酸棗多糖羧甲基化修飾及活性研究

陳 柵，馮潤(rùn)芳，袁 野，趙智慧，2，劉孟軍，2*

（1 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院 河北 保定 071000 2 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)中國(guó)棗研究中心 河北 保定 071000）

酸棗（Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa（Bunge） Hu ex H.F.Chou）又名山棗、葛針、野棗、棘，鼠李科棗屬野生灌木或小喬木[1]。栽培歷史悠久，適應(yīng)性強(qiáng)，主要分布在我國(guó)北方地區(qū)，是重要的傳統(tǒng)野生植物資源之一，已被衛(wèi)生部列為藥食同源兩用品[2]。野生酸棗營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高，現(xiàn)有研究表明，酸棗果肉中富含多種營(yíng)養(yǎng)成分，主要包括多種礦物質(zhì)、可溶性糖、有機(jī)酸[3]、多酚[4]、甾醇、黃酮以及多種微量元素和大量維生素等[5-6]，具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗癌、助眠及降血脂等功效[7-9]。此外，酸棗仁還有抗抑郁、補(bǔ)腦安神等特性[10]。有研究表明，棗多糖還具有重要的生理保健功能和生物活性，包括抗衰老、改善心血管及增強(qiáng)免疫功能等[11]。

多糖又稱多聚糖，是由10 多種單糖通過(guò)糖苷鍵連接而成的天然高分子化合物[12]。根據(jù)多糖來(lái)源的不同，可將其分為植物多糖、動(dòng)物多糖和微生物多糖[13]，不僅具有降血糖、抗病毒、抗增殖、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用，還可以降低合成藥物的毒性和副作用[14-15]。多糖的生物活性受其分子結(jié)構(gòu)的影響，應(yīng)用現(xiàn)代化學(xué)技術(shù)對(duì)天然多糖進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾，可提高其生物活性[16]。常用的化學(xué)修飾方法有羧甲基化、硫酸化、乙酰化、磷酸化等[17]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)修飾后的棗多糖的抗氧化活性及多糖性質(zhì)都發(fā)生改變。本研究從酸棗果實(shí)中提取多糖，對(duì)羧甲基化基團(tuán)修飾工藝進(jìn)行研究，以期獲得高取代度羧甲基化修飾多糖樣品。此外，對(duì)酸棗多糖基團(tuán)修飾前、后的性質(zhì)和功能進(jìn)行研究，為酸棗資源的利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“酸棗”成熟果實(shí)，采自河北省贊皇縣；嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus，CGMCC 1.2919）、鼠李糖乳桿菌 （Lactobacillus rhamnosus，CGMCC 1.576），中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC）；透析袋（8 000～14 000 u）；超純水；所有有機(jī)溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

SYG-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州朗越儀器制造有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國(guó)IKA 公司；氣相色譜儀，美國(guó)Agilent 科技有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；CP224C電子天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司；TESCAN VEGA3 掃描電鏡，捷克TESCAN 公司；紅外分光光度計(jì)，美國(guó)Spectrum 公司。

1.3 方法

1.3.1 酸棗多糖的提取 采用水提醇沉法提取酸棗多糖。稱取2.5 kg 酸棗果實(shí)，洗凈、去核，加入3倍體積的95%乙醇醇沉，每隔24 h 重復(fù)1 次，共重復(fù)3 次，去除單糖和脂類，向過(guò)濾和干燥的濾渣中加入水0.05 g/mL。用沸水萃取2 h，重復(fù)3 次，再將濾液抽濾濃縮，濃縮后與95%乙醇混合醇沉，使酒精度達(dá)到80 度，攪拌后在4 ℃下過(guò)夜沉淀聚合物，然后過(guò)濾，收集多糖并用95%乙醇洗滌，60℃烘干打粉。采用Sevage 法脫蛋白。

