近紅外熒光分子探針用于CT成像及術(shù)中導(dǎo)航

駱 杰，鐘世根，張 勇，凌智瑜，王志剛

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院超聲科，重慶 400042；2.重慶市人民醫(yī)院超聲科，重慶 400014； 3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科，重慶 400010；4.重慶醫(yī)科大學(xué)超聲分子影像研究所 重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400010)

精準(zhǔn)可視化腫瘤切除術(shù)中，定位腫瘤、確定切除邊緣及鑒別微小病灶均為影響預(yù)后的重要因素；光學(xué)分子影像手術(shù)導(dǎo)航技術(shù)在其中的應(yīng)用現(xiàn)已成為研究熱點(diǎn)[1-2]。光學(xué)成像技術(shù)中，近紅外熒光分子導(dǎo)航以熒光分子為探針進(jìn)行成像，相比普通光學(xué)成像,具有受生物組織影響小、組織穿透性強(qiáng)及信噪比高等優(yōu)勢(shì)[3-4]；但傳統(tǒng)熒光分子探針常依賴腫瘤血管的滯留與滲透效應(yīng)抵達(dá)腫瘤部位，腫瘤富集效率低下，用于增強(qiáng)顯像和術(shù)中導(dǎo)航效果欠佳[5]。本研究制備近紅外熒光分子探針，觀察其用于增強(qiáng)CT成像和術(shù)中導(dǎo)航的效果。

1 材料與方法

1.1 主要材料和設(shè)備 主要材料：二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-mPEG2000)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)(西安瑞禧生物技術(shù)公司)；膽固醇、IR780、吲哚菁綠(indocyanine green, ICG)、全氟溴辛烷(perfluorooctyl bromide, PFOB)(美國Sigma)；DiI(1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，4',6-二脒基-2-苯基吲哚，DAPI)(上海碧云天生物技術(shù)公司)。主要設(shè)備：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；聲振儀(Heat System Inc)，馬爾文粒徑儀(美國Zetasize)；光學(xué)顯微鏡(日本Olympus)；透射電鏡(H7500)；UV-2500紫外分光光度計(jì)(日本島津)；激光共聚焦顯微鏡(日本Nikon)；BD FACS Vantage 流式細(xì)胞儀；CT儀(GE)；活體熒光成像系統(tǒng)(美國PerkinElmer)；實(shí)時(shí)近紅外熒光成像系統(tǒng)(日本Nikon)。

1.2 制備IR780@LIP-PFOB 按12:5:3質(zhì)量比分別稱取DPPC、DSPE-mPEG2000、膽固醇共20 mg置于圓底燒瓶，加入1 mg IR780，以5 ml CHCl3充分溶解，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，于50℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至形成一層綠色薄膜；在超聲波作用下以4 ml磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)水化，直至綠色薄膜全部脫落，并移至10 ml EP管內(nèi)；加入200 μl PFOB，以100 W聲振儀處理2 min，離心后收集沉淀物，得到IR780@LIP-PFOB。重復(fù)上述制備過程，不加IR780，得到空白脂質(zhì)體(LIP-PFOB)；不加IR780，蒸發(fā)結(jié)束后以含1 mg ICG的PBS水化，其余步驟同前，制得載ICG的脂質(zhì)體(ICG@LIP-PFOB)。

1.3 構(gòu)建4T1荷瘤鼠模型 健康雌性BALB/c小鼠26只(購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；動(dòng)物許可證編號(hào)：430727220100738472)，4～6周齡，18～22 g。于背部皮下接種1×106處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4T1細(xì)胞(上海中喬新舟生物科技有限公司)，待腫瘤長(zhǎng)至100 mm3備用，造模成功21只。遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理進(jìn)行所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

1.4 檢測(cè)IR780@LIP-PFOB表征 以數(shù)碼相機(jī)拍攝LIP-PFOB和IR780@LIP-PFOB重懸液；在光學(xué)顯微鏡、透射電鏡下觀察IR780@LIP-PFOB形態(tài)、結(jié)構(gòu)，以馬爾文粒徑儀檢測(cè)其粒徑大小和表面電位。以紫外分光光度計(jì)檢測(cè)IR780、LIP-PFOB與IR780@LIP-PFOB吸收光譜，繪制IR780標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算IR780包封率。

