ISL1通過(guò)影響滋養(yǎng)細(xì)胞遷移、侵襲參與子癇前期的發(fā)生*

余 櫻 鄧 娜 雷 帝 郭玉萍 劉婷婷 龐慧源 范翠芳 ，#

子癇前期(Pre-Eclampsia，PE)是妊娠20周后以新發(fā)高血壓和蛋白尿?yàn)橹饕卣鞯亩嗯K器損害疾病。PE是造成孕產(chǎn)婦死亡的第二大原因，也是造成胎兒宮內(nèi)及新生兒出生后預(yù)后不良的重要原因[1, 2]。PE是一種胎盤源性疾病，目前公認(rèn)的發(fā)病機(jī)制是“兩階段”學(xué)說(shuō)，第一個(gè)階段為胎盤階段，是由于母體螺旋動(dòng)脈絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞(Extravillous Trophoblast，EVT)侵入不足，引起胎盤灌注減少，導(dǎo)致胎盤功能異常；第二個(gè)階段是胎盤功能異常釋放多種胎盤活性因子及抗血管生成因子進(jìn)入母體血液循環(huán)，使母體出現(xiàn)炎癥反應(yīng)過(guò)度激活和血管內(nèi)皮受損，最終導(dǎo)致血壓升高[3]。而胎盤的發(fā)育涉及絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞對(duì)子宮內(nèi)膜基質(zhì)的侵潤(rùn)、母-胎血液循環(huán)的建立、滋養(yǎng)層細(xì)胞內(nèi)分泌功能的維持等一系列時(shí)空事件，其中絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲不足是子宮螺旋動(dòng)脈重鑄不良引起PE發(fā)生的關(guān)鍵事件[4]。因此，EVT的侵襲行為及其調(diào)控機(jī)制是PE研究的重點(diǎn)。胰島素增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(Islet-1，ISL1)屬于LIM同源框蛋白家族, 是一種多效性轉(zhuǎn)錄因子，在正常組織中, ISL1參與心肌及尿道上皮的分化[5]、胰島細(xì)胞增殖[6]、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元發(fā)育[7]，許多研究表明ISL1的異常表達(dá)可能與腫瘤的發(fā)生及預(yù)后相關(guān)[8, 9]。引起PE的發(fā)病滋養(yǎng)細(xì)胞有與腫瘤細(xì)胞類似的生物學(xué)行為，如遷移、侵襲，故ISL1在子癇前期發(fā)病機(jī)制第一階段中的作用具有重要意義[10, 11]。本課題組先前的研究[12]發(fā)現(xiàn)PE胎盤mRNA表達(dá)譜與正常胎盤顯著不同，且ISL1基因可能參與PE的發(fā)生。本研究通過(guò)探索ISL1對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響，探討PE的發(fā)病機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 主要材料與試劑

ISL1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及siRNA購(gòu)自蘇州吉瑪基因，質(zhì)粒序列如下：過(guò)表達(dá)質(zhì)粒：pCDH-CMV-MCS-COpGFP-T2A-Puro-ISL1，空載質(zhì)粒：pCDH-CMV-MCS-COpGFP-T2A-Puro對(duì)照(NCBI注冊(cè)碼：NM-002202)，siRNA有3條，序列如下：gen OFFTM st-h-ISL-1-001：GCA TCA TGA TGA AGC AAC T，gen OFFTM st-h-ISL-1-002：GCT CCA AGG TGT ATC ACA T，OFFTM st-h-ISL-1-003：CCA GCC ACC TTG GAA AGT A；LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；ISL1抗體(ab109517)購(gòu)自Abcam，β-tublin(10094-1-AP)、 GF(19003-1-AP)、CK7抗體(17513-1-AP)購(gòu)自Proteintech，MMP2(WL01579a)抗體購(gòu)自Wanleibio，抗兔二抗(GB23303)購(gòu)自Servicebio；1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；逆轉(zhuǎn)錄PrimeScript RT試劑盒及SYBR Green試劑盒購(gòu)自日本Takara Bio，Inc.；Transwell 24孔板購(gòu)自康寧公司。

