香葉木素對前列腺癌PC-3細胞生物學行為的影響

陳燦偉 范子文 黃帥 黃彥 瓦慶德 令狐熙濤 廖壯文

1廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院骨科（廣州 510000）；2遵義醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院骨科（貴州 遵義 563000）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是男性最常見的惡性腫瘤之一，前列腺癌骨轉移是晚期前列腺癌患者死亡的主要原因［1-2］。研究［3-5］發(fā)現(xiàn)90%的前列腺癌死亡患者均有發(fā)生不同程度的骨轉移，前列腺癌發(fā)生骨轉移后導致劇烈疼痛、骨折等嚴重影響患者的生存質量。晚期前列腺癌骨轉移的主要治療策略包括放療、化療和手術等方法，然而患者治療后平均中位生存時間僅3～5年，因此急需尋找新的治療藥物來改善患者的預后［6］。天然萃取的小分子化合物具有良好的生物活性和較低的毒性與副作用，是抗腫瘤藥物的重要來源之一，研究發(fā)現(xiàn)從多種天然藥物中提取的黃酮類生物化合物香葉木素具有抗炎、抗氧化、抗瘤等活性功能［7-8］。多項研究表明香葉木素可以通過誘導肺癌、肝癌及大腸癌等細胞的凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用，但在前列腺癌骨轉移中少有研究，其對前列腺癌細胞的影響有待闡明［9-11］。因此本研究以PC-3 為研究對象，探索香葉木素對非激素依賴性前列腺癌PC-3 細胞的影響，為其作為潛在的抗前列腺癌藥物提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料人前列腺癌PC-3 細胞株購于上海中科院細胞庫。香葉木素（純度≥98%）及DMSO 購于美國Sigma 公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、細胞因子B27、EGF、bFGF 均購自美國Gbico 公司；CCK8 試劑盒購自美國AbMole 公司；單克隆抗體Caspase、Bax、Bcl2、β-acting 均購自美國CST 公司；BCA 蛋白檢測試劑盒、ECL 發(fā)光液購于碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 藥物溶解香葉木素用DMSO 溶解成儲存液（儲存濃度為1 mg/mL），0.22 μm 過濾器除菌。

1.2.2 細胞增殖率測定將對數生長期的PC-3 細胞制成單細胞懸液并以每孔100 μL（密度4×103個/孔）接種至96 孔板，培養(yǎng)過夜細胞貼壁后，藥物組分別加入5、10、15、20、25 μg/mL 的香葉木素，對照組加入100 μL 培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后每孔加入100 μLCCK8 稀釋液（每孔含10 μL 試劑原液），孵育2 h 用酶標儀測定490 nm 波長處的吸光度，所有實驗設置5 個副孔并重復3 次。

1.2.3 細胞形態(tài)觀察將PC-3細胞懸液以每孔1 mL（密度1×104個/孔）接種至12 孔板，然后加入5、10 μg/mL 香葉木素，培養(yǎng)24 h 在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。

1.2.4 細胞克隆實驗將PC-3細胞（每孔1 000個）接種到6 孔板中，貼壁后加入5、10 μg/mL 香葉木素處理24 h。然后棄去培養(yǎng)基更換新鮮培養(yǎng)基，每3 天更換一次培養(yǎng)基并維持14 d。待2 周后用預冷的4%多聚甲醛固定20 min，PBS 清洗2 次后用0.1%結晶紫染色20 min，最后拍照計數。

1.2.5 細胞Transwell遷移實驗將PC-3細胞（每孔1×105個）接種到6孔板中，貼壁后加入5、10 μg/mL香葉木素處理24 h。用無血清培養(yǎng)基將收集的細胞制成懸液后計數，并以5×104的密度接種至24 孔Transwell 上室中，下室加入含30%血清的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h 后4%多聚甲醛固定20 min，PBS清洗2 次再用0.1%結晶紫染色15 min，拍照后隨機選擇5 個視野計數。

1.2.6 細胞黏附實驗將PC-3細胞（每孔1×105個）接種到6 孔板中貼壁后加入5、10 μg/mL 香葉木素處理24 h，然后分別收集每組細胞計數，以6×103的密度接種到經FN 預處理24 h 的96 孔板中。培養(yǎng)3 h 后用PBS 洗滌細胞，然后用4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結晶紫染色20 min 后顯微鏡下觀察拍照，隨機選擇5 個視野計數。

