工業(yè)化生產(chǎn)大豆醬微生物群落發(fā)酵演替規(guī)律及功能變化特征

龐惟俏，佐兆杭，孫 維，張乃丹，周欣雨，王 穎，2，3，4*

（1 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院 黑龍江 大慶 163319 2 國家雜糧工程技術(shù)研究中心 黑龍江 大慶 163319 3 糧食副產(chǎn)物加工與利用教育部工程研究中心 黑龍江 大慶 163319 4 黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 黑龍江 大慶 163319）

豆醬屬于一種傳統(tǒng)發(fā)酵食品，豐富了中國人餐桌上的飲食文化和飲食選擇的多樣性，備受消費(fèi)者青睞和商家關(guān)注。豆醬的原料挑選、種曲篩選[1]、發(fā)酵條件優(yōu)化、產(chǎn)品研發(fā)，每個(gè)環(huán)節(jié)對(duì)制作和生產(chǎn)高質(zhì)量豆醬和醬衍生類產(chǎn)品十分重要[2]。工業(yè)化生產(chǎn)大豆醬的發(fā)酵過程是原料大豆、面粉等物質(zhì)，在曲精（霉菌、酵母菌、芽孢桿菌等）的作用下[3]于發(fā)酵池內(nèi)進(jìn)行一系列生化反應(yīng)及能量代謝，包括淀粉糖化、糖酵解、產(chǎn)酯增香等，進(jìn)而生成各類代謝產(chǎn)物和風(fēng)味物質(zhì)，賦予其獨(dú)特的風(fēng)味品質(zhì)和功能特性。研究證實(shí)，傳統(tǒng)大豆醬中的核心微生物對(duì)其風(fēng)味物質(zhì)的形成和不同發(fā)酵階段的表觀性質(zhì)具有重要作用[4]。結(jié)合傳統(tǒng)方式自然發(fā)酵加工工藝生產(chǎn)的大豆醬，因發(fā)酵生產(chǎn)過程處于開放式環(huán)境，最終生產(chǎn)出的豆醬品質(zhì)不一。研究大豆醬微生物群落結(jié)構(gòu)組成、演替規(guī)律、優(yōu)勢(shì)微生物及代謝過程等，對(duì)其發(fā)酵過程、產(chǎn)物生成及風(fēng)味類別起重要作用[5]。

早期大豆醬及發(fā)酵醬制品微生物多樣性和群落組成的研究，大都采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)、PCRDGGE、構(gòu)建基因文庫克隆技術(shù)[6-8]等方法，以便深入認(rèn)識(shí)并揭示其微生物群落環(huán)境的整體情況。如陳依淼等[9]采用傳統(tǒng)方法分離蝦醬發(fā)酵過程中的17 株優(yōu)勢(shì)細(xì)菌；Nam 等[10]利用高通量測(cè)序技術(shù)比較分析韓國市售9 種成品傳統(tǒng)大豆醬的微生物多樣性，證明芽孢桿菌屬（Bacillus）是主要的優(yōu)勢(shì)菌屬。近年來，多數(shù)研究集中在大豆醬的微生物群落多樣性和組成，對(duì)其發(fā)酵過程中微生物的功能性預(yù)測(cè)分析的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少。大豆醬不同發(fā)酵節(jié)點(diǎn)的微生物群落多樣性及優(yōu)勢(shì)微生物對(duì)其發(fā)酵理化性質(zhì)和香氣品質(zhì)的影響可能存在差異。宏基因組測(cè)序技術(shù)和宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)能夠深入表達(dá)基因和獲得發(fā)酵食品中微生物群落結(jié)構(gòu)及特定微生物，并可預(yù)測(cè)其發(fā)酵過程中微生物潛在的功能特性[11-13]，其應(yīng)用越來越受到重視。本試驗(yàn)以不同發(fā)酵時(shí)間節(jié)點(diǎn)的工業(yè)化生產(chǎn)大豆醬為研究對(duì)象，分析其發(fā)酵過程中理化性質(zhì)變化和微生物群落的演替規(guī)律并進(jìn)行相關(guān)性分析，同時(shí)預(yù)測(cè)發(fā)酵過程中的微生物群落組成，以期保證在釀造周期內(nèi)生產(chǎn)的大豆醬保持穩(wěn)定的天然釀造風(fēng)味，同時(shí)，通過了解大豆醬生產(chǎn)和風(fēng)味物質(zhì)形成的機(jī)制，為日后完善大豆醬標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)工藝，進(jìn)一步研究功能性和風(fēng)味穩(wěn)定的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

