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    UV-B輻射和施氮對滿江紅生長、礦質(zhì)營養(yǎng)和抗氧化生理的影響

    2022-05-25 05:23:04楊競張光群李明銳湛方棟李元祖艷群何永美
    關(guān)鍵詞:滿江紅類黃酮總酚

    楊競,張光群,李明銳,湛方棟,李元,祖艷群,何永美

    (云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院,昆明 650201)

    臭氧衰減導(dǎo)致的地表UV-B 輻射(280~315 nm)增強(qiáng)是當(dāng)今重大的全球氣候變化問題之一[1]。UV-B輻射作為重要的環(huán)境因子之一,會(huì)誘導(dǎo)植物產(chǎn)生大量活性氧自由基(ROS),顯著降低植物葉片光合色素含量、改變植株礦質(zhì)營養(yǎng)含量、抑制抗氧化酶活性、阻礙抗氧化物質(zhì)合成、導(dǎo)致植株生物量下降[2]。在一定范圍內(nèi),植物啟動(dòng)自身的防御機(jī)制,通過提高超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、谷胱甘肽還原酶(GR)等抗氧化酶活性[3]、增加酚類、類黃酮等抗氧化物質(zhì)含量來提高植物抗性[4],以緩解UV-B的損傷[5-6]。氮素是植物生長發(fā)育的主要限制因子,施氮可提高植物抗性,也可改變植物對UV-B 輻射增強(qiáng)的響應(yīng)[7-8]。因此,研究UV-B 輻射和施氮對植物的影響顯得尤為重要,目前的研究主要集中在谷子、白菜、菠菜、藻類[9-10]等,對固氮植物滿江紅的相關(guān)研究報(bào)道較少。

    滿江紅(Azolla imbricata)是蕨藻共生體,其生物量大、固氮量高,作為生物綠肥被廣泛使用[11]。滿江紅體內(nèi)的固氮藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacterium)通過固氮酶將氮?dú)廪D(zhuǎn)化為可被利用的氨,供植物生長發(fā)育,植物固氮酶極易被氧化,其活性直接決定著滿江紅的供氮能力[12-13],顯著影響滿江紅參與稻田氮循環(huán)[14]。云南元陽梯田紫外輻射背景值高,梯田不施加化肥,依靠滿江紅等還田維持稻田氮循環(huán)[15],這為研究UV-B 輻射和氮素復(fù)合作用的影響提供上佳的試驗(yàn)材料。因此,以元陽梯田稻田滿江紅為研究材料,UV-B 輻射和氮素作為影響因素,在項(xiàng)目組前期研究的基礎(chǔ)上,基于元陽梯田的地域特點(diǎn),研究UV-B 輻射和施氮單獨(dú)及復(fù)合作用對滿江紅生長、礦質(zhì)營養(yǎng)和抗氧化生理的影響,為認(rèn)識(shí)元陽梯田滿江紅對UV-B 輻射與氮素養(yǎng)分的生理響應(yīng)特征提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    選取云南元陽梯田水稻生長期(5—6 月)自然漂浮生長的滿江紅植株,帶回試驗(yàn)室用蒸餾水沖洗數(shù)次,去除表面多余泥土和雜質(zhì),備用。

    1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    光源設(shè)置:5.0 kJ·m-2UV-B 輻射強(qiáng)度,采用李元等[16]建立的方法在試驗(yàn)小區(qū)水面垂直距離40 cm處懸掛UV-B 燈管(光譜為280~315 nm),燈管長1.2 m,間距30 cm。自然光對照組只懸掛燈架不供應(yīng)燈管。光源和培養(yǎng)液設(shè)置見表1,其中氮含量0 g·L-1的處理采用無氮霍格蘭營養(yǎng)液[17],氮含量0.06 g·L-1的處理采用30%霍格蘭營養(yǎng)液[18]。

    表1 試驗(yàn)處理Table 1 Experiment settings

    將備用滿江紅隨機(jī)接種至矩形塑料培養(yǎng)盆(31 cm×24 cm×11 cm)中連續(xù)水培18 d,接種量為水面面積的1/10,約3.0 g,每3 d 定量添加100 mL 蒸餾水補(bǔ)充蒸發(fā)量,共4 組處理,每組處理5 個(gè)重復(fù),共20 個(gè)小區(qū)。UV-B輻照時(shí)間為9:30—17:30(光暗周期為8 h∶16 h),大棚培養(yǎng)溫度(24±4)℃,相對濕度50%~70%。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果,在第12 天時(shí),CK 處理滿江紅長滿試驗(yàn)小區(qū)水面,因此,統(tǒng)一將采樣時(shí)間定為第12天。

