min培養(yǎng)。每隔2 h時(shí)取樣，測(cè)定600 nm波長(zhǎng)處的吸光值。

1. 2. 4 電導(dǎo)率測(cè)定 菌體處理方法同1.2.3。分別在培養(yǎng)0、2、4、6、8、10和12 h時(shí)取樣，4000 r/min離心5 min，棄沉淀，測(cè)定上清液電導(dǎo)率。

1. 2. 5 蛋白質(zhì)泄漏測(cè)定 菌體處理方法同1.2.3。分別在培養(yǎng)0、3、6、9、12和15 h時(shí)取樣，4000 r/min離心5 min，取上清，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定可溶性蛋白含量。

1. 2. 6 堿性磷酸酶（AKP）測(cè)定 菌體處理方法同1.2.3。分別在培養(yǎng)0、1、2、4、6、8和10 h取樣，4 ℃下4000 r/min離心5 min，取上清，按照堿性磷酸酶試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定AKP含量。

1. 2. 7 磷吸收率測(cè)定 以硫酸亞鐵法測(cè)定菌液中磷的含量（陳寧，2016）。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液0.5 mL與0.5 mL（1 mg/mL）葡萄糖溶液和0.2 mL磷標(biāo)準(zhǔn)液混合。加藥量和培養(yǎng)方式同1.2.3。分別在培養(yǎng)0、1、2、4、6、8、10和12 h時(shí)取0.1 mL菌液，加入1 mL三氯化鐵與硫酸亞鐵的混合液，靜置10 min。4000 r/min離心5 min，取0.2 mL上清液，加入50 μL鉬酸銨溶液，30 ℃水浴15 min，冷卻后測(cè)定630 nm波長(zhǎng)處的吸光值。

1. 2. 8 泳動(dòng)能力試驗(yàn) 參考Lovato等（2019）的方法，配制含ESB的液體KB培養(yǎng)基和含ESB的0.3%固體KB培養(yǎng)基，培養(yǎng)基含ESB終濃度均為0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL，等量的水和DMSO分別作為陰性對(duì)照和空白對(duì)照。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（10⁷CFU/mL）的菌液在不同處理的液體培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)24 h后，分別吸取2 μL培養(yǎng)液滴加至相應(yīng)的固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h后使用游標(biāo)卡尺測(cè)量并記錄菌落在固體培養(yǎng)基上形成的直徑。

1. 2. 9 呼吸鏈脫氫酶測(cè)定 參照陶文卿（2012）的方法稍作改動(dòng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（10⁷CFU/mL）的菌液3 mL，加入1 mg/mL的TTC溶液2 mL搖勻，加ESB處理同1.2.3，28 ℃靜置培養(yǎng)2 h。滴加2滴濃H2SO4終止反應(yīng)，加入5 mL甲苯振蕩萃取產(chǎn)物，靜置分層后取上層有機(jī)相4000 r/min離心5 min，以甲苯為空白對(duì)照測(cè)量490 nm波長(zhǎng)處的吸光值。

1. 2. 10 掃描電鏡（SEM）和透射電鏡（TSM）觀察

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（10⁷CFU/mL）的菌液，加入ESB使終濃度為MIC，等量DMSO為空白對(duì)照，搖床培養(yǎng)4 h。5000 r/min離心10 min，棄上清液，收集菌體，用pH 7.2的磷酸緩沖液洗滌3次，3%戊二醛固定。樣本送成都里來(lái)生物科技有限公司進(jìn)行電鏡觀察。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

本研究所涉及的試驗(yàn)均重復(fù)3次。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0和Origin 9.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和圖表制作。計(jì)量資料采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間顯著性分析采用單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 菌種鑒定