1.3.2 酸棗多糖羧甲基化修飾工藝研究

1）酸棗多糖羧甲基化修飾工藝單因素實(shí)驗(yàn)以酸棗羧甲基化多糖取代度為參考指標(biāo)，分別比較反應(yīng)溫度、氯乙酸添加量、氫氧化鈉濃度3 個(gè)因素對(duì)酸棗羧甲基化多糖取代度的影響。稱取酸棗多糖500 mg 于燒杯中，固定反應(yīng)溫度60 ℃，加入濃度分別為1，1.5，2，2.5，3，3.5 mol/L 的氫氧化鈉溶液50 mL，攪拌60 min 至充分混勻，然后再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的氯乙酸；固定氫氧化鈉溶液濃度為2.5 mol/L，在不同溫度（50，60，70，80，90 ℃）下，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 %的氯乙酸；固定反應(yīng)溫度80℃，氫氧化鈉溶液濃度為2.5 mol/L，加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)（1%，2%，3%，4%，5%）的氯乙酸，水浴反應(yīng)5 h 后，冷卻至室溫，調(diào)節(jié)溶液pH=7，裝入透析袋（8 000～14 000 u）于蒸餾水中透析72 h，將袋內(nèi)溶液旋蒸干燥即獲得羧甲基化酸棗多糖。

羧甲基化酸棗多糖取代度的測(cè)定：稱取羧甲基化酸棗多糖樣品20 mg 至50 mL 容量瓶中，加入20 mL 0.01 mol/L 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，40 ℃水浴30 min，冷卻至室溫，再用0.01 mol/L 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液反滴定過(guò)剩氫氧化鈉，至剛好褪去酚酞指示劑顏色。測(cè)定前，應(yīng)對(duì)氫氧化鈉和鹽酸溶液進(jìn)行標(biāo)定[18]。取代度（DS）計(jì)算公式為：

式中，A——每克樣品消耗氫氧化鈉物質(zhì)的量，mmol；V0——所消耗的氫氧化鈉溶液的體積，mL；C0——所消耗的氫氧化鈉溶液的濃度，mol/L；V1——所消耗的鹽酸溶液的體積，mL；C1——所消耗的鹽酸溶液的濃度，mol/L；m——酸棗羧甲基化多糖樣品質(zhì)量，g。

2）響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken 的中心組合原理為依據(jù)，以反應(yīng)溫度（A）、氫氧化鈉濃度（B）和氯乙酸添加量（C）為自變量，取代度為因變量，采用響應(yīng)面優(yōu)化方法，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件Design Expert 11 建立數(shù)字回歸模型，確定酸棗多糖羧甲基化修飾的最佳條件。

1.3.3 酸棗羧甲基化多糖的性質(zhì)測(cè)定

1）酸棗多糖的溶解度及黏度測(cè)定 水溶性測(cè)定：將酸棗多糖配制成20 mg/mL 溶液，采用平衡法[19]測(cè)定其溶解度。

黏度測(cè)定：取0.5 g 酸棗多糖樣品溶于300 mL 蒸餾水中，使其沒(méi)過(guò)轉(zhuǎn)子，打開(kāi)粘度計(jì)測(cè)定，待屏幕上數(shù)字穩(wěn)定后記錄讀數(shù)，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3 次。

2）單糖組成測(cè)定 稱取單糖標(biāo)品，包括鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、果糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖各10 mg 于試管中，各加入12 mg 鹽酸羥胺和0.5 mL 吡啶，置于干燥箱中，90 ℃反應(yīng)30 min，取出冷卻至室溫后，加入0.5 mL 醋酐，90 ℃反應(yīng)30 min，氮?dú)獯蹈珊螅尤? mL 氯仿溶解，備用。按照標(biāo)品處理方法制備待測(cè)樣品。氣相色譜條件：載氣為氮?dú)猓兌?9.999%），氫氣流速50.0 mL/min，空氣流速400 mL/min，恒定壓力8.79 psi，平均線速度34 cm/s；氣化室溫度240 ℃，檢測(cè)溫度260 ℃，色譜柱起始溫度140 ℃，維持3 min，以10 ℃/min 升至240 ℃，保持11 min，分流比為20∶1，進(jìn)樣量1 μL。

3）紫外掃描分析 稱取多糖樣品5 mg，加入50 mL 超純水溶解，配成0.1 mg/mL 樣品溶液，在紫外分光光度計(jì)下190～900 nm 范圍內(nèi)掃描，得到紫外掃描光譜圖。

4）紅外光譜掃描 采用KBr 壓縮法，用FTIR 分光光度計(jì)測(cè)定棗多糖的紅外光譜。將1 mg棗多糖與200 mg KBr 粉末（100°C 下完全干燥）研磨并壓入1 mm 瑪瑙砂漿中，經(jīng)壓片機(jī)壓成1 mm 厚片，放置于紅外光譜儀中檢測(cè)，頻率分辨率1 cm-1，在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)掃描。