    1.3 生物量測定及生長系數(shù)計(jì)算

    采用鮮質(zhì)量稱量法,每3 d 取出全萍過40 目篩,用紙吸干表面水分后稱取鮮質(zhì)量,稱完后放回。按照公式(1)計(jì)算生長系數(shù)(K)[19]:

    式中:W0是初始放萍量,g;W是實(shí)際萍體的鮮質(zhì)量,g;t為間隔天數(shù),d。

    1.4 植株礦質(zhì)營養(yǎng)元素測定

    培養(yǎng)12 d 時(shí)取樣,于105 ℃殺青30 min,70 ℃烘干24 h至恒質(zhì)量。采用凱氏定氮法測定總氮含量,鉬銻抗比色法測定全磷含量,火焰原子吸收分光光度法測定總鈣、總鎂含量[20]。

    1.5 光合色素的測定

    取鮮萍2 g 去根洗凈,加入95%乙醇5 mL,冰浴研磨至勻漿,轉(zhuǎn)移至離心管。于轉(zhuǎn)速20 000 r·min-1離心10 min。取上清液在分光光度計(jì)波長665、649 nm 和470 nm 處測定吸光度。參照文獻(xiàn)[20]計(jì)算葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的含量。

    1.6 抗氧化物質(zhì)和酶的測定

    取鮮萍2 g 加入2 mL 的PBS 提取緩沖液[0.04 mol·L-1Na2HPO4,0.06 mol·L-1NaH2PO4,0.1%(V/V)Triton X-100,1 mol·L-1NaCl,10 g·L-1PVPP,pH:7.0],在冰浴中研磨成勻漿。將勻漿移入離心管,另加1 mL的提取緩沖液,清洗研缽后也并入離心管中,混勻后于8 000 r·min-1離心15 min。取上清液置于分光光度計(jì)測定過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽還原酶(GR)、過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸(AsA)吸光度,具體波長和計(jì)算公式參照南京建成生物工程研究所SOD、POD、MDA、CAT 和總抗氧化能力(FRAP 法)測定試劑盒說明書。

    取鮮萍1 g,在冰浴中研磨成勻漿,加入含1%鹽酸的甲醇溶液,提取24 h,取0.5 mL提取液,用蒸餾水定容至25 mL,在紫外分光光度計(jì)280、325 nm 處測定吸光度,計(jì)算總酚含量,在305 nm 處測定吸光度,計(jì)算類黃酮含量[21]。

    1.7 統(tǒng)計(jì)分析

    試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)來表示,用SPSS 12.0 統(tǒng)計(jì)軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行雙因素方差分析和最小顯著差法(LSD)顯著性檢驗(yàn),顯著性水平α=0.05。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 UV-B輻射和施氮對滿江紅生長的影響

    由圖1 可知,以3 g 的初始放萍量記錄連續(xù)水培18 d 的生長系數(shù)的變化。UV-B輻射和N處理導(dǎo)致滿江紅的生長速率在1~18 d 內(nèi)均低于CK,在培養(yǎng)6 d 時(shí)生長系數(shù)最高,9 d 時(shí)和12 d 時(shí)生長速率無顯著差異,18 d 時(shí)生長速率最低。CK 處理的滿江紅平均生長系數(shù)為0.102,UV-B+N、UV-B和N處理的平均生長系數(shù)低于CK 處理,分別為0.085、0.082 和0.080。UV-B+N、UV-B、N處理在各時(shí)期的K值均顯著低于CK處理,UV-B+N、UV-B 和N 處理在各時(shí)期K值無顯著差異。雙因素分析表明,UV-B輻射處理、N處理對滿江紅生長系數(shù)有極顯著影響,且兩者存在交互作用。

    圖1 UV-B輻射和施氮對滿江紅生長系數(shù)(K)的影響Figure 1 Effects of UV-B radiation and nitrogen application on growth coefficient(K)of Azolla

    由圖2 可知,以3 g 的初始放萍量記錄連續(xù)水培18 d的生物量變化。UV-B+N 處理、UV-B 輻射處理、N 處理在培養(yǎng)18 d 時(shí)滿江紅生物量均顯著低于CK,UV-B+N 處理在培養(yǎng)9、12、15、18 d時(shí)生物量下降,降幅分別為10.6%、16.8%、22.6%、34.8%。UV-B 處理在9、12、15、18 d 時(shí)生物量下降,降幅分別為19.8%、26.7%、27.7%、36.1%。N處理在9、12、15、18 d時(shí)生物量下降,降幅分別為19.8%、18.4%、21.3%、30.0%。四組處理均在培養(yǎng)12 d 時(shí)生物量最高。UV-B+N、UVB、N 處理在3~18 d 的生物量均顯著低于CK 處理,UV-B+N、UV-B 和N 處理在各時(shí)期生物量無顯著差異。雙因素分析表明,UV-B輻射處理、N處理對滿江紅生物量有極顯著影響,且兩者存在交互作用。