利用特異性引物Psa_A1 F2（5'-GCCTCGATGT CGGCGC-3'）和Psa_A1R1（5'-ATTCGATAGAAGAA CTTCTTTGCGTTT-3'）對(duì)供試菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。特異性引物Psa_A1 F2和Psa_A1 R1只能以Psa3為模板擴(kuò)增出132 bp的條帶，其他致病變種無(wú)法擴(kuò)增（Andersen et al.，2018）。結(jié)果獲得132 bp的特異性條帶，說(shuō)明供試菌株為Psa（圖1）。

2. 2 抑菌圈、MIC、MBC和生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果

由表1可知，5種ESB濃度下Psa產(chǎn)生的抑菌圈直徑均超過(guò)16.00 mm，與對(duì)照差異顯著（P<0.05，下同），表明Psa對(duì)ESB敏感且具有濃度依賴性。梯度稀釋、吸光度測(cè)定和平板涂布確定MIC和MBC均為2.4 mg/mL（表2）。ESB對(duì)Psa生長(zhǎng)曲線的研究發(fā)現(xiàn)（圖2），前4 h內(nèi)試驗(yàn)組與對(duì)照組間無(wú)顯著差異（P>0.05，下同），6 h后試驗(yàn)組菌體生長(zhǎng)速度顯著降低。表明ESB有抑制Psa生長(zhǎng)的效果，抑制效果在一定范圍內(nèi)與濃度呈正相關(guān)。

2. 3 電導(dǎo)率測(cè)定結(jié)果

如圖3所示，0 h時(shí)測(cè)定電導(dǎo)率發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組的電導(dǎo)率均高于對(duì)照組，說(shuō)明ESB能在短時(shí)間內(nèi)影響細(xì)胞膜的通透性;對(duì)照組電導(dǎo)率前期平穩(wěn)，后期呈上升趨勢(shì)，可能與菌體的正常裂解、死亡相關(guān);除1/4MIC試驗(yàn)組外，其他試驗(yàn)組的電導(dǎo)率均在短時(shí)間內(nèi)迅速增加，極顯著高于對(duì)照組（P<0.01，下同）。表明ESB影響Psa細(xì)胞壁的完整性且能改變細(xì)胞膜的通透性。

2. 4 可溶性蛋白測(cè)定結(jié)果

如圖4所示，ESB處理Psa 3 h內(nèi)，對(duì)照組培養(yǎng)液中的蛋白含量基本沒(méi)有變化，而試驗(yàn)組蛋白含量均高于50 μg/mL，是對(duì)照組的9.00倍以上，最高達(dá)11.50倍;3～12 h試驗(yàn)組培養(yǎng)液中的蛋白含量均極顯著高于對(duì)照組。表明ESB能迅速破壞Psa細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，造成蛋白質(zhì)泄漏，破壞程度在一定范圍內(nèi)與ESB濃度呈正相關(guān)。

2. 5 AKP測(cè)定結(jié)果

通過(guò)AKP試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)（圖5），對(duì)照組的AKP活性基本未發(fā)生變化，試驗(yàn)組均呈前期上升后期穩(wěn)定的趨勢(shì);比較8 h時(shí)AKP活性，試驗(yàn)組1/4MIC、1/2MIC、3/4MIC和MIC處理的AKP活性分別是對(duì)照組的7.57、14.43、20.57和27.43倍，達(dá)極顯著差異水平。從AKP活性變化可推斷，ESB能在短時(shí)間內(nèi)破壞菌體的細(xì)胞壁，菌體細(xì)胞壁的破壞程度與ESB濃度呈正比。

2. 6 磷代謝測(cè)定結(jié)果

磷是生物生長(zhǎng)必需元素之一。如圖6所示，試驗(yàn)組的初始吸光度均高于對(duì)照組，可能是ESB中色素等物質(zhì)干擾了吸光度的測(cè)定;分析1～10 h吸光度曲線發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組1/4MIC、1/2MIC、3/4MIC和MIC處理的吸光度變化值（1 h與10 h吸光度差值）分別為0.001600、0.00860、0.02833和0.03500，對(duì)照組為0.07467，試驗(yàn)組與對(duì)照組間均達(dá)極顯著差異;分析1～10 h磷代謝曲線斜率，對(duì)照組的磷代謝速率明顯高于試驗(yàn)組。推斷ESB能干擾Psa的磷代謝，影響Psa正常代謝和生長(zhǎng)。