5）掃描電鏡及電鏡能譜觀察 將充分干燥的酸棗多糖用離子濺射鍍膜法制備電鏡樣品，置于掃描電鏡的樣品室中掃描分析，調(diào)節(jié)加速電壓10 kV，放大5 000 倍，觀察酸棗多糖的表面的形態(tài)及組成元素。同時(shí)，采用EDS 模式進(jìn)行棗多糖樣品元素分析。

1.3.4 酸棗羧甲基化多糖體外抗氧化活性研究

1）DPPH 清除能力測(cè)定 將多糖樣品配制成不同濃度的溶液各2 mL，加入濃度為2×10-4mol/L 的DPPH 乙醇溶液混勻，室溫避光靜置30 min，測(cè)定吸光值A(chǔ)1，同時(shí)，取2 mL 乙醇和2 mL 樣品溶液混勻，測(cè)定吸光值A(chǔ)2，再取2 mL 乙醇，2 mL DPPH 溶液混勻，測(cè)得吸光值A(chǔ)3，于517 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定3 次[20-21]。按式（3）計(jì)算：

2）羥基自由基的清除能力測(cè)定 依次加入4.5 mmol/L FeSO4溶液、4.5 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液和不同濃度待測(cè)溶液各1 mL，充分搖勻，再加 入1 mL 4.4 mmol/L H2O2，37 ℃水 浴0.5 h，于510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定3次，取平均值[22]。按式（4）計(jì)算：

式中，A1——FeSO4+水楊酸-乙醇溶液+蒸餾水+H2O2；A2——FeSO4+水楊酸-乙醇溶液+樣品+H2O2；A3——FeSO4+水楊酸-乙醇溶液+樣品+蒸餾水。

3）還原力測(cè)定 準(zhǔn)確移取不同濃度的多糖樣品溶液各2.5 mL，依次加入濃度為0.2 mol/L，pH=6.6 的磷酸鹽緩沖液2.5 mL 和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的K3Fe（CN）6溶液2.5 mL 混勻，50 ℃水浴20 min，快速冷卻后，加入三氯乙酸溶液2.5 mL 混勻，3 000 r/min 離心10 min，取5 mL 上清液，加入5 mL 蒸餾水和1 mL 1 mg/mL 的FeCl3溶液混勻，靜置10 min，于700 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定3 次[23-24]。

1.3.5 酸棗羧甲基化多糖對(duì)益生菌生長(zhǎng)的影響將LR 鼠李糖乳桿菌、LB 嗜酸乳桿菌在MRS 液體培養(yǎng)基上活化48 h 后，接入MRS 液體培養(yǎng)基，制備種子液。

將酸棗多糖加入液體培養(yǎng)基中，使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0%，0.5%，1%，1.5%，菌液在37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)32 h，每隔2 h 取出發(fā)酵液采用分光光度計(jì)在600 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光值，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)重復(fù)測(cè)定3 次。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，以未加入酸棗多糖的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有測(cè)定的樣品均一式3 份，用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差” 表示。采用Spss17.0 軟件進(jìn)行多因素比較，采用單因素方差分析（ANOVA）和鄧肯多區(qū)間檢驗(yàn)。P＜0.05 表示“具有顯著差異”，P＜0.01 表示“具有極顯著差異”。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸棗多糖羧甲基化修飾工藝

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1）反應(yīng)溫度對(duì)酸棗羧甲基化多糖取代度的影響 單因素篩選反應(yīng)溫度結(jié)果表明，酸棗羧甲基化多糖的取代度隨反應(yīng)溫度升高呈先升高后下降的趨勢(shì)（圖1a）。當(dāng)溫度為40～80 ℃時(shí)，羧甲基化取代度逐漸升高，當(dāng)溫度為80 ℃時(shí)，羧甲基化取代度達(dá)到最大值為0.7268±0.0540。當(dāng)溫度高于80 ℃，羧甲基化取代度顯著下降，這是因?yàn)樯邷囟瓤梢蕴岣唪燃谆姆磻?yīng)速率，而溫度過(guò)高，會(huì)破壞酸棗多糖結(jié)構(gòu)，不利于取代反應(yīng)的進(jìn)行[25]。因此確定酸棗多糖羧甲基化修飾的溫度為80 ℃。