1.5 CT成像 采集水與不同濃度IR780@LIP-PFOB(1、2、3、4、5 mg/ml)的CT圖像，參數(shù)：管電流160 mA，管電壓80 kV。對(duì)3只荷瘤鼠經(jīng)尾靜脈注射200 μl IR780@LIP-PFOB(5 mg/ml)，24 h后行CT成像及定量分析。

1.6 4T1細(xì)胞IR780@LIP-PFOB攝取率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期4T1細(xì)胞(1×105)接種于共聚焦培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)12 h，之后分別加入200 μl 0.1 mg/ml DiI標(biāo)記的LIP-PFOB和IR780@ LIP-PFOB，共孵育1 h。以激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞對(duì)LIP-PFOB與IR780@LIP-PFOB的攝取。

1.7 體內(nèi)IR780@LIP-PFOB分布 對(duì)3只荷瘤，經(jīng)尾靜脈注射IR780@LIP-PFOB(5 mg/ml，200 μl)，采用小動(dòng)物活體熒光成像儀采集注射24 h后的熒光圖，以熒光成像系統(tǒng)測(cè)量腫瘤區(qū)域注射前、后熒光強(qiáng)度值。處死荷瘤鼠，對(duì)心、肝、脾、肺及腎等臟器和腫瘤組織進(jìn)行離體熒光成像，對(duì)比注射前后腫瘤區(qū)域熒光強(qiáng)度變化。

1.8 術(shù)中導(dǎo)航 取9只荷瘤鼠隨機(jī)均分為3組，各經(jīng)尾靜脈注射IR780@LIP-PFOB(5 mg/ml，200 μl)、注射等劑量ICG@LIP-PFOB或無干預(yù)。24 h后麻醉動(dòng)物，行模擬手術(shù)，切開腫瘤表面皮膚、充分暴露腫瘤區(qū)域并留取照片，再以實(shí)時(shí)熒光成像系統(tǒng)觀察腫瘤組織并拍攝圖像與之前比較，并進(jìn)行定量分析。

1.9 腫瘤區(qū)IR780@LIP-PFOB分布 取6只荷瘤鼠隨機(jī)均分為2組，分別經(jīng)尾靜脈注射DiI標(biāo)記的IR780@LIP-PFOB或LIP-PFOB(5 mg/ml，200 μl)；24 h后處死荷瘤鼠，剝離瘤塊，以冰凍切片對(duì)比觀察腫瘤內(nèi)2種脂質(zhì)體的聚集。剝離腫瘤組織與周圍非瘤組織，行冰凍切片，經(jīng)DAPI染色后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核。

1.10 安全性評(píng)價(jià) 另取6只健康雌性BALB/c小鼠，4～6周齡，18～22 g，隨機(jī)均分為2組，經(jīng)尾靜脈注射200 μl IR780@LIP-PFOB(5 mg/ml)或無干預(yù)；7天后取血清分析肝、腎功能。

2 結(jié)果

2.1 表征 肉眼觀察，制備的IR780@LIP-PFOB為綠色懸濁乳液， LIP-PFOB呈白色乳糜樣(圖1A)；IR780@LIP-PFOB光鏡下呈大小均勻的圓粒(圖1B)，透射電鏡下為球形結(jié)構(gòu)，粒徑約250 nm(圖1C)，其平均粒徑為(262.80±117.60)nm(圖1D)，表面電位為(-20.10 ±6.38)mV(圖1E)。IR780@LIP-PFOB在790 nm出現(xiàn)波峰，與單獨(dú)IR780的峰值接近；LIP-PFOB在紫外可見光區(qū)域無最大吸收峰(圖1F)。

2.2 CT成像 體外CT成像顯示，CT信號(hào)隨IR780@LIP-PFOB濃度增高而加強(qiáng)，見圖2A、2B。體內(nèi)CT成像顯示，注射IR780@LIP-PFOB 24 h后腫瘤區(qū)CT值較注射前明顯增高(P<0.05)，見圖2C、2D。