2. 7 呼吸鏈脫氫酶測(cè)定結(jié)果

呼吸鏈?zhǔn)羌?xì)胞能量的主要來(lái)源，對(duì)生物生存至關(guān)重要。如圖7所示，對(duì)照組在490 nm波長(zhǎng)處的吸光度為0.1650±0.0035，加入ESB后Psa在490 nm處的吸光度極顯著下降，隨著ESB濃度的增加，吸光度分別下降至0.0950±0.0026、0.0660±0.0015、0.0350±0.006和0.0327±0.0050，與對(duì)照組相比分別下降42.31%、59.72%、78.74%和80.16%。表明ESB可影響Psa呼吸鏈脫氫酶活性。

2. 8 泳動(dòng)能力試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果顯示，培養(yǎng)基含ESB濃度超過(guò)0.4 mg/mL后即無(wú)菌落形成。從圖8和表3可知，以固體培養(yǎng)基培養(yǎng)Psa時(shí)，0.2 mg/mL ESB能極大地抑制Psa的泳動(dòng)能力（4組、5組與3組比較），與DMSO組相比抑制率超過(guò)30%（4組與3組比較），最高可達(dá)49.7%（5組與3組比較）;同為0.2 mg/mL ESB作用下，Psa在液體培養(yǎng)時(shí)受到ESB處理后會(huì)顯著影響Psa在固體培養(yǎng)基上的泳動(dòng)能力（5組與4組比較）。比較1組與2、3組結(jié)果可發(fā)現(xiàn)DMSO處理會(huì)造成Psa泳動(dòng)能力受到影響。通過(guò)對(duì)Psa在不同情況下泳動(dòng)能力的分析可知，ESB可顯著抑制Psa泳動(dòng)能力，阻礙細(xì)菌的遷移。

2. 9 病原菌細(xì)胞形態(tài)觀察

掃描電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組的Psa細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，表面較光滑，無(wú)明顯破損，表明DMSO對(duì)Psa形態(tài)影響較?。▓D9-A）;Psa在ESB MIC處理4 h后，細(xì)胞形態(tài)受到嚴(yán)重破壞，出現(xiàn)縮短、凹陷、畸形和破裂（圖9-B）。透射電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，DMSO處理后的Psa菌體形態(tài)發(fā)生變化，出現(xiàn)輕微的凹陷和皺縮，部分區(qū)域出現(xiàn)空洞，但形態(tài)結(jié)構(gòu)相對(duì)完整（圖10-A和圖10-B）;ESB MIC處理4 h后，Psa細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，內(nèi)容物流失嚴(yán)重，胞質(zhì)密度下降，出現(xiàn)大面積的裂解（圖10-C～圖10-F）。表明ESB影響Psa細(xì)胞結(jié)構(gòu)，造成細(xì)胞表面受損，內(nèi)容物外泄，抑制Psa生長(zhǎng)。

3 討論

通過(guò)抑菌圈、MIC和MBC測(cè)定可知ESB能顯著抑制Psa生長(zhǎng)，抑制效果與濃度呈正相關(guān)。部分抑（殺）菌劑作用于細(xì)菌菌體后，能改變細(xì)胞膜通透性，造成細(xì)胞能量代謝失衡、生理活動(dòng)受阻（Cox et al.，2001）。因此，培養(yǎng)液電導(dǎo)率的變化可反映細(xì)胞膜通透性的改變（Li et al.，2014）。本研究結(jié)果顯示，ESB作用下Psa的胞內(nèi)物質(zhì)大量外泄，培養(yǎng)液電導(dǎo)率出現(xiàn)明顯變化。本研究培養(yǎng)液中可溶性蛋白含量的測(cè)定結(jié)果與電導(dǎo)率的變化趨勢(shì)基本一致，ESB處理后培養(yǎng)液中可溶性蛋白含量顯著增加。蛋白質(zhì)在細(xì)胞中發(fā)揮著重要的生理功能，蛋白含量的降低會(huì)影響細(xì)胞正常的生理功能（Yin et al.，2020）。同時(shí)，蛋白質(zhì)的泄漏也是細(xì)胞膜完整性被破壞的標(biāo)志之一（Bajpai et al.，2013）。AKP是一種磷酸水解酶，存在于細(xì)胞間質(zhì)中，只有細(xì)胞壁遭到破壞后通透性增加，才能在胞外檢測(cè)到AKP活性。胞外AKP活性可間接反映細(xì)胞壁的通透性變化（劉雪等，2019）。從AKP活性變化可知，ESB處理后Psa細(xì)胞壁通透性增加，細(xì)胞壁完整性被破壞。