2）氯乙酸添加量對(duì)酸棗羧甲基化多糖取代度的影響 氯乙酸添加量對(duì)酸棗羧甲基化多糖取代度的影響如圖1b 所示。隨著氯乙酸添加量的增加，酸棗羧甲基化取代度呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)氯乙酸添加量為1%～3%時(shí)，羧甲基化取代度逐漸升高，當(dāng)氯乙酸添加量為3%時(shí)，取代度達(dá)到最大值為0.74，當(dāng)氯乙酸添加量增加到4%和5%時(shí)，羧甲基化取代度呈下降趨勢(shì)，這主要是由于氯乙酸添加量的增加影響反應(yīng)體系的pH 值，氯乙酸添加量增加，可提供更多的CH2COO-，使得多糖反應(yīng)的幾率增大，而氯乙酸的添加量過(guò)大，會(huì)使整個(gè)反應(yīng)體系的pH 值降低，不利于取代反應(yīng)的進(jìn)行[26]。因此確定酸棗多糖羧甲基化修飾的氯乙酸添加量為3%。

3）NaOH 濃度對(duì)酸棗羧甲基化多糖取代度的影響 NaOH 濃度對(duì)酸棗羧甲基化多糖取代度的影響如圖1c 所示。隨著NaOH 濃度的增加，酸棗羧甲基化取代度呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)NaOH 濃度為1～2.5 mmol/L 時(shí)，羧甲基化取代度逐漸升高，當(dāng)NaOH 濃度為2.5 mol/L 時(shí)，取代度達(dá)到最大值為0.7477±0.0496。當(dāng)NaOH 濃度再升高，酸棗羧甲基化取代度下降，這是因?yàn)樵趶?qiáng)堿條件下，多糖易降解，而當(dāng)氯乙酸和NaOH 達(dá)到一定濃度時(shí)會(huì)發(fā)生副反應(yīng)，從而降低取代速率[27]。因此確定酸棗多糖羧甲基化修飾的NaOH 濃度為2.5 mmol/L。

圖1 處理溫度（a）、氯乙酸添加量（b）、NaOH 濃度（c）對(duì)酸棗多糖取代度的影響Fig.1 Effect of treatment temperature （a），chloroacetic acid （b），NaOH concentration （c） on the degree of substitution of wild jujube

2.1.2 酸棗多糖羧甲基化修飾方法優(yōu)化

1）因變量與自變量關(guān)系的統(tǒng)計(jì)分析 采用響應(yīng)面法對(duì)反應(yīng)溫度（℃）、氯乙酸添加量（%）、NaOH 濃度（mol/L）3 個(gè)自變量進(jìn)行優(yōu)化。17 項(xiàng)試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 酸棗多糖羧甲基化方法優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Method and results of response surface test for carboxymethylation of wild jujube polysaccharides

2）模型的建立及方差分析 用Design-Expert 11 軟件將模型進(jìn)行分析，得到酸棗多糖羧甲基化取代度（DS）以及所選3 個(gè)因素編碼值的回歸方程為：Y=0.76-0.0212A-0.0175B-0.0212C-0.055AB-0.0675AC-0.02BC-0.0888A2-0.1212B2-0.1338C2。

再對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，并對(duì)模型系數(shù)進(jìn)行顯著性測(cè)驗(yàn)，如表2所示，該試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，P＜0.0001，即為極顯著，模型的失擬項(xiàng)P=0.5781＞0.05，說(shuō)明相對(duì)于純誤差失擬不顯著，獲得模型決定系數(shù)R2=0.8583，說(shuō)明該模型86%的數(shù)據(jù)可用此方程解釋。模型的一次項(xiàng)A 對(duì)酸棗多糖羧甲基化的取代度影響極顯著（P＜0.01），而一次項(xiàng)B、C 和交互項(xiàng)AB、AC、BC 對(duì)酸棗多糖羧甲基化的取代度影響不顯著；模型的二次項(xiàng)A2、B2及C2的P 值都小于0.01，均為極顯著。綜上所述，該模型擬合度符合數(shù)理統(tǒng)計(jì)學(xué)原則，酸棗羧甲基化條件可以用此方程預(yù)測(cè)。