1.2 組織、細(xì)胞來(lái)源

從妊娠6至8周接受擇期手術(shù)終止妊娠的婦女中獲得早孕胎盤絨毛樣本6例(早孕組)，從足月分娩的婦女獲得孕晚期胎盤樣本[PE 3例(PE組)和正常孕婦3例(NP組)，兩組一般資料見(jiàn)表1]。胎盤收集及處理方法如下：剖宮產(chǎn)后按照無(wú)菌原則留取胎盤。從臍帶根部取下0.5×0.5×1cm的胎盤組織，在冰0.9%鹽水中清洗，立即冷凍并保存在-80℃，以便后續(xù)研究。另外在胎盤的母體表面和胎兒表面切下3-5塊組織，大小約1×1×0.3cm，并用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后常規(guī)切片(5μm)。本研究得到武漢大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有捐贈(zèng)胎盤的婦女均簽署知情同意書。 PE診斷符合美國(guó)婦產(chǎn)科學(xué)院(ACGO)要求，排除：多胎妊娠，妊娠糖尿病，HELLP綜合征(Hemolysis,Elevated Liver Enzymes, and Low Platelet Count Syndrome，溶血、肝酶升高及血小板減少綜合征)，胎兒畸形和其它慢性疾病。

表1 NP組和PE組婦女臨床資料比較

HTR8細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC序列號(hào)：CRL-3271)。

1.3 組織實(shí)驗(yàn)

1.3.1 蛋白質(zhì)印跡(Western Blot，WB)檢測(cè)胎盤ISL1蛋白表達(dá)水平：胎盤組織經(jīng)預(yù)冷PBS清洗三遍后，加入蛋白裂解液，使用勻漿器冰上充分研磨，加入預(yù)冷的蛋白裂解液，冰上裂解30min提取總蛋白，使用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。提取的蛋白進(jìn)行定量，取30μg進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠配置濃度為5%，分離膠配置為10%。后用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1h后，TBST洗膜三遍，每遍10min，將膜放入1∶1 000稀釋的相應(yīng)一抗中，4℃搖床過(guò)夜。次日將膜取出，TBST洗三遍，二抗1∶3 000稀釋后室溫孵育1h，TBST洗三遍，通過(guò)ECL化學(xué)發(fā)光液在凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行顯色并拍照記錄，以β-Tubulin為內(nèi)參蛋白，利用ImageJ軟件分析條帶，以目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值表示該蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.2 RT-PCR檢測(cè)胎盤ISL1 mRNA水平：用Trizol提取胎盤總RNA。然后進(jìn)行去基因組DNA操作：4μl 4×gDNA wiper mix，1μg模板RNA，用DEPC水將體系補(bǔ)足到16μl，普通PCR儀42℃ 2min；向反應(yīng)體系中加入4μl 5×HiScript II qRT SuperMix II，普通PCR儀50℃ 15min，85℃ 5 sec，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。配制RT-PCR體系：10μl 2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix，0.4μl正向引物，0.4μl反向引物，2μl模板cDNA，最后加入DEPC水將體系體積補(bǔ)充至20μl。使用CFX管理器系統(tǒng)進(jìn)行定量RT-PCR。ISL1引物序列如下：正向5'-GTT ACC AGC CAC CTT GGA AA-3'；反向5'-GGA CTG GCT ACC ATG CTG TT-3'。以β-actin作為內(nèi)參基因，使用2-ΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.3 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)ISL1蛋白表達(dá)：將胎盤組織切片脫蠟并在二甲苯和乙醇梯度中再水化，加入檸檬酸鹽緩沖液，于92-98℃的微波爐中煮沸15min。將切片依次與3%H2O2的甲醇溶液孵育10min，并在正常山羊血清中封閉20min。將切片與一抗在4℃下孵育過(guò)夜，然后與過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗共同孵育。染色后用立式熒光顯微鏡拍照。棕色為ISL1蛋白表達(dá)陽(yáng)性，藍(lán)紫色為細(xì)胞核。