磷參與生物多種化合物的形成，細(xì)菌代謝活動(dòng)中磷的消耗可反映細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和代謝情況。從磷消耗曲線可知，試驗(yàn)組的磷消耗量顯著低于對(duì)照組。分析磷消耗曲線的斜率也可得出相似的結(jié)論，對(duì)照組磷的消耗速率遠(yuǎn)高于試驗(yàn)組。TTC是一種小分子無(wú)色物質(zhì)，能透過(guò)細(xì)胞膜，在呼吸鏈脫氫酶作用下被還原成紅色的三苯甲酰（TF），該物質(zhì)在490 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰（Richter et al.，2007），490 nm波長(zhǎng)處的吸光值可反應(yīng)呼吸鏈脫氫酶活性。本研究4個(gè)濃度處理下的Psa呼吸鏈脫氫酶活性與對(duì)照組相比分別下降42.31%、59.72%、78.74%和80.16%，說(shuō)明ESB能抑制呼吸鏈脫氫酶活性，干擾細(xì)胞正常的能量代謝，影響細(xì)胞生長(zhǎng)。細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性對(duì)于細(xì)胞膜的形成是必須的（Dressaire et al.，2015），泳動(dòng)能力的降低會(huì)抑制細(xì)胞膜的形成（Miao et al. 2021）。Miao等（2021）研究了黃芩苷作用下的銅綠假單胞菌的泳動(dòng)能力，證明銅綠假單胞菌細(xì)胞膜的形成受到抑制。本研究中，當(dāng)ESB濃度超過(guò)0.4 mg/mL時(shí)，0.3%固體培養(yǎng)基上無(wú)Psa生長(zhǎng)，說(shuō)明ESB能明顯降低Psa的泳動(dòng)能力，抑制Psa細(xì)胞膜形成。掃描電鏡和透射電鏡結(jié)果說(shuō)明ESB作用下的Psa細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到破壞，正常的生長(zhǎng)活動(dòng)受到影響。

天然化合物成分豐富，不會(huì)造成環(huán)境污染和藥物殘留，是替代抗生素和銅類化合物的方法之一（Cameron and Sarojini，2014）。黃芩作為我國(guó)傳統(tǒng)的中藥，主要成分是黃芩苷和黃芩素等黃酮類化合物及其衍生物（Shen et al.，2018），具有抗菌、抗炎癥等作用（Trinh et al.，2018;Da et al.，2019）。目前關(guān)于黃芩中有效成分抗菌試驗(yàn)已有研究報(bào)道（郭澤宇，2020;蔣長(zhǎng)軍等，2021;Do et al.，2021），但黃芩對(duì)Psa的抑制作用尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究以黃芩為基礎(chǔ)，探究了ESB在細(xì)胞結(jié)構(gòu)、物質(zhì)和能量代謝等方面對(duì)Psa的影響，有關(guān)黃芩抑殺Psa的有效成分還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

ESB可破壞Psa的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，干擾物質(zhì)和能量代謝，抑制菌體生長(zhǎng)，具有開(kāi)發(fā)成植物源殺菌劑的潛力。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）