表2 回歸模型方差分析Table 2 Variance analysis of regression model

3）響應(yīng)面分析與最優(yōu)方法驗(yàn)證 利用Design-Expert 11 軟件，做出以酸棗羧甲基化條件為響應(yīng)值的各因素的響應(yīng)曲面圖，并分析各因素的交互作用，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，反應(yīng)溫度（A）對(duì)酸棗多糖羧甲基化取代度的影響大于NaOH 濃度（B）；氯乙酸添加量（C）對(duì)酸棗多糖羧甲基化取代度的影響大于反應(yīng)溫度（A）。綜合分析發(fā)現(xiàn)，NaOH 濃度（B）與氯乙酸添加量（C）的交互影響最顯著。根據(jù)響應(yīng)面軟件分析可得出羧甲基化最佳條件為反應(yīng)溫度為80 ℃，NaOH 濃度為2.5 mol/L，氯乙酸添加量為3%。在該條件下進(jìn)行3 次重復(fù)試驗(yàn)，其取代度結(jié)果分別為0.74，0.74，0.81，平均值為0.76，均優(yōu)于其它組合，表面最優(yōu)方法組合合理可用。

圖2 各因素交互作用對(duì)酸棗羧甲基化最佳條件影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface plots and contour lines of effects of various factors interaction on the wild jujube polysaccharides

2.2 酸棗羧甲基化多糖性質(zhì)研究

2.2.1 酸棗溶解度和黏度測(cè)定 多糖經(jīng)羧甲基化修飾后，可解決其因黏度高、溶解性低而不利于活性發(fā)揮的問(wèn)題。由表3可知，酸棗多糖經(jīng)羧甲基化修飾后，水溶性提高，黏度降低。

表3 酸棗多糖的水溶性和黏性Table 3 Water solubility and viscosity of wild jujube polysaccharide

2.2.2 酸棗羧甲基化多糖單糖組成測(cè)定 圖3為單糖混合標(biāo)準(zhǔn)品（A）和酸棗粗多糖（B）及羧甲基化多糖（C）的氣相色譜圖，由圖可知，酸棗粗多糖是雜多糖，主要由Rha、Ara、Xyl、Man、Glc 和Gal共6 種單糖組成，經(jīng)計(jì)算物質(zhì)的量比（%）為0.26∶4.42∶0.35∶0.14∶0.16∶1。酸棗羧甲基化多糖也由Rha、Ara、Xyl、Man、Glc 和Gal 共6 種單糖組成，其物質(zhì)的量比（%）為0.93∶23.09∶1.08∶2.17∶0.68∶1，Ara 是主要的單糖。羧甲基化后，單糖類型無(wú)變化，單糖組成的比例發(fā)生變化，結(jié)果表明，羧甲基化修飾影響酸棗多糖的理化特性，然而不改變其主要成分。

圖3 單糖混合標(biāo)準(zhǔn)品（a）、酸棗粗多糖（b）和酸棗羧甲基化多糖（c）的氣相色譜圖Fig.3 GC chromatography of monosaccharide standard GC （a），wild jujube crude polysaccharide （b），carboxymethylated wild jujube polysaccharide （c）

2.2.3 酸棗羧甲基化多糖紫外掃描分析 圖4為酸棗多糖及酸棗羧甲基化多糖水溶液的紫外全波長(zhǎng)掃描圖，酸棗未除蛋白粗多糖在260～280 nm 波長(zhǎng)處有強(qiáng)吸收峰，這表明多糖中存在蛋白結(jié)構(gòu)。而酸棗除蛋白多糖和羧甲基化多糖在260～280 nm波長(zhǎng)處均未檢測(cè)到吸收峰，表明多糖中蛋白均被去除。

圖4 酸棗多糖紫外光譜圖Fig.4 UV-visible spectrogram of wild jujube polysaccharide

2.2.4 酸棗羧甲基化多糖紅外光譜分析 圖5為酸棗多糖和酸棗羧甲基化多糖的紅外光譜圖，以KBr 為背景對(duì)照，在400～4 000 cm-1紅外光譜區(qū)域內(nèi)進(jìn)行掃描，由圖可知，酸棗多糖羧甲基化修飾前、后都具有多糖的特征吸收峰，3 364 cm-1處的吸收峰為多糖分子中的-OH 振動(dòng)吸收峰，2 931 cm-1為糖類C-H 鍵的伸縮振動(dòng)峰，1 732 cm-1和1 602 cm-1的振動(dòng)吸收峰是由于多糖中糖醛酸的存在，1 017 cm-1處的吸收峰表明存在C-O-C 和C-O-H。酸棗多糖經(jīng)羧甲基修飾后，出現(xiàn)了新的吸收峰。1 407.78 cm-1處是羧甲基中COO-峰的拉伸振動(dòng)，是羧甲基化的特征峰，羧甲基化多糖羧甲基特征峰的羧基振動(dòng)加強(qiáng)，表明酸棗多糖分子中引入了COO-基團(tuán)。