    圖2 UV-B輻射和施氮對滿江紅生物量的影響Figure 2 Effects of UV-B radiation and nitrogen application on biomass of Azolla

    2.2 UV-B 輻射和施氮對滿江紅礦質(zhì)營養(yǎng)元素含量的影響

    與CK 相比,UV-B+N、UV-B、N 處理均顯著增加了滿江紅N 含量,增幅分別為156.8%、136.1%、33.7%;UV-B+N 處理和N 處理顯著降低滿江紅的P、Mg、Ca 含量,降幅分別為20.8%、38.5%、37.1% 和4.2%、36.0%、37.5%。雙因素分析表明,UV-B、N處理對滿江紅N、Mg、Ca 含量有極顯著影響,且兩者存在交互作用。UV-B 處理對K 含量沒有顯著影響,三組處理均對滿江紅N含量影響顯著,且有交互作用。可知UV-B+N、UV-B 輻射、N 處理均使?jié)M江紅的N 含量增加,Mg、Ca含量減少(表2)。

    表2 UV-B輻射和施氮對滿江紅礦質(zhì)營養(yǎng)元素含量的影響(mg·g-1)Table 2 Effects of UV-B radiation and nitrogen application on the content of nutrients of Azolla(mg·g-1)

    2.3 UV-B輻射和施氮對滿江紅光合色素含量的影響

    與CK 相比,UV-B+N 處理顯著降低了葉綠素a、類胡蘿卜素含量,降幅分別為21.9%、43.6%。UV-B處理顯著降低了葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量,降幅分別為21.1%、37.3%、41.0%。N處理顯著降低了類胡蘿卜素含量,降幅為41.0%。UV-B輻射條件下葉綠素b含量的降幅大于葉綠素a的降幅。雙因素方差分析表明,UV-B 處理、N 處理對葉綠素a 和類胡蘿卜素含量有極顯著影響,且具有交互作用(表3)。

    表3 UV-B輻射和施氮對滿江紅光合色素含量的影響(mg·g-1)Table 3 Effects of UV-B radiation and nitrogen application on photosynthetic pigment content of Azolla(mg·g-1)

    2.4 UV-B輻射和施氮對滿江紅抗氧化物質(zhì)含量的影響

    與CK 相比,UV-B+N 處理顯著增加了總酚的含量,增幅為160.2%。UV-B 輻射使?jié)M江紅總酚和MDA 含量顯著增加86.7%、69.5%,使AsA、類黃酮含量顯著降低16.6%、57.8%。N 處理顯著增加了AsA含量,增幅為14.7%。雙因素方差分析表明,UV-B 處理和N 處理對MDA、AsA、類黃酮含量有顯著影響,且對總酚、類黃酮含量的影響具有交互作用。三組處理均導(dǎo)致MDA含量顯著增加(表4)。

    表4 UV-B輻射和施氮對滿江紅丙二醛與抗氧化物質(zhì)含量的影響Table 4 Effects of UV-B radiation and nitrogen application on MDA and oxidation product content of Azolla

    2.5 UV-B輻射和施氮對滿江紅抗氧化酶的影響

    與CK 相比,UV-B+N、UV-B 輻射、N 處理均顯著增加SOD 活性,增幅為164.7%、189.3%、185.0%。POD 活性顯著降低,降幅分別為8.17%、30.1%、29.4%,使GR 活性顯著增加85.9%、69.5%、53.2%,對CAT 活性無顯著影響。UV-B 輻射處理的總抗氧化能力是CK 的3 倍,N 處理使?jié)M江紅總抗氧化能力顯著提升82.1%。雙因素方差分析表明,UV-B 處理和N 處理對總抗氧化能力和SOD、POD、GR 活性有顯著影響,且具有交互作用(表5)。

    表5 UV-B輻射和施氮對滿江紅抗氧化酶的影響Table 5 Effects of UV-B radiation and nitrogen application on antioxidant enzymes of Azolla