1.2.7 細胞成球試驗將PC-3細胞（每孔1×105個）接種到6 孔板中，貼壁后加入5、10 μg/mL 香葉木素處理24 h，然后收集細胞并計數，以1×103的密度接種至24 孔超低粘附培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)14 d 后拍照，并在顯微鏡下計數腫瘤球的數量（直徑＞50 μm）。

1.2.8 Western blot 分析將PC-3 細胞（每孔5×105個）接種到100 mm 培養(yǎng)皿中，貼壁后加入5、10 μg/ml 香葉木素處理24 h，然后棄去培養(yǎng)基，并用預冷的PBS 沖洗2 次。加入含有PMSF 和RIPA的PBS 緩沖液提取總蛋白，使用BCA 法測定蛋白濃度。將蛋白樣品在12%的SDS-PAGE 中進行電泳2 h，然后用PVDF 膜電轉1.5 h，并在5%脫脂牛奶中封閉60 min。將封閉后的PVDF 膜放在相應的一抗（1∶1 000）中孵育過夜，水平搖床低速震蕩1 h 后TBST 洗膜液洗滌3 次，再放入相應的二抗（1∶2 000）中搖床低速震蕩1 h。二抗孵育完成后TBST 洗膜液洗滌3 次并使用ECL 檢測系統(tǒng)曝光條帶，實驗重復3 次。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 16.0 和GraphPad 6.0統(tǒng)計分析，計量資料表示為均數±標準差，比較用t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 香葉木素對PC-3 細胞活力的影響采用CCK8 法測定細胞增殖率，分別用5、10、15、20、25 μg/mL 的香葉木素處理PC-3 細胞24 h 后，細胞增殖率較對照組差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。香葉木素呈劑量效應抑制PC-3 細胞在體外增殖（圖1）。

圖1 香葉木素抑制PC-3 細胞的增殖Fig.1 Diosmetin inhibited PC-3 cell proliferation in vivo

2.2 香葉木素對PC-3細胞凋亡的影響根據CCK8結果，分別用5、10 μg/mL 的香葉木素處理PC-3 細胞24 h 后，鏡下觀察到PC-3 細胞形態(tài)從規(guī)則梭形變成圓形并出現(xiàn)細胞碎片（圖2A）。此外通過WB檢測凋亡相關基因Caspase 8、Bax 和抗凋亡基因Bcl-2 的表達，香葉木素能增加凋亡相關基因Caspase 8、Bax 的表達，而下調抗凋亡基因Bcl-2 表達（圖2B）。

圖2 香葉木素誘導PC-3 細胞發(fā)生凋亡（×100）Fig.2 Diosmetin induces apoptosis in PC-3 cells（×100）

2.3 香葉木素對PC-3 細胞集落形成的影響采用克隆形成實驗測定香葉木素對PC-3 細胞集落形成能力的影響，分別用5、10 μg/mL 的香葉木素處理PC-3 細胞24 h 再培養(yǎng)14 d 后，香葉木素能抑制PC-3 細胞集落形成能力（P＜0.05），見圖3。

圖3 香葉木素抑制PC-3 細胞的集落形成能力Fig.3 Diosmetin inhibited the colony forming ability of the PC-3 cells

2.4 香葉木素對PC-3 細胞遷移的影響采用Transwell 實驗檢測細胞的遷移變化，香葉木素處理PC-3 細胞后的細胞遷移能力顯著低于對照組 （P＜0.01），見圖4。

圖4 香葉木素抑制PC-3 細胞的遷移（×100）Fig.4 Diosmetin inhibited migration of PC-3 cells（×100）

2.5 香葉木素對PC-3 細胞黏附的影響采用FN黏附實驗檢測PC-3 細胞的黏附能力，用香葉木素處理PC-3 細胞24 h 后，處理組細胞黏附能力顯著低于對照組（P＜0.01）。

2.6 香葉木素對PC-3 細胞成球的影響采用懸浮培養(yǎng)檢測細胞成球能力，用香葉木素處理PC-3細胞24 h 后再懸浮培養(yǎng)14 d 后，結果所示處理組PC-3 細胞成球能力顯著低于對照組（P＜0.01）。