圖5 酸棗多糖紅外光譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of wild jujube polysaccharide

2.2.5 掃描電鏡觀察分析 取酸棗粗多糖與酸棗羧甲基化多糖分別粘于樣品臺(tái)上，置于真空濺射儀內(nèi)鍍一層導(dǎo)電金膜，進(jìn)行掃描電鏡觀察，并在5 000 倍下拍照分析。電鏡結(jié)果如圖6所示。由圖6a 可知，酸棗粗多糖結(jié)構(gòu)呈團(tuán)狀聚集，表面凹凸不平，而從圖6b 可以看出，酸棗羧甲基化多糖表面光滑，呈層狀堆積，同時(shí)，酸棗羧甲基化多糖晶體間呈現(xiàn)微小空隙，多糖并未完全集合，說(shuō)明多糖分子間存在相互排斥力，分子間吸引力較弱。

圖6 酸棗粗多糖（a）和酸棗羧甲基化多糖（b）掃描電鏡圖（5 000×）Fig.6 SEM analysis of wild jujube crude polysaccharide （a） and carboxymethylated polysaccharide （b） （5 000×）

圖7為酸棗多糖電鏡能譜圖，由圖可知，羧甲基化酸棗多糖O 所占比例有所增加，可能是因?yàn)橛?CH2-COO 的引入，出現(xiàn)Na 是由于酸棗多糖在進(jìn)行羧甲基化修飾時(shí)采用的是氫氧化鈉-氯乙酸反應(yīng)體系。

圖7 酸棗粗多糖（a）和酸棗羧甲基化多糖（b）的電鏡能譜分析圖Fig.7 EDS analysis of wild crude jujube polysaccharide （a） and carboxymethylated polysaccharide （b）

2.3 酸棗羧甲基化多糖的活性研究

2.3.1 酸棗羧甲基化多糖的抗氧化活性 酸棗多糖對(duì)羥基自由基的清除能力如圖8a 所示，酸棗多糖對(duì)羥基自由基的清除能力隨濃度的增加整體呈上升趨勢(shì)，酸棗羧甲基化多糖對(duì)羥基自由基的清除能力明顯優(yōu)于酸棗粗多糖，當(dāng)酸棗羧甲基化多糖質(zhì)量濃度為2 mg/mL 時(shí)，清除率僅為74.1%，而當(dāng)質(zhì)量濃度增加到5 mg/mL 時(shí)，清除率顯著提高到95.8%，接近于VC 對(duì)羥基自由基的清除率99.5%，表現(xiàn)出良好的清除能力。

酸棗羧甲基化多糖對(duì)DPPH 的清除效果如圖8b 所示，可知酸棗粗多糖和酸棗羧甲基化多糖都具有一定的清除DPPH 自由基的能力。隨著酸棗羧甲基化濃度增加，對(duì)DPPH 自由基的清除能力逐漸提高，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到5 mg/mL 時(shí)，清除率最高為81.9%，而相同濃度的酸棗粗多糖的清除率為87.4%，相對(duì)于酸棗粗多糖，酸棗羧甲基化多糖對(duì)DPPH 自由基的清除率較低，然而與陽(yáng)性對(duì)照VC 相比，酸棗羧甲基化多糖對(duì)DPPH 自由基的清除能力可達(dá)到VC 對(duì)DPPH 自由基的清除能力的4/5 以上，表明酸棗羧甲基化多糖具有良好的清除DPPH 自由基的能力。

隨著質(zhì)量濃度的增加，酸棗多糖的總還原力逐漸增強(qiáng)，如圖8c 所示。當(dāng)酸棗羧甲基化多糖質(zhì)量濃度為1 mg/mL 時(shí)，其吸光值為0.516 A，為對(duì)照組VC 吸光值的15%；當(dāng)質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，吸光值為1.295 A，較酸棗粗多糖的總還原力（1.639 A）弱。