大豆醬，黑龍江省某知名品牌大豆醬醬廠。

3，5 -二硝基水楊酸、苯酚，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；福林酚試劑、碳酸鈉，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；對(duì)甲氧基苯甲醛、酪蛋白，上海嵐派生物科技有限公司；檸檬酸、檸檬酸鈉，天津市大茂化學(xué)試劑廠。所有有機(jī)溶劑、標(biāo)準(zhǔn)品均為分析純級(jí)。DNA 提取試劑盒QIAamp DNA stool mini kit，美國OMEGA 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

720 紫外-可見分光光度計(jì)，北京萊伯泰科儀器有限公司；微量高速離心機(jī)，Thermo 公司；Pico-21 臺(tái)式離心機(jī)，Thermo Fisher 公司；GL-88B 漩渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；TND03-H-H 混勻型干式恒溫器，深圳拓能達(dá)科技有限公司；DYY-6C 型電泳儀電源、DYCZ-21 電泳槽，北京市六一儀器廠；T100TM Thermal Cyeler PCR 儀，BIO-RAD 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大豆醬樣品采集 分別收集大醬池中發(fā)酵1，7，14，21，28，34 d 的大豆醬，在醬池頂部、中部、底部隨機(jī)采集翻醅后的醬醅各20 g 后混勻；置于滅菌袋中，-80 ℃保存，以備進(jìn)行DNA 提取。

1.3.2 大豆醬風(fēng)味理化物質(zhì)測(cè)定 大豆醬粗提液的制備：稱取5.0 g 大豆醬用蒸餾水定容100 mL，28 ℃下均質(zhì)振蕩60 min，3 500 r/min 離心15 min，上清液經(jīng)濾紙過濾，過濾后溶液為粗提液。參照醬衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法 （GB 5009.40-2003）[14]和食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定方法（GB 5009.235-2016）[15]，測(cè)定大豆醬總酸和氨基酸態(tài)氮含量。通過3，5-二硝基水楊酸法測(cè)定還原糖和葡萄糖淀粉酶含量；采用福林酚法測(cè)定蛋白酶含量。單位體積大豆醬粗酶液1 min 水解淀粉生成1 μg 麥芽糖為1 個(gè)酶活力單位（U）；單位體積大豆醬粗酶液1 min 水解酪蛋白生成1 μg 酪氨酸為1 個(gè)酶活力單位（U）。

通過氣相色譜-質(zhì)譜連用頂空固相微萃取技術(shù)（HS-SPME-GC-MS）測(cè)定大豆醬揮發(fā)性成分。每組分別取約2.0 g 的大豆醬樣品加入40 mL 樣品瓶中，加入經(jīng)過稀釋的對(duì)甲氧基苯甲醛內(nèi)標(biāo)溶液5 μL，將樣品瓶放入60 ℃水浴中平衡10 min，將老化5 min 的50/30 μm（DVB/CAR/PDMS）萃取針頭插入樣品瓶中，恒溫60 ℃萃取30 min，插入GC-MS 的進(jìn)樣器于250 ℃條件下解析1 min，同時(shí)啟動(dòng)儀器采集數(shù)據(jù)。GC-MS 分析時(shí)，進(jìn)樣口溫度250 ℃，載氣He，流速1.0 mL/min。程序升溫條件，由室溫升至80 ℃保持2 min，然后以4 ℃/min升至180 ℃在此溫度下保持3 min，再以5 ℃/min升至230 ℃，保持5 min，降溫至80 ℃，不分流進(jìn)樣。質(zhì)譜條件：MS 離子源在225 ℃全掃描，電離方式：EI，電子能量70 eV；掃描質(zhì)量范圍：50～500 u。通過檢索質(zhì)譜圖和NIST02.L 標(biāo)準(zhǔn)譜庫對(duì)照匹配進(jìn)行定性分析；根據(jù)內(nèi)標(biāo)物的濃度、樣品中各組分的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值進(jìn)行定量分析。