1.3.4 免疫熒光染色檢測(cè)ISL1蛋白：參照免疫組織化學(xué)的過(guò)程，對(duì)早孕流產(chǎn)組織石蠟切片進(jìn)行脫蠟、梯度酒精復(fù)水等預(yù)處理后，用0.2%Triton X-100滲透切片，然后將含有0.5% BSA的PBS在室溫下封閉1h。將組織切片與一抗于4℃下孵育，該一抗包括抗ISL1抗體和抗CK7抗體。用PBS洗滌后，將切片與FITC、CY3二抗以及DAPI一起室溫孵育1-2h。染色后用立式熒光顯微鏡拍照，若標(biāo)本自發(fā)熒光，對(duì)照和特異性對(duì)照呈無(wú)熒光或弱熒光，陽(yáng)性對(duì)照和待檢標(biāo)本呈強(qiáng)熒光，判斷為特異性染色陽(yáng)性。

1.4 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組：將HTR8細(xì)胞在1640培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清和1%雙抗)中于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。根據(jù)制造商操作規(guī)程，在HTR8細(xì)胞中使用LipofectamineTM3000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 ISL1-SiRNA、對(duì)照SiRNA、ISL1過(guò)表達(dá)及空載質(zhì)粒，孵育48h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。分組如下：轉(zhuǎn)染SiRNA ISL1為ISL1-Si組(轉(zhuǎn)染序列g(shù)en OFFTM st-h-ISL-1-001為ISL1-Si-1組、轉(zhuǎn)染序列g(shù)en OFFTM st-h-ISL-1-002為ISL1-Si-2組、轉(zhuǎn)染序列g(shù)en OFFTM st-h-ISL-1-003為ISL1-Si-3組)，轉(zhuǎn)染對(duì)照siRNA為Si-control組；ISL1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒為ISL1-OE組，空載質(zhì)粒為VE組。

1.4.2 傷口愈合測(cè)定：將各組細(xì)胞接種至6孔板，細(xì)胞密度為達(dá)90% 后，用10μl移液管吸頭劃痕。將傷口刮擦記為0h，在12h、24h、48h時(shí)于相同位置拍攝。使用ImageJ軟件分析結(jié)果。

1.4.3 基質(zhì)膠測(cè)定細(xì)胞侵襲和跨孔遷移能力：采用Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲和遷移能力，在含基質(zhì)膠的Transwell插入物中進(jìn)行侵襲能力檢測(cè)，插入物孔徑為8μm的聚碳酸酯濾膜。細(xì)胞遷移能力檢測(cè)時(shí)，插入物未涂基質(zhì)膠。將細(xì)胞(4×105個(gè)/ml)加入200μl無(wú)血清培養(yǎng)基中，向下部室中加入600μl完全培養(yǎng)基。孵育24h后，用4%多聚甲醛固定，3%結(jié)晶紫染色，記錄每個(gè)插入物在5個(gè)隨機(jī)視野中的遷移細(xì)胞。侵襲細(xì)胞數(shù)則孵育48h后進(jìn)行上述操作。

1.4.4 WB檢測(cè)HTR8中ISL1蛋白表達(dá)水平：細(xì)胞轉(zhuǎn)染72h后棄去培養(yǎng)基后無(wú)菌預(yù)冷PBS洗三遍，余步驟同組織實(shí)驗(yàn)。

1.4.5 PT-RCR檢測(cè)HTR8中相關(guān)基因mRNA水平：操作步驟同組織實(shí)驗(yàn)，引物序列如表2。

表2 各基因引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 ISL1在胎盤中的表達(dá)

2.1.1 PE組和NP組胎盤組織中ISL1蛋白和mRNA水平比較：PE組胎盤中ISL1的蛋白和mRNA表達(dá)均顯著低于NP組(P<0.01)。見(jiàn)圖1和表3。

圖1 妊娠晚期胎盤組織中ISL1蛋白的表達(dá)(WB)

表3 PE組和NP組胎盤組織中ISL1蛋白和mRNA表達(dá)水平比較

2.1.2 ISL1在胎盤組織中的定位：ISL1在接近母體蛻膜側(cè)的一類巨核細(xì)胞中表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性，并且在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均表達(dá)，主要在細(xì)胞核中表達(dá)，根據(jù)解剖位置推測(cè)該細(xì)胞可能是蛻膜化的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞或EVT。見(jiàn)圖2。