    2.6 相關(guān)性分析

    相關(guān)性分析結(jié)果(表6)顯示,UV-B 輻射和N 處理的滿江紅生物量與類胡蘿卜素、類黃酮含量呈顯著正相關(guān),與總氮、總酚含量呈極顯著負(fù)相關(guān),與MDA含量呈顯著負(fù)相關(guān)。滿江紅總氮含量與AsA 含量呈極顯著負(fù)相關(guān),與類黃酮含量呈顯著負(fù)相關(guān),與MDA、總酚含量呈極顯著正相關(guān)。滿江紅總抗氧化能力與AsA含量呈顯著負(fù)相關(guān),與總酚含量呈極顯著正相關(guān)。

    表6 滿江紅生物量、總氮含量與抗氧化物質(zhì)及光合色素含量的相關(guān)性分析Table 6 Correlation between biomass,total nitrogen,oxidation products and photosynthetic pigment of Azolla

    3 討論

    3.1 滿江紅生長對UV-B輻射響應(yīng)的機(jī)理

    生物量是所有生理、生化和生長因子的長期積累響應(yīng)[2]。UV-B輻射抑制植物的生長發(fā)育及生物量[22]。本研究中,UV-B 輻射(5.0 kJ·m-2)處理使?jié)M江紅的生長速率和生物量都低于對照組,在培養(yǎng)6~12 d 生長速率呈負(fù)增長,生長系數(shù)下降,表明UV-B 輻射縮短了滿江紅的生長周期,這與PRASAD 等[23]的研究結(jié)果一致。N 處理導(dǎo)致滿江紅磷、鉀含量顯著減少,而UV-B 輻射處理與CK 無顯著差異,可能施氮會(huì)對滿江紅磷脂、磷酸合成和滲透壓調(diào)節(jié)過程造成不利影響[24],這與試驗(yàn)中觀察到的滿江紅變黃和葉片萎縮的現(xiàn)象一致。UV-B+N、UV-B、N處理均導(dǎo)致滿江紅鈣、鎂含量顯著減少,這可能是滿江紅的應(yīng)激反應(yīng),不利于滿江紅葉綠素的合成。UV-B+N、UV-B、N 處理均導(dǎo)致氮含量顯著增加,該結(jié)果與大多數(shù)研究不同,滿江紅氮含量與根部吸收作用和生物固氮作用有直接關(guān)系,是由于UV-B 輻射和施氮促進(jìn)了滿江紅的氮吸收或固氮作用,這與滿江紅品種以及施氮量和時(shí)間有關(guān)。根部吸收和生物固氮過程與滿江紅氮代謝過程有關(guān)。

    生長在不同氮濃度條件下的植物葉片光合作用對UV-B 輻射的響應(yīng)程度不同[25],本試驗(yàn)中UV-B、UV-B+N 處理顯著減少滿江紅光合色素含量,N 處理下光合色素含量無顯著變化,葉綠素a/b發(fā)生變化,使葉綠體的膜發(fā)生氧化作用,破壞葉綠體的膜結(jié)構(gòu)[26]。本試驗(yàn)中施氮未能緩解這些損傷,這可能與滿江紅生育期和UV-B 輻射強(qiáng)度有關(guān)。綜上,UV-B 輻射導(dǎo)致滿江紅礦質(zhì)營養(yǎng)元素含量的變化,使?jié)M江紅基礎(chǔ)生理代謝受阻[27],同時(shí)光合作用可能受到抑制,施氮未能緩解UV-B 輻射給植物帶來的損傷,最終導(dǎo)致生物量下降。

    3.2 滿江紅抗氧化代謝對UV-B輻射響應(yīng)的機(jī)理

    UV-B 輻射對滿江紅最重要的影響是誘導(dǎo)其產(chǎn)生過量活性氧(ROS)進(jìn)而損傷質(zhì)膜。同時(shí),UV-B 輻射也會(huì)激活植物體內(nèi)的兩類抗氧化機(jī)制[28]:一種是抗壞血酸(AsA)、類胡蘿卜素、酮類、酚類等抗氧化物質(zhì)的非酶促反應(yīng),另一種是SOD、CAT、POD 和GR 的酶促反應(yīng)。這些抗氧化酶和物質(zhì)相互協(xié)調(diào)、相互作用,以緩解UV-B輻射給植物帶來的損傷[29]。