1.3.3 大豆醬DNA 的提取 使用QIAamp DNA stool mini kit 試劑盒提取大豆醬的總DNA，確保所提取的DNA 純度和完整性，-80 ℃保存，待構(gòu)建測(cè)序文本備用。

1.3.4 PCR 擴(kuò)增及高通量測(cè)序 16S rDNA 擴(kuò)增引物是利用測(cè)序平臺(tái)的341F 引物/805R 引物；18S rDNA 擴(kuò)增引物是NS1-FUNG 通用引物，通過Illumina Miseq 測(cè)序平臺(tái)對(duì)文庫進(jìn)行測(cè)序。使用PEARV0.9.6 將Miseq 雙端測(cè)序的reads 重疊部分拼接成一條序列，利用軟件UsearchV5.2.236 去除非靶區(qū)域序列、嵌合體及短片段序列，為減少錯(cuò)誤率，對(duì)樣本序列進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化（Q20 和Q30 得分均是99%）。利用MothurV1.30.2 將多條序列按其序列間的距離進(jìn)行聚類，根據(jù)序列之間的相似性0.97 作為閾值分成OTU （Operational taxonomic unit），獲取樣品屬水平的分類和豐度，利用RDP classifer（v2.2）軟件將OTU 序列與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，獲得物種注釋。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析 基于Excel 2021 軟件和GraphPad Prism 9.2 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和圖形繪制。用Simca-p11.5 軟件進(jìn)行偏最小二乘判別分析 （Partial least squares discriminant analysis，PLS-DA），基于R 語言version 3.3.1 進(jìn)行主成分分析（Principal co-ordinates analysis，PCoA）。通過使用LEfSe 線性判別分析（LDA）來估算每個(gè)組分（物種）豐度對(duì)差異效果影響的大小，鑒定不同發(fā)酵時(shí)期細(xì)菌和真菌群落物種之間的差異，并將LDA 的篩選值設(shè)置為2[16]。通過PICRUSt2 對(duì)OTU豐度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，然后通過每個(gè)OTU 對(duì)應(yīng)的greengene id，獲得OTU 對(duì)應(yīng)的COG 家族信息；并計(jì)算各COG 的豐度和KO 豐度，根據(jù)eggNOG 數(shù)據(jù)庫中解析到各個(gè)COG 的預(yù)測(cè)性描述信息，以及其功能信息。RDA 分析即冗余分析，97%相似性的樣本OTU 進(jìn)行分析，判斷理化因素與不同發(fā)酵時(shí)期的豆醬菌群之間相關(guān)性和顯著性。使用R 語言軟件包psych 和corr.test 函數(shù)計(jì)算斯皮爾曼（Spearman） 兩兩相關(guān)性并分析相關(guān)性的顯著性，通過Cytoscape 軟件將顯著性P＜0.05 且相關(guān)系數(shù)|r|＞0.6 的高度相關(guān)性可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆醬風(fēng)味理化物質(zhì)的監(jiān)測(cè)