注：從左到右依次顯示 ISL1 在漂浮絨毛、錨定絨毛和蛻膜組織中的表達(dá)，棕色為陽(yáng)性信號(hào)，藍(lán)紫色為細(xì)胞核

2.1.3 ISL1在早孕組織中的定位：滋養(yǎng)細(xì)胞標(biāo)志物為細(xì)胞角蛋白(Cytokeratin，CK)、間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物為波形蛋白(Vimentin)，免疫熒光染色結(jié)果顯示，ISL1主要在滋養(yǎng)細(xì)胞(圖3A)和血管內(nèi)皮細(xì)胞的核中表達(dá)。圖3B。

注：A，滋養(yǎng)細(xì)胞，紅色為ISL1，綠色為CK；B，血管內(nèi)皮細(xì)胞，紅色為ISL1，綠色為Vimentin

2.1.4 巨核細(xì)胞類型鑒定：絨毛膜外滋養(yǎng)細(xì)胞標(biāo)志物為人白細(xì)胞抗原-G(Human Leucocyte Antigen-G，HLA-G)，具有強(qiáng)ISL1表達(dá)的細(xì)胞是CK(+)Vimentin(-)HLA-G(+)，為EVT。見(jiàn)圖4。

圖4 ISL1在早孕流產(chǎn)組織中HLA-G、CK和Vimentin的表達(dá)(免疫熒光染色，×100)

2.2 HTR8細(xì)胞ISL1表達(dá)與以及各組侵襲和遷移能力

WB和RT-PCR證實(shí)，與Si-control組比較，ISL1-Si-1、-2、-3組ISL1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均降低(P<0.01)，且ISL1-Si-1組的敲除效率最高(84.70%，圖5)，因此后續(xù)選擇ISL1-Si-1組進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)。RT-PCR及WB結(jié)果顯示，與VE組比較，ISL1-OE組ISL1 mRNA和蛋白的表達(dá)均增加(圖6)。如表3所示，與Si-control組相比，ISL1-Si-1組傷口愈合實(shí)驗(yàn)遷移距離(t=6.61、14.20、22.24)、遷移細(xì)胞數(shù)(t=42.79)、侵襲細(xì)胞數(shù)(t=36.58)均較高(P<0.01)。與空載組(VE)相比，過(guò)表達(dá)組傷口愈合實(shí)驗(yàn)遷移距離(t=-21.04、—23.22，—37.58)、遷移細(xì)胞數(shù)(t=-48.04)、侵襲細(xì)胞數(shù)(t=-93.72)均較低(P<0.01)。

表3 ISL1改變對(duì)傷口愈合實(shí)驗(yàn)遷移距離和遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)的影響

注：與Si-control組比較 ，*P<0.01； 與ISL1-Si-1組比較，#P<0.05；與ISL1-Si-2組比較，△P<0.05

注：與ISL1-OE組比較，*P<0.05

2.3 ISL1基因?qū)ο掠伟谢虮磉_(dá)的影響

通過(guò)CHIP-Seq數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)鋅E-box蛋白1(ZEB1)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGFβ)，Wnt5a和GATA3(GATA Binding Protein 3)可能是ISL1的靶基因。如表3所示，與Si-control組比較ISL1-Si-1組和ISL1-Si-2組ZEB1和TGF-β的mRNA表達(dá)明顯降低，而Wnt5a和GATA3的表達(dá)無(wú)明顯改變。