圖8 酸棗羧甲基化多糖的羥基自由基清除率（a）、DPPH 自由基清除率（b）和還原力（c）Fig.8 Hydroxyl radical scavenging rate （a），DPPH radical scavenging rate （b） and Reductive power （c）of carboxymethylated of wild jujube polysaccharide

2.3.2 酸棗羧甲基化多糖對(duì)益生菌生長(zhǎng)的影響 圖9顯示了2 株乳酸菌在pH 值為5.7±0.2 時(shí)的生長(zhǎng)曲線。2 株乳酸桿菌在培養(yǎng)24 h 后均達(dá)到穩(wěn)定期。

圖9 益生菌生長(zhǎng)曲線Fig.9 Growth curve of probiotics

添加酸棗多糖對(duì)嗜酸乳桿菌LB 表現(xiàn)出促進(jìn)作用。如圖10所示，酸棗多糖的添加對(duì)嗜酸乳桿菌LB 的菌量生長(zhǎng)整體表現(xiàn)出一定的促進(jìn)作用，并且隨著酸棗多糖濃度的升高，OD 值呈上升趨勢(shì)。由圖可知，酸棗羧甲基化多糖對(duì)促進(jìn)嗜酸乳桿菌LB 的生長(zhǎng)優(yōu)于粗多糖。

圖10 酸棗多糖對(duì)嗜酸乳桿菌生長(zhǎng)規(guī)律的影響Fig.10 The effect of wild jujube polysaccharide on the growth of LB

如圖11所示，酸棗粗多糖和酸棗羧甲基化多糖對(duì)鼠李糖乳桿菌LR 的生長(zhǎng)都表現(xiàn)出促進(jìn)作用，在4～16 h，菌株的生長(zhǎng)量呈上升趨勢(shì)，然后逐漸下降。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的酸棗羧甲基化多糖對(duì)鼠李糖乳桿菌LR 的生長(zhǎng)表現(xiàn)出最佳的促進(jìn)作用，在同質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，顯著優(yōu)于酸棗粗多糖（P＜0.05）。

圖11 酸棗多糖對(duì)鼠李糖桿菌生長(zhǎng)規(guī)律的影響Fig.11 The effect of wild jujube polysaccharide on the growth of LR

3 結(jié)論

本研究獲得酸棗多糖羧甲基化修飾工藝最佳條件為：反應(yīng)溫度為80 ℃，NaOH 濃度為2.5 mol/L，氯乙酸添加量為3%，在該條件下，酸棗多糖羧甲基化的取代度為0.76。酸棗多糖經(jīng)羧甲基化修飾后可使其溶解度提高，黏度降低。通過(guò)掃描電鏡對(duì)酸棗多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，酸棗羧甲基化多糖表面表現(xiàn)更光滑，多糖分子由于襯度低，利用電鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)存在一定難度，關(guān)于酸棗羧甲基化多糖的結(jié)構(gòu)還需進(jìn)一步分析，修飾后酸棗多糖電鏡能譜圖中由于-CH2-COO 的引入，使得O 的原子比例有所增加。酸棗羧甲基化多糖主要由Rha、Ara、Xyl、Man、Glc 和Gal 6 種單糖組成，修飾前、后物質(zhì)的量比（%）分別為0.26∶4.42∶0.35∶0.14∶0.16∶1 和0.93∶23.09∶1.08∶2.17∶0.68∶1，羧甲基化前、后，單糖類型無(wú)變化，表明羧甲基化修飾影響酸棗多糖的理化特性，然而并不改變其主要成分。通過(guò)對(duì)酸棗多糖進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)酸棗多糖在進(jìn)行羧甲基化修飾后，可去除多糖中雜質(zhì)。酸棗羧甲基化多糖的紅外光譜圖中除多糖特征峰外，在1 407.78 cm-1處還出現(xiàn)羧甲基化的特征吸收峰，表明羧甲基取代成功。通過(guò)測(cè)定酸棗多糖的總還原力、DPPH 自由基、羧甲基化自由基的清除能力，結(jié)果表明酸棗羧甲基化多糖具有良好的抗氧化能力。酸棗羧甲基化多糖還對(duì)益生菌（包括嗜酸乳桿菌和鼠李糖乳桿菌） 的生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用。