    MDA 是植物過氧化的最終產(chǎn)物之一,它間接反映了生物膜受損傷程度。本研究發(fā)現(xiàn),與CK 相比,UV-B+N、UV-B、N 處理的MDA 含量均顯著上升,且與生物量呈顯著負(fù)相關(guān),與總氮含量呈極顯著正相關(guān),這與相關(guān)研究結(jié)果[30]一致,滿江紅生物量下降與質(zhì)膜受損程度有關(guān)。本研究中UV-B、UV-B+N 處理導(dǎo)致總酚含量顯著增加,這與大多數(shù)研究相同,是滿江紅抗性的表現(xiàn)。而N 處理導(dǎo)致AsA 含量顯著增加,AsA 與總氮、總抗氧化能力呈顯著負(fù)相關(guān),與生物量無顯著相關(guān)性,AsA 與谷胱甘肽(GSH)、GR 等物質(zhì)協(xié)同作用形成抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán),可以清除ROS,UV-B+N、UV-B、N 處理均導(dǎo)致GR 活性顯著增加,GR 能有效維持AsA-GSH 循環(huán),但這不僅需要GR,還需要GSH 底物合成[31]。AsA-GSH 循環(huán)過程較復(fù)雜,要解釋AsA 在N 處理下的含量增加還需進(jìn)一步對該循環(huán)的其他物質(zhì)和酶進(jìn)行研究。UV-B+N、UV-B、N 處理均顯著減少類黃酮的含量,類黃酮含量與生物量呈顯著正相關(guān),與總氮含量顯著負(fù)相關(guān),這可能是由于UV-B 輻射誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS 超出了滿江紅活性氧清除能力,對滿江紅葉片造成了進(jìn)一步損傷。

    SOD在氧化應(yīng)激防御中起核心作用,其作用是將O2-轉(zhuǎn)化為O2和H2O2,CAT 能催化H2O2,其轉(zhuǎn)化率高,UV-B 輻射對CAT 活性的影響取決于其強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間[32]。與其他類似研究相同[33],UV-B 輻射和施氮均導(dǎo)致滿江紅體內(nèi)SOD、GR 活性提高,SOD 活性的顯著增強(qiáng)可能會(huì)導(dǎo)致滿江紅O2-轉(zhuǎn)化為O2和H2O2的轉(zhuǎn)化率過高,部分H2O2可能會(huì)在體內(nèi)累積。與大多數(shù)研究不同,本研究中UV-B、N 處理的滿江紅POD 活性顯著下降,可能與滿江紅POD 對UV-B 輻射的敏感度有關(guān)[34]。一方面,UV-B 輻射激發(fā)了滿江紅的抗氧化代謝,使總酚含量顯著增加,且施氮增加AsA含量,一定程度提升了滿江紅抗氧化能力。另一方面,SOD活性的提高程度可能超過了POD、CAT 對H2O2的轉(zhuǎn)化率,導(dǎo)致H2O2累積并造成氧化損傷[35],同時(shí)MDA 含量的顯著上升也說明滿江紅受到了氧化損傷。

    綜上,UV-B 輻射引起了滿江紅的氧化應(yīng)激反應(yīng),H2O2、-OH 和O2可能在滿江紅體內(nèi)累積,UV-B+N處理對兩種抗氧化機(jī)制都有所激發(fā),總抗氧化能力顯著提高;UV-B 輻射提高滿江紅抗氧化酶活性;施氮增加AsA 含量,總抗氧化能力顯著增強(qiáng),植物抗性增強(qiáng);UV-B+N、UV-B、N處理可能均導(dǎo)致滿江紅質(zhì)膜不同程度的損傷,而滿江紅抗氧化物質(zhì)的含量增加利于其對生物量的累積,抗氧化酶活性的提高有利于其總抗氧化能力增強(qiáng)。滿江紅總氮含量與MDA 含量顯著正相關(guān),推測滿江紅的氮累積可能是由濃縮效應(yīng)造成的。UV-B 輻射增強(qiáng)和施氮對滿江紅抗氧化機(jī)制的影響較復(fù)雜,還需進(jìn)一步研究。

    4 結(jié)論

    (1)UV-B 輻射和施氮處理均顯著增加滿江紅氮含量,均顯著降低鈣、鎂含量,對鉀含量無顯著影響。UV-B 輻射和UV-B 輻射+施氮處理使葉綠素a 和類胡蘿卜素含量顯著下降。

    (2)UV-B輻射處理使?jié)M江紅MDA、總酚的含量增加,SOD、GR活性提高。施氮處理顯著增加AsA含量,UV-B 輻射、施氮處理均使?jié)M江紅總抗氧化能力顯著提升。

    (3)UV-B 輻射和施氮抑制滿江紅生長速率,降低其生物量,施氮未能緩解因氧化損傷造成的生長速率下降和生物量減少。

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