表4 ISL1的下游基因的mRNA水平

3 討 論

本文結(jié)果表明，在PE患者的胎盤EVT中， ISL1的表達(dá)是明顯低于正常人，表明ISL1可能在PE的發(fā)展中起重要作用。故本實(shí)驗(yàn)選用HTR8/SVneo細(xì)胞系來(lái)探索ISL1在PE中的具體機(jī)制，ISL1表達(dá)下降后，HTR8/SVneo細(xì)胞的遷移及侵襲功能增強(qiáng)，而過(guò)表達(dá)后則減弱。目前被廣泛接受的PE病理機(jī)制表明，EVT分化的缺陷以及EVT的侵襲不足可能會(huì)促進(jìn)PE發(fā)展[17, 18]，這預(yù)示著ISL1在PE胎盤中的表達(dá)應(yīng)該增加，但在本實(shí)驗(yàn)中卻與PE患者妊娠晚期胎盤的結(jié)果相反。這可能是由于不同細(xì)胞對(duì)同一基因的應(yīng)答反應(yīng)存在差異，在一種組織中能促進(jìn)增殖的基因在另外一種組織中幾乎沒(méi)有任何作用，甚至抑制增殖[19]。但也有研究[20]表示ISL1的表達(dá)受時(shí)空限制，故ISL雖然在晚期胎盤中表達(dá)下調(diào)，但在早期可能是高表達(dá)的，但由于倫理局限，不能獲取到早期胎盤，故該猜測(cè)無(wú)從驗(yàn)證。

ISL1如何調(diào)節(jié)遷移、侵襲的機(jī)制尚不清楚。通過(guò)CHIP-Seq分析發(fā)現(xiàn)了ISL1的兩個(gè)潛在的靶基因ZEB1和TGFβ，而ZEB1和TGF-β是細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中的重要調(diào)節(jié)劑[21-25]。EMT是指上皮細(xì)胞通過(guò)特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程，這一過(guò)程會(huì)下調(diào)上皮細(xì)胞表達(dá)的粘附分子，使它們更易于遷移和侵襲[24]。滋養(yǎng)層細(xì)胞分為細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞(Cytotrophoblast，CTB)、合體滋養(yǎng)層細(xì)胞(Syncytiotrophoblast cells，STB)，CTB可分化STB覆蓋胎盤絨毛，直接參與胎盤的母胎界面形成，CTB也可分化為EVT, EVT錨定絨毛侵入蛻膜，將胎盤附著在子宮壁上成為血管內(nèi)絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞(Endovascular Extravillous Trophoblast，eEVT)，eEVT替換掉血管壁本身的部分內(nèi)皮細(xì)胞使螺旋動(dòng)脈的直徑增加5-10倍，形成“高流低阻”的重鑄血管，這一過(guò)程對(duì)胎盤的形成來(lái)說(shuō)至關(guān)重要[26]。當(dāng)CTB分化為EVT時(shí)，會(huì)發(fā)生一些分子變化，如金屬蛋白酶的分泌增加，它會(huì)破壞細(xì)胞外基質(zhì)，并使EVT遷移通過(guò)子宮內(nèi)膜[27]，E-鈣粘蛋白等上皮標(biāo)記物，波形蛋白和纖連蛋白等間質(zhì)標(biāo)記物以及基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2和MMP9也發(fā)生了變化，這個(gè)變化的過(guò)程即為EMT[28, 29]。CTB發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化為EVT這一過(guò)程異常可能會(huì)導(dǎo)致PE的發(fā)生。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，我們推測(cè)ISL1可能通過(guò)靶向ZEB1、TGF-β來(lái)影響滋養(yǎng)細(xì)胞的EMT而參與PE的進(jìn)展。

但是，本次研究也有其局限性。本文僅研究了ISL1在分娩后PE患者胎盤中的表達(dá)。但是，PE的根本原因是妊娠早期的胎盤形成過(guò)程障礙，直到妊娠中期和晚期才出現(xiàn)臨床表現(xiàn)。對(duì)于這項(xiàng)研究，收集早期胎盤顯然更合適。但是，由于倫理規(guī)范的限制和PE的低發(fā)生率，我們無(wú)法獲得這些樣本進(jìn)行研究。后期可能通過(guò)動(dòng)物模型來(lái)驗(yàn)證ISL1是否呈現(xiàn)一個(gè)妊娠早期高表達(dá)而后期低表達(dá)這樣一個(gè)動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。

總之，本研究表明，ISL1在遷移和侵襲的生物學(xué)功能中起著重要作用。ISL1可能通過(guò)靶向ZEB1或TGF-β來(lái)影響滋養(yǎng)層細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并參與子癇前期的發(fā)展。

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