總酸、氨基酸態(tài)氮、還原糖、揮發(fā)性成分、微生物酶活性的動(dòng)態(tài)變化是影響豆醬發(fā)酵品質(zhì)的關(guān)鍵因素[17]。工業(yè)化生產(chǎn)大豆醬在發(fā)酵過程中可滴定酸和氨基酸態(tài)氮呈先上升后下降的趨勢(shì)，如圖1a和1b 所示，可滴定酸度在發(fā)酵第28 天含量最高，為4.05%；氨基酸態(tài)氮在發(fā)酵第21 天含量最高，為9.31 g/100g。這是由于發(fā)酵過程中乳酸菌或者乳酸桿菌發(fā)酵代謝，促使大豆醬中的酸不斷富集；氨基酸態(tài)氮在大豆醬發(fā)酵過程中對(duì)其風(fēng)味品質(zhì)具有一定影響，發(fā)酵后期時(shí)其含量下降可能是由于蛋白酶活性減弱，進(jìn)而影響氨基酸態(tài)氮含量的變化。還原糖在大豆醬發(fā)酵過程中影響其顏色和微生物的生長情況，如圖1c 所示，還原糖在發(fā)酵第14 天時(shí)含量最高，為6.32 g/L，含量最低時(shí)是第21天，為4.24 g/L，含量突然變化可能是由于微生物的代謝能力下降以及微生物對(duì)碳源消耗的增加導(dǎo)致。蛋白酶和淀粉酶是將大分子物質(zhì)分解為小分子的催化劑，如圖1d 和1e 所示，這2 種酶的活性隨發(fā)酵時(shí)間的延長而減弱，結(jié)果表明大豆醬中微生物的代謝在發(fā)酵后期也逐漸趨于穩(wěn)定。通過HS-SPME-GC-MS 檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，大豆醬發(fā)酵過程中共檢出45 種揮發(fā)性化合物，其中包括7 種醇類、17 種酯類、4 種酸類、3 種酚類、2 種醛類、2種酮類和10 種其它類揮發(fā)性成分。如圖1f 所示，總揮發(fā)性化合物含量在發(fā)酵過程中逐漸積累，而在第28 天時(shí)，揮發(fā)性成分下降至285.42 ng/g，這與酶活性的結(jié)果相吻合，除了微生物群落的影響因素，可能與發(fā)酵過程中翻醅的次數(shù)和車間環(huán)境因子相關(guān)；待發(fā)酵結(jié)束時(shí)，揮發(fā)性成分含量積累到最大（945.91 ng/g）。醇類和酯類是大豆醬的主要揮發(fā)性成分，其中酯類化合物占揮發(fā)性化合物總含量的60%以上。這與賈云等[18]的相關(guān)研究結(jié)果一致，醇酯類揮發(fā)性成分是大豆醬風(fēng)味的主成分。

圖1 大豆醬發(fā)酵過程中風(fēng)味理化指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化情況Fig.1 Dynamic changes of physicochemical and flavor indicators during fermented soybean paste

由不同發(fā)酵節(jié)點(diǎn)的大豆醬揮發(fā)性成分熱圖（圖2）可以看出，發(fā)酵代謝產(chǎn)生的各種揮發(fā)性成分出現(xiàn)更替變化，揮發(fā)性成分在發(fā)酵后期顯著富集，同時(shí)發(fā)酵中后期是醇酯類化合物的高產(chǎn)期。醇酯類化合物賦予大豆醬適宜的特殊醇酯香氣，豐富其獨(dú)特的發(fā)酵品質(zhì)和性質(zhì)。乙醇、苯乙醇、2，3-丁二醇、麥芽醇、異戊醇等醇類化合物在大豆醬中被檢出，其是脫水縮合酯化反應(yīng)的重要前體成分[19]。例如，乙醇在許多類發(fā)酵食品中被廣泛檢出，是微生物的主要代謝產(chǎn)物，對(duì)發(fā)酵食品的風(fēng)味、質(zhì)地和顏色的形成發(fā)揮重要作用[20]。大豆醬中的酯類化合物，除了酸醇催化反應(yīng)生成酯以外，微生物代謝反應(yīng)亦可代謝可溶性酯。本試驗(yàn)中檢測(cè)到的酯包括亞油酸乙酯、棕櫚酸乙酯、硬脂酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯等，它們具有各自獨(dú)特的花果芳香氣味。大豆醬中酸來源于乳酸菌等微生物的代謝產(chǎn)物和酯類化合物分解產(chǎn)物；酚類化合物來源于代謝產(chǎn)物還原糖的美拉德反應(yīng)。本試驗(yàn)中酸酚類化合物盡管含量和種類較少，包括棕櫚酸、乙烯基愈創(chuàng)木酚、肉豆蔻酸、甲基麥芽酚等，賦予大豆醬獨(dú)特的酸味、辛香味和焙烤香氣[21]。苯乙醛、2-羥基-5-甲基苯乙酮、六甲基環(huán)三硅氧烷等醛酮化合物和其它類化合物在大豆醬中被檢出，賦予大豆醬類似水果甜味和風(fēng)信子的香氣[22]。