2.3 細(xì)胞攝取 4T1細(xì)胞與IR780@LIP-PFOB共同孵育后，其周圍可見大量紅色熒光；而以LIP-PFOB處理后未見確切紅色熒光。4T1細(xì)胞對(duì)IR780@LIP-PFOB的攝取率為98.96%，對(duì)LIP-PFOB的攝取率為7.91%。見圖3。

2.4 IR780@LIP-PFOB體內(nèi)分布和術(shù)中導(dǎo)航 注射IR780@LIP-PFOB 24 h后可于荷瘤鼠腫瘤區(qū)探及橙色熒光(圖4A)。離體熒光成像顯示腫瘤熒光信號(hào)強(qiáng)于其他臟器組織(圖4B)，與注射前相比，腫瘤區(qū)熒光信號(hào)值明顯增強(qiáng)(P<0.05，圖4C)。術(shù)中導(dǎo)航時(shí)，注射IR780@LIP-PFOB前腫瘤區(qū)無熒光信號(hào)，注射后腫瘤區(qū)可見較強(qiáng)熒光信號(hào)，且邊界清晰(圖4D)；注射前腫瘤與周圍非瘤組織熒光強(qiáng)度比值為1.06±0.11，注射后為2.93±0.35(圖4E)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。注射ICG@LIP-PFOB后腫瘤區(qū)僅見弱熒光，與非瘤組織分界不清。

2.5 腫瘤內(nèi) IR780@LIP-PFOB分布 注射IR780@LIP-PFOB后，腫瘤周圍見大量紅色熒光富集(圖5A)，而注射LIP-PFOB后腫瘤內(nèi)僅見微弱紅色熒光(圖5B)。

2.6 安全性評(píng)價(jià) 對(duì)BALB/c鼠經(jīng)尾靜脈注射IR780@LIP-PFOB7天后，其肝腎功能未發(fā)生明顯改變，見圖6。

圖1 IR780@LIP-PFOB表征 A.IR780@LIP-PFOB和LIP-PFOB懸液外觀； B.IR780@LIP-PFOB光鏡圖； C.IR780@LIP-PFOB電鏡圖； D.IR780@LIP-PFOB粒徑分布圖； E.IR780@LIP-PFOB表面電位分布圖； F.LIP-PFOB、IR780與IR780@LIP-PFOB紫外吸收光譜圖

圖2 體內(nèi)外CT成像 A.水及不同濃度IR780@LIP-PFOB體外CT成像圖； B.不同濃度IR780@LIP-PFOB的體外CT值線性關(guān)系圖； C、D.BALB/c荷瘤鼠模型注射IR780@LIP-PFOB前及注射24 h后腫瘤區(qū)CT圖及CT值

圖3 4T1細(xì)胞攝取LIP-PFOB、IR780@LIP-PFO A.激光共聚焦顯微鏡圖； B.流式細(xì)胞儀檢測(cè)圖

圖4 IR780@LIP-PFOB體內(nèi)分布和術(shù)中導(dǎo)航所見 A.注射IR780@LIP-PFOB 24 h后4T1荷瘤鼠活體熒光成像圖； B.IR780@LIP-PFOB在各離體臟器和腫瘤內(nèi)的分布； C.注射IR780@LIP-PFOB前與注射24 h后腫瘤區(qū)熒光信號(hào)值；D.注射IR780@LIP-PFOB、ICG@LIP-PFOB前及注射24 h后腫瘤區(qū)照片及術(shù)中實(shí)時(shí)近紅外熒光成像； E.注射前與注射24 h后腫瘤熒光信號(hào)值與背景信號(hào)值比

