固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定牛奶中雙酚A、雙酚F和雙酚S

李 星，王 浩，張文超，張 燁，巴冬梅，冉令磊

（國(guó)家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心 北京 100094）

雙酚A（Bisphenol A，BPA）是一種常見(jiàn)的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，是合成聚碳酸酯、環(huán)氧樹(shù)脂、聚砜樹(shù)脂等多種高分子材料的前體物質(zhì)，常用于食品包裝、容器內(nèi)壁涂層及嬰兒奶瓶的生產(chǎn)中[1]。研究表明，雙酚A 對(duì)人和動(dòng)物的內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)有不良影響，甚至?xí)T發(fā)某些癌癥[2-4]。BPA 暴露對(duì)人體健康的影響，已引起多國(guó)關(guān)注。歐盟、日本、加拿大、美國(guó)等對(duì)雙酚A 在食品接觸材料中的含量做出了嚴(yán)格規(guī)定[5]。2011年，我國(guó)衛(wèi)生部公告第15 號(hào)中全面禁止生產(chǎn)、進(jìn)口及銷售含BPA 的嬰幼兒奶瓶，其它食品包裝材料、容器中允許使用BPA，然而BPA 含量要符合相關(guān)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的規(guī)定[6]。雙酚F（BPF）和雙酚S（BPS）作為雙酚A 的結(jié)構(gòu)類似物，具有類似于BPA 的結(jié)構(gòu)和更強(qiáng)的酸性及穩(wěn)定性，為滿足市場(chǎng)需求，被廣泛用于禁止或限制BPA 使用的日常用品的制造，被認(rèn)為是雙酚A 的“安全”替代物。然而，越來(lái)越多的研究表明雙酚S 和雙酚F 也具有與雙酚A 相似的內(nèi)分泌干擾活性[7]，如雷鵬輝等[8]發(fā)現(xiàn)雙酚S 和雙酚F 對(duì)斑馬魚胚胎及幼魚早期發(fā)育有影響，對(duì)水生生物產(chǎn)生氧化壓迫。

雙酚類化合物污染飲用水、環(huán)境，并經(jīng)土壤-植物系統(tǒng)進(jìn)入食物鏈。奶牛食用了受污染的飼料后，牛奶中就可能會(huì)有雙酚A、雙酚F、雙酚S 的殘留；生乳儲(chǔ)存、運(yùn)輸及加工過(guò)程中，可能會(huì)接觸到塑料制品設(shè)備，牛奶及其制品的包裝材料中也可能含有BPF、BPA、BPS，進(jìn)而危害人體健康。牛奶是人們生活中的必需品，我國(guó)目前還沒(méi)有對(duì)雙酚A、雙酚F、雙酚S 的國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法，同時(shí)缺乏對(duì)食品中雙酚A、雙酚F、雙酚S 含量水平和污染情況的全面摸底和評(píng)估。研究牛奶中雙酚A、雙酚F、雙酚S 的檢測(cè)方法具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

目前，國(guó)內(nèi)外測(cè)定雙酚類化合物的方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜法[9]、液相色譜法[10]及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[11]。液相色譜儀的靈敏度不高，在檢測(cè)過(guò)程中容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。氣相色譜-質(zhì)譜法前處理繁瑣，樣品測(cè)定時(shí)間較長(zhǎng)，不適于大量樣品的快速測(cè)定。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有前處理簡(jiǎn)單，抗干擾能力強(qiáng)，靈敏度較高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用。目前，利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定牛奶中BPA 的研究較多，如張建瑩等[12]通過(guò)優(yōu)化牛奶中雙酚A 的提取純化和測(cè)定條件，建立牛奶中雙酚A 的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。然而，有關(guān)同時(shí)測(cè)定牛奶中雙酚A、雙酚F 和雙酚S 含量的方法未見(jiàn)報(bào)道。本文采用氨水乙腈超聲提取并去除蛋白，通過(guò)RiME HLB 固相萃取柱除去脂肪，氮吹富集，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛奶，北京美廉美超市。

雙酚A、雙酚F、雙酚S、雙酚A-D4、雙酚F-13C6和雙酚S-13C12（純度≥99%），TRC 公司；乙腈、甲醇、氨水均為HPLC 級(jí)；Milli-Q 超純水系統(tǒng)，上海摩速科學(xué)儀器有限公司；Oasis PRiME HLB 固相萃取柱（200 mg/6cc），美國(guó)Waters 公司；分析天平（XSE105），賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