圖2 大豆醬發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化Fig.2 Changes of volatile flavor compounds in soybean paste during fermentation

2.2 大豆醬微生物物種注釋及組成

2.2.1 大豆醬微生物群落多樣性 序列經(jīng)過高通量測(cè)序平臺(tái)質(zhì)量控制，根據(jù)OTU 數(shù)目和OTU 所含的序列數(shù)得到大豆醬發(fā)酵過程中微生物群落的豐富度和多樣性，揭示其物種多樣性的信息。由圖3可知，細(xì)菌多樣性指數(shù)呈先上升后下降的趨勢(shì)，表明大豆醬中細(xì)菌多樣性先增加后減少，發(fā)酵第14 天時(shí)，Shannon 指數(shù)為2.54，細(xì)菌多樣性最高，發(fā)酵初期細(xì)菌多樣性最低為1.35；真菌豐富度更替變化，多樣性指數(shù)在第21 天最低，第7 天最高，Shannon 指數(shù)分別為0.30 和0.81，發(fā)酵初期大豆醬醅中微生物營養(yǎng)物質(zhì)含量高，生長條件適宜，大部分微生物生長和代謝增強(qiáng)。這些結(jié)果與以往多數(shù)發(fā)酵食品報(bào)道的結(jié)果相似[18-19]。

圖3 不同發(fā)酵節(jié)點(diǎn)大豆醬細(xì)菌（a）和真菌（b）群落Shannon 指數(shù)Fig.3 Shannon index of the community of active bacteria （a） and fungi （b） in fermented commercial soybean paste at different fermentation nodes

2.2.2 大豆醬微生物物種組成 大豆醬中豐富的微生物物種組成賦予其獨(dú)特的發(fā)酵品質(zhì)和特性，利用宏基因組測(cè)序技術(shù)，篩選出其中序列豐度大于5%的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌和真菌，得到了大豆醬在屬水平上，不同發(fā)酵階段動(dòng)態(tài)優(yōu)勢(shì)微生物的種類和豐度。如圖4所示，不同發(fā)酵節(jié)點(diǎn)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬不同，最高豐度分別為葡萄球菌屬（Staphylococcus，58.78%），阪崎腸桿菌屬（Cronobacter，57.34%），四聯(lián)球菌屬（Tetragenococcus，37.83%），腸桿菌屬（Enterobacter，32.49%），乳酸桿菌屬（Lactobacillus，18.55%），魏斯氏菌屬（Weissella，12.85%）。在整個(gè)發(fā)酵周期中隨著發(fā)酵溫度和鹽度的升高，細(xì)菌序列豐度最高的是葡萄球菌屬，其序列豐度呈現(xiàn)不斷增加的趨勢(shì)，是發(fā)酵初期的2 倍左右。然而，大豆醬中優(yōu)勢(shì)真菌屬組成種類較單一，主要的真菌屬分別是接和酵母屬 （Zygosaccharomyces） 和曲霉屬（Aspergillus）。接和酵母屬的序列豐度在發(fā)酵初期和中期呈不斷上升的趨勢(shì)，由14.04%升高到97.38%；然而，曲霉屬的序列豐度變化趨勢(shì)與之相反，從81.36%下降至1.07%。曲霉菌屬在大豆醬發(fā)酵過程中，提供了豐富的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等，對(duì)醬的鮮味具有較大的貢獻(xiàn)。在隨后的發(fā)酵過程中需不斷加入鹽水，形成高滲透壓和缺乏氧氣的生長環(huán)境，使得霉菌的生長被抑制，曲霉屬含量逐漸下降[23-24]。