3 討論

傳統(tǒng)上，醫(yī)學(xué)影像學(xué)主要可對(duì)腫瘤進(jìn)行術(shù)前評(píng)估和術(shù)后監(jiān)測(cè)，而在術(shù)中判斷腫瘤部位和邊界則主要依賴術(shù)者進(jìn)行視診和觸診，缺乏客觀評(píng)價(jià)。術(shù)中導(dǎo)航有助于定位腫瘤、確定于邊界而實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)切除，減少術(shù)后并發(fā)癥，提高患者術(shù)后生存率[6]。隨著分子影像學(xué)、尤其光學(xué)成像技術(shù)的發(fā)展，已可在外科手術(shù)中連續(xù)、實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)病灶部位，且與其他成像模式相比靈敏度極高[7]。為進(jìn)一步將高靈敏度的分子熒光成像技術(shù)用于術(shù)中導(dǎo)航等，需要引入同時(shí)具有高信噪比、高分辨率且能于腫瘤部位高效富集的熒光分子探針。ICG為目前臨床常用熒光探針，以廣泛用于探測(cè)乳腺癌前哨淋巴結(jié)及肝癌、胃腸道腫瘤和皮膚癌等術(shù)中導(dǎo)航[8-9]；但I(xiàn)CG只能通過被動(dòng)靶向到達(dá)腫瘤部位，富集效率較低，輔助定位腫瘤作用有限。

IR780是一種近紅外熒光染料，可在不添加其他配體的情況下通過糖酵解、細(xì)胞膜電位及有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)肽等介導(dǎo)而被腫瘤細(xì)胞高攝取，進(jìn)而在腫瘤部位高效富集[10-11]。CT密度分辨力高，組織結(jié)構(gòu)影像無重疊[12]。本研究設(shè)計(jì)并制備的裝載IR780和PFOB的近紅外熒光分子探針近紅外熒光性能良好，且可選擇性聚集于腫瘤區(qū)域。PFOB可充當(dāng)CT對(duì)比劑，改善脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)[13]；由此構(gòu)建的脂質(zhì)體也可作為新型CT分子探針，獲取更豐富的影像學(xué)資料。

圖5 病理圖示腫瘤內(nèi)IR780@LIP-PFOB分布 A.冰凍切片圖示腫瘤區(qū)域LIP-PFOB與IR780@LIP-PFOB分布； B.熒光顯微鏡圖示IR780@LIP-PFOB在腫瘤與周圍非瘤組織內(nèi)的分布(藍(lán)色為細(xì)胞核，紅色為DiI-IR780@LIP-PFOB)

圖6 BALB/c鼠經(jīng)尾靜脈注射IR780@LIP-PFOB后7天其肝腎功能

本研究將IR780裝載于磷脂雙分子層中，以提高其光穩(wěn)定性、增加其生物相容性。肉眼觀IR780@LIP-PFOB呈綠色懸濁乳液，而LIP-PFOB呈白色乳糜樣。該探針形態(tài)規(guī)則，大小均一，分散性好，粒徑分布呈正態(tài)分布。體外CT成像結(jié)果顯示， IR780@LIP-PFOB可顯著增強(qiáng)CT成像，并呈濃度依賴性；體內(nèi)結(jié)果證實(shí)其可有效到達(dá)腫瘤區(qū)域而用于腫瘤CT成像。

IR780@LIP-PFOB聚集于腫瘤區(qū)域是將其用于術(shù)中導(dǎo)航的前提和基礎(chǔ)。在不連接配體的情況下，傳統(tǒng)熒光顯影劑只能通過被動(dòng)靶向(腫瘤血管的滯留與滲透效應(yīng))到達(dá)腫瘤組織，富集效果較差。本研究制備的IR780@LIP-PFOB可在腫瘤區(qū)域富集，而在周圍非瘤組織中聚集較少，通過檢測(cè)IR780@LIP-PFOB的分布，可明確腫瘤邊界，為術(shù)中導(dǎo)航奠定基礎(chǔ)。體視熒光顯微鏡結(jié)果顯示，注射IR780@LIP-PFOB 24 h后，腫瘤區(qū)域在紅外成像系統(tǒng)下清晰可見，且邊界清楚；冰凍切片結(jié)果顯示，大量IR780@LIP-PFOB富集于腫瘤組織，而周圍非瘤組織較少聚集，其間分界明顯；且注射后7天小鼠肝、腎功未見明顯改變，初步證實(shí)了此探針的安全性。

總之，本研究成功制備的IR780@LIP-PFOB可增強(qiáng)CT成像效果并能用于術(shù)中導(dǎo)航。但本研究?jī)H針對(duì)鼠源性乳腺癌，所獲分子探針能否選擇性聚集于其他腫瘤并用于CT成像和術(shù)中導(dǎo)航有待后續(xù)進(jìn)一步觀察。