Agilent 6470 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)：配有電噴霧離子源ESI 及Agilent1290Ⅱ型液相色譜儀，安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；DL-120J 型超聲波清洗儀，上海之信儀器有限公司；Multi real振蕩器，廈門科睿特儀器有限公司；ucg-24c 圓形水浴氮吹儀，北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

標(biāo)準(zhǔn)和同位素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液 （1 mg/mL）：雙酚A、雙酚F、雙酚S、雙酚A-D4、雙酚F-13C6和雙酚S-13C12標(biāo)準(zhǔn)品各約10 mg（精確至0.1 mg），用甲醇溶解定容至10 mL 棕色容量瓶中，配成質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18 ℃避光保存，有效期6 個(gè)月。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（10 μg/mL）：準(zhǔn)確吸取上述儲(chǔ)備液1.0 mL，于100 mL 棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配成質(zhì)量濃度為10 μg/mL 的中間液，4 ℃保存，有效期1 個(gè)月。

1.3 樣品的提取

取試樣1.0 g，精確到0.01 g，放入10 mL 的比色管中，加入20 μL 內(nèi)標(biāo)工作液，氨水∶乙腈溶液（1∶9，體積比）溶解并定容至刻度，渦旋混勻，超聲提取10 min，靜置片刻，取2 mL 上清液，使用PRiME HLB 固相萃取柱進(jìn)行凈化。準(zhǔn)確移取凈化液1.5 mL 于離心管中，水浴氮?dú)獯蹈桑?.3 mL 乙腈溶解，過(guò)0.22 μm 的微孔尼龍濾膜至進(jìn)樣瓶，待測(cè)。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱：安捷倫Poroshell 120 PFP色譜柱 （2.0 mm×150 mm，5 μm）；流速：0.30 mL/min；進(jìn)樣體積：2 μL；流動(dòng)相A：甲醇，流動(dòng)相B：1‰氨水溶液。

質(zhì)譜條件：電噴霧負(fù)離子源（ESI-）；多反應(yīng)檢測(cè)的檢測(cè)方式（MRM）；霧化氣壓力為275.8 kPa；干燥氣（N2）溫度為300 ℃；鞘氣溫度為350 ℃；鞘氣流速為11 L/min；毛細(xì)管電壓為3 500 V；其它參數(shù)如表1所示。

表1 化合物的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 Mass spectrometry parameters of the compounds

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)化的樣品前處理方法

由于牛奶基質(zhì)復(fù)雜，富含脂肪和蛋白質(zhì)，因此應(yīng)選取弱極性的溶劑作為提取溶劑，本試驗(yàn)分別比較了丙酮、乙腈、甲醇及氯仿對(duì)牛奶中蛋白質(zhì)的去除效果。結(jié)果表明，乙腈去除蛋白的效果最好，同時(shí)又可以避免從樣品中提取出大量其它干擾物質(zhì)；雙酚A、雙酚F 及雙酚S 都是負(fù)離子模式電離，為了提高離子化效率，本方法采用氨水∶乙腈（1∶9，體積比）溶液提取樣品。

牛奶中的大部分蛋白質(zhì)可通過(guò)氨水乙腈沉淀，而同時(shí)其它雜質(zhì)也會(huì)被提取出來(lái)，為了避免影響目標(biāo)物的分離效果，在使用氨水∶乙腈（1∶9，體積比）溶液提取樣品后，還要進(jìn)行必要的凈化。分別比較了4 種固相萃取柱的凈化效果，包括安杰爾PCX（6cc/200 mg）、PRiME HLB（6cc/200 mg）、Oasis HLB （6cc/200 mg） 及安杰爾C18（6cc/200 mg）。結(jié)果表明，PRiME HLB（6cc/200 mg）固相萃取柱能吸附牛奶中的非極性干擾物質(zhì)，如脂肪和磷脂，去除效率達(dá)90%以上。為了提高目標(biāo)化合物檢測(cè)靈敏度，本方法采用氮吹進(jìn)行富集。

2.2 優(yōu)化的色譜條件

2.2.1 色譜柱 分別采用資生堂MGⅢ-C18 色譜柱 （150 mm×2.1 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX SB-C18 色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）、Hypersil GOLD C18 色譜柱（50 mm×4.6 mm，1.9 μm）和Agilent Poroshell 120 PFP 色譜柱 （100 mm×4.6 mm，2.7 μm）對(duì)樣品進(jìn)行分離。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Agilent Poroshell 120 PFP 色譜柱 （50 mm×4.6 mm，1.9 μm）的分離效果較好，有利于目標(biāo)化合物與雜質(zhì)的分離。