圖4 大豆醬發(fā)酵過程中屬水平群落演替柱狀圖Fig.4 Successions and distributions community structure in commercial soybean paste at the genus level

通過PCoA 分析，第1 個(gè)主坐標(biāo)軸（PCoA1）對(duì)細(xì)菌和真菌群落總變化的解釋度分別為 57.98%和79.56%，對(duì)一系列特征值和特征向量進(jìn)行排序，根據(jù)優(yōu)勢(shì)微生物物種的豐度，不同發(fā)酵節(jié)點(diǎn)的大豆醬中細(xì)菌和真菌的微生物群落組成差異顯著，結(jié)果如圖5a、5b 所示。通過微生物群落聚類分析，將大豆醬整體發(fā)酵過程分為發(fā)酵初期 （0～7 d）、發(fā)酵中期（7～14 d）、發(fā)酵中后期（14～27 d）、發(fā)酵后期（28～34 d）。

圖5 大豆醬屬水平的群落組成結(jié)構(gòu)PCoA 和聚類分析Fig.5 Principal component and clustering analysis of microbial community diversity during commercial soybean paste fermentation

根據(jù)LEfSe 及線性判別分析（LDA 閾值為2）檢測(cè)不同發(fā)酵節(jié)點(diǎn)的顯著性差異優(yōu)勢(shì)類群，并判斷其差異效果的程度。如表1所示，發(fā)酵初期的差異物種主要是四聯(lián)球菌屬和曲霉屬，發(fā)酵中期富集大量腸桿菌屬和曲霉屬，而發(fā)酵中后期和后期葡萄球菌屬和接合酵母菌屬顯著富集。在相關(guān)大豆醬的研究[25-26]中，測(cè)定出的優(yōu)勢(shì)菌屬是耐鹽性的接合酵母菌屬和葡萄球菌屬，它們一般對(duì)氧需求量不高，可減少大豆醬在發(fā)酵過程中翻醅次數(shù)，并可產(chǎn)生大量的酯類物質(zhì)，貢獻(xiàn)于大豆醬香氣成分的形成。

表1 大豆醬不同發(fā)酵節(jié)點(diǎn)的差異優(yōu)勢(shì)微生物Table 1 Commercialize dominant biomarkers during the different fermentation stages of soybean paste

2.3 大豆醬微生物的功能預(yù)測(cè)

基于宏基因組數(shù)據(jù)的功能注釋分析，分別對(duì)16S rDNA 基因序列數(shù)據(jù)進(jìn)行PICRUSt2 功能預(yù)測(cè)和ITS 基因組的FUNGuild 功能預(yù)測(cè)分析，進(jìn)而揭示大豆醬發(fā)酵過程中微生物群落功能。COG 數(shù)據(jù)庫按照功能共分為26 類，在大豆醬發(fā)酵的所有樣品中比對(duì)得到了23 種功能類別，如圖6a 所示，發(fā)現(xiàn)不同發(fā)酵階段的細(xì)菌群落的預(yù)測(cè)功能種類豐度分布均勻且變化穩(wěn)定，豐度高的功能類別主要包括“S：Function unknown（未知功能）”、“E：Amino acid transport and metabolism（氨基酸的運(yùn)輸和代謝）”、“G：Carbohydrate transport and metabolism（碳水化合物運(yùn)輸和代謝）”、“J：Translation，ribosomal structure and biogenesis（翻譯，核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生）”、“K：Transcription（轉(zhuǎn)錄）”、“P：Inorganic ion transport and metabolism （無機(jī)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝）”。這說明大豆醬中細(xì)菌群落可能存在很多功能值得去深入挖掘；氨基酸和碳水化合物代謝主要是大豆醬發(fā)酵前、中期的代謝活動(dòng)，這可能是由于其中的微生物可編碼與氨基酸和碳水化合物代謝相關(guān)的酶，同時(shí)表明大豆醬在發(fā)酵過程中微生物群落細(xì)胞生長、代謝和產(chǎn)生能量物質(zhì)很積極。使用FUNGuild 對(duì)大豆醬真菌進(jìn)行功能分類，見圖6b，不同發(fā)酵階段樣品未知功能（Unknown） 和未定義的腐生生物 （Undefined saprotrophs）占所有真菌OTU 的90%以上，大豆醬中此類真菌在屬水平上分類地位和具體功能類別未定，需要進(jìn)一步探索其真菌資源，相關(guān)報(bào)道指出腐生營養(yǎng)型（Saprotroph）通過降解死亡的宿主細(xì)胞來獲取營養(yǎng)[27]，本試驗(yàn)結(jié)果中此類功能隨著大豆醬發(fā)酵時(shí)間的延長，豐度逐漸減少，這可能是因?yàn)榘l(fā)酵后期真菌活性減弱，促進(jìn)其風(fēng)味品質(zhì)趨于成熟，進(jìn)一步證實(shí)真菌對(duì)其發(fā)酵程度的影響。目前，本研究及相關(guān)研究均是基于DNA 水平技術(shù)研究大豆醬中微生物的情況，然而，可能會(huì)檢測(cè)到的微生物會(huì)處于休眠狀態(tài)進(jìn)而導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果的片面性[28]，后期研究可以基于宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（RNA水平）揭示大豆醬發(fā)酵過程中微生物群落的組成、演替和功能性注釋，同時(shí)，也可利用代謝組學(xué)技術(shù)靶向性定性、定量地研究微生物代謝產(chǎn)物。

圖6 大豆醬微生物群落演替功能預(yù)測(cè)對(duì)比分析Fig.6 Comparative analysis of function prediction of successions and distributions of microbial community during commercial soybean paste fermentation

2.4 大豆醬與風(fēng)味物質(zhì)相關(guān)性分析

2.4.1 不同發(fā)酵節(jié)點(diǎn)大豆醬與理化因素的相關(guān)性 為揭示大豆醬不同發(fā)酵時(shí)期與理化性質(zhì)的關(guān)系，通過對(duì)細(xì)菌屬和真菌屬相對(duì)豐度與理化性質(zhì)進(jìn)行RDA 分析。由圖7可知，揮發(fā)性成分、氨基酸態(tài)氮、蛋白酶活性對(duì)不同發(fā)酵節(jié)點(diǎn)大豆醬的影響程度較大，說明這幾種指標(biāo)是影響大豆醬風(fēng)味物質(zhì)的主要因素，其余指標(biāo)（總酸、葡萄糖淀粉酶、還原糖）的影響程度相對(duì)較小。氮是微生物生長所必需的營養(yǎng)物質(zhì)，因此，其含量會(huì)影響某些微生物生長[29]。根據(jù)6 種理化指標(biāo)箭頭間的夾角大小可知，揮發(fā)性成分與總酸和氨基酸態(tài)氮呈正相關(guān)；還原糖與蛋白酶、葡萄糖淀粉酶活性相關(guān)，這與其它文獻(xiàn)研究相似[30]。

圖7 理化性質(zhì)與大豆醬不同發(fā)酵節(jié)點(diǎn)的RDA 分析Fig.7 RDA analysis of physicochemical properties and different fermentation period of commercialize soybean paste

2.4.2 大豆醬微生物群落與風(fēng)味物質(zhì)因素的相關(guān)性 基于上述微生物功能預(yù)測(cè)，通過對(duì)大豆醬發(fā)酵過程中的優(yōu)勢(shì)菌屬與風(fēng)味物質(zhì)因素進(jìn)行相關(guān)性分析，進(jìn)一步證明了大豆醬微生物發(fā)酵過程中優(yōu)勢(shì)微生物的重要性及微生物功能預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。由圖8可知，葡萄球菌屬和接和酵母屬與揮發(fā)性物質(zhì)及其組成成分酸醛、醇酯等物質(zhì)呈正相關(guān)，這與前期的研究結(jié)果及他人研究結(jié)果相吻合[18]，這兩種優(yōu)勢(shì)菌屬對(duì)大豆醬揮發(fā)性物質(zhì)形成具有貢獻(xiàn)。曲霉屬與總酸、蛋白酶和淀粉酶呈正相關(guān)，這表明前期添加的曲霉菌屬可通過分泌酶降解代謝產(chǎn)物，這與菌群主要功能預(yù)測(cè)中碳水化合物和氨基酸代謝結(jié)果相似；其余菌屬如阪崎腸桿菌與還原糖，乳桿菌屬與蛋白酶呈正相關(guān)。