2.2.2 色譜分離條件 雙酚A、雙酚F 和雙酚S的極性不同，因此3 種化合物采用流動(dòng)相梯度洗脫的方式進(jìn)行分離，結(jié)果顯示，雙酚A 會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性的情況?；谝陨显囼?yàn)結(jié)果，本試驗(yàn)采用流動(dòng)相等度洗脫，流動(dòng)相為甲醇和1‰氨水溶液。結(jié)果表明，當(dāng)甲醇和1‰氨水溶液作為流動(dòng)相時(shí)，雙酚A、雙酚F 及雙酚S 能在7 min 內(nèi)被有效分離。圖1為雙酚S、雙酚F 和雙酚A 的色譜圖。

圖1 雙酚S、雙酚F 和雙酚A 的標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM 色譜圖Fig.1 Standard solution MRM chromatogram of bisphenol S，bisphenol F and bisphenol A

2.2.3 進(jìn)樣量 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)進(jìn)樣量為2 μL 時(shí)，靈敏度能達(dá)到要求，而且可有效延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命。

2.3 定量方法

基質(zhì)效應(yīng)是指樣品中分析物易受除分析物以外的組分干擾，從而影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。本文對(duì)比牛奶提取液及色譜乙腈分別配制的含雙酚A、雙酚F 及雙酚S 標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值大小，評(píng)價(jià)雙酚A、雙酚F 及雙酚S 的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果顯示，雙酚A、雙酚F 和雙酚S 在牛奶中與乙腈中的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率比值分別為0.65，0.70，0.36，證明牛奶中的其它基質(zhì)對(duì)雙酚A、雙酚F 及雙酚S 的定量存在電離抑制的基質(zhì)效應(yīng)?；谝陨显囼?yàn)結(jié)果，采用同位素內(nèi)標(biāo)法校正基質(zhì)效應(yīng)對(duì)結(jié)果的影響，提高測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。本試驗(yàn)選擇雙酚AD4、雙酚F-13C6和雙酚S-13C12為相應(yīng)的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，采用內(nèi)標(biāo)法定量分析。

2.4 線性范圍與檢出限

配制標(biāo)準(zhǔn)系列混合工作液（雙酚A、雙酚F 和雙酚S 的質(zhì)量濃度依次為1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 ng/mL，二者的內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度均為10.0 ng/mL）。以雙酚A、雙酚F、雙酚S 和內(nèi)標(biāo)物的峰面積比（y）和對(duì)濃度比（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以信號(hào)與噪音的比值為3 時(shí)，對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為檢出限，比值為10 時(shí)，對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為定量限。結(jié)果如表2所示。

表2 雙酚A、雙酚F 和雙酚S 的線性參數(shù)和檢出限Table 2 Linearity parameters and detection limit of bisphenol A，bisphenol F and bisphenol S

2.5 方法的回收率與精密度

稱取18 份等量的空白樣品，分為3 組，分別定量加入混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及對(duì)應(yīng)的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，使得雙酚A、雙酚F 和雙酚S 的加標(biāo)量質(zhì)量濃度為2.0，4.0，10.0 μg/kg。

按以上試驗(yàn)方法提取后進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，雙酚A、雙酚F 和雙酚S 的平均方法回收率在90.4%～103.1%之間，平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.76%～7.34%（n=6）。

表3 雙酚A、雙酚F 和雙酚S 的加標(biāo)回收率及精密度Table 3 Standard addition recovery rate and relative standard deviation of bisphenol A，bisphenol F and bisphenol S

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

利用上述試驗(yàn)方法對(duì)市場(chǎng)銷售的10 種牛奶樣品進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證方法的可靠性和適用性。結(jié)果顯示，雙酚A、雙酚S、雙酚F 的測(cè)定值均低于方法檢出限。

3 結(jié)論

本文建立了同時(shí)測(cè)定牛奶中雙酚A、雙酚F及雙酚S 的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。該方法采用氨水∶乙腈溶液 （1∶9，體積比） 沉淀蛋白，PRiME HLB 固相萃取柱凈化，采用負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式監(jiān)測(cè)，內(nèi)標(biāo)法定量；在不同添加水平下，平均方法回收率在90.4%～103.1%之間，平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.76%～7.34%（n=6）。該方法具有樣品前處理簡(jiǎn)單，測(cè)定快速，準(zhǔn)確性和重復(fù)性良好，能為我國(guó)牛奶中雙酚A、雙酚F 和雙酚S 污染物殘留的監(jiān)管與乳品流通過(guò)程中的安全問(wèn)題提供技術(shù)支持。