圖8 大豆醬不同節(jié)點(diǎn)微生物屬與理化指標(biāo)之間的相關(guān)性分析Fig.8 Correlation analysis between microbial genera and physicochemical properties of different period soybean paste

利用R 語言軟件，通過對(duì)序列豐度大于5%的37 種細(xì)菌屬和真菌屬以及45 種揮發(fā)性化合物之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，如圖9所示，葡萄球菌屬與醇酯、醛酮、酸類化合物呈正相關(guān)，如與苯乙醇、棕櫚酸乙酯、2，2，4，4-四甲基-3-戊酮、對(duì)甲氧基苯甲酸等呈正相關(guān)。接和酵母屬與醇酯類、酮類化合物呈正相關(guān)，包括乙醇、肉豆蔻酸乙酯、亞油酸甲酯、2，2，4，4-四甲基-3-戊酮等揮發(fā)性成分具有相關(guān)性?？傊?，優(yōu)勢(shì)菌葡萄球菌屬和接和酵母屬是對(duì)大豆醬風(fēng)味物質(zhì)貢獻(xiàn)最大的微生物菌屬，對(duì)醇酯類形成具有重要作用；其中葡萄球菌屬促進(jìn)代謝產(chǎn)物酸類物質(zhì)和氨基酸態(tài)氮的形成。

圖9 大豆醬不同發(fā)酵節(jié)點(diǎn)微生物屬與揮發(fā)性成分之間的相關(guān)性分析Fig.9 Correlation analysis between microbial genera and volatile flavor compounds of different period soybean paste

3 結(jié)論

本研究采用宏基因組技術(shù)對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)不同發(fā)酵節(jié)點(diǎn)大豆醬中主要理化指標(biāo)、微生物群落及功能演替規(guī)律進(jìn)行分析，并將風(fēng)味物質(zhì)影響因素與優(yōu)勢(shì)微生物進(jìn)行相關(guān)性分析，揭示大豆醬微生物生態(tài)分布情況，預(yù)測(cè)其功能性變化。在微生物屬水平上，細(xì)菌的微生物群落組成較真菌更加豐富，其中最主要的優(yōu)勢(shì)菌是細(xì)菌屬的葡萄球菌屬和真菌屬的接和酵母屬，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，其序列豐度呈上升趨勢(shì)。根據(jù)微生物菌群功能預(yù)測(cè)可知，大豆醬發(fā)酵過程中細(xì)菌和真菌屬水平功能豐度分布主要是未知功能，這說明大豆醬中的菌群功能值得進(jìn)一步深入研究。其次，優(yōu)勢(shì)菌屬主要富集在氨基酸的運(yùn)輸和代謝以及碳水化合物的運(yùn)輸和代謝兩種功能。相關(guān)性分析表明，氨基酸態(tài)氮、還原糖、揮發(fā)性成分等6 種理化因素對(duì)不同發(fā)酵節(jié)點(diǎn)的大豆醬具有不同程度的影響，且彼此之間呈正相關(guān)。優(yōu)勢(shì)菌屬葡萄球菌屬和接和酵母屬與揮發(fā)性成分醇酯、醛酮類化合物相關(guān)性較大，促進(jìn)大豆醬后期風(fēng)味物質(zhì)的形成，是揮發(fā)性成分形成的關(guān)鍵微生物。本試驗(yàn)從微生物群落結(jié)構(gòu)和功能角度研究，有助于進(jìn)一步探明傳統(tǒng)工藝結(jié)合現(xiàn)代技術(shù)生產(chǎn)大豆醬的釀造機(jī)制，為大豆醬生產(chǎn)條件的控制及發(fā)酵種曲的開發(fā)提供一定的理論支持。