3 討論

細胞凋亡與增殖之間的失衡是腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關，腫瘤細胞能抵抗和逃避藥物誘導的凋亡效應是惡性腫瘤耐藥的主要機制之一，因此抑制腫瘤細胞的增殖與誘導其凋亡是治療腫瘤的重要策略［12-14］。天然藥用植物提取的小分子藥物單體具有良好的生物活性、低毒副作用等優(yōu)點，是一種重要的抗腫瘤藥物來源之一，香葉木素作為一種具有多重抗瘤功能活性的黃酮類化合物，通常與誘導細胞凋亡有關。AL-ABD 等［15］發(fā)現(xiàn)香葉木素通過促進細胞周期停滯在G2/M 期顯著抑制肝癌細胞增殖，并抑制Bcl-2、cyclinB1 的表達促進細胞凋亡。CHOI 等［16］發(fā)現(xiàn)香葉木素可抑制B16F10腫瘤細胞的增殖、遷移和誘導細胞凋亡，并能下調血管生成素2 和周細胞覆蓋率有效抑制HUVEC細胞遷移和血管形成。本研究首先應用CCK-8 法檢測了不同濃度的香葉木素對PC-3 細胞增殖能力的影響，結果發(fā)現(xiàn)香葉木素以濃度梯度顯著抑制PC-3 細胞的增殖，結果提示香葉木素能抑制PC-3細胞的生長。

圖5 香葉木素抑制PC-3 細胞黏附（×100）Fig.5 Diosmetin inhibited PC-3 cells adhesion（×100）

圖6 香葉木素抑制PC-3 細胞球體形成（×50）Fig.6 Diosmetin inhibited PC-3 cells sphere formation（×50）

半胱天冬酶（caspase）是一類含有半胱氨酸水解酶的蛋白家族，由caspase-2、8、9 和10 等組成，在誘導細胞凋亡、轉導和放大胞內凋亡信號過程中發(fā)揮關鍵作用，caspase-8 是外部凋亡信號通路的關鍵啟動分子，激活caspase-8 酶活性能促進細胞發(fā)生凋亡［17-18］。此外在細胞內，Bcl 蛋白家族被認為是細胞凋亡過程中主要的內源性調節(jié)因子，B 淋巴細胞瘤-2 基因（Bcl-2）可抑制細胞凋亡，而Bcl-2 相關的X 基因（Bax）則促進細胞凋亡，Bcl2 與Bax 的比例與細胞凋亡發(fā)生有關［19-20］。在增殖結果的基礎上，用不同濃度的香葉木素繼續(xù)培養(yǎng)PC-3 細胞，然后通過顯微鏡觀察細胞的形態(tài)變化，觀察到香葉木素處理PC-3 細胞24 h 后，PC-3 細胞形態(tài)從規(guī)則的梭形變成透明圓形并出現(xiàn)碎片，貼壁數量明顯減少。此外，還檢測了香葉木素處理對PC-3 細胞中凋亡相關蛋白caspase-8、Bcl-2 和Bax 蛋白表達的影響，結果顯示香葉木素以劑量依賴性方式提高促凋亡相關基因Caspase 8、Bax 的表達，同時下調抗凋亡基因Bcl-2 的表達，提示香葉木素通過調節(jié)caspase-8、Bcl-2 和Bax 的表達誘導PC-3 細胞發(fā)生凋亡。

腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSCs）是一群具有干細胞特征的癌細胞亞群，參與腫瘤復發(fā)、轉移和耐藥等進展過程［21］。YUAN 等［22］發(fā)現(xiàn)DANCR可通過激活β-catenin 通路而促進肝癌細胞HCC 的干細胞特性，從而增加腫瘤的侵襲和轉移。SANG等［23］研究表明在ID2 蛋白正向調節(jié)膠質母細胞瘤中HIF-α 的活性，當ID2 蛋白被Thr27 磷酸化后，HIF-α 表達不穩(wěn)定從而使神經膠質母細胞瘤干性消失，腫瘤的生長被顯著抑制。腫瘤的轉移和侵襲是一個極其復雜的過程，除了CSCs 參與外，還包括腫瘤細胞向遠處遷移并黏附于定植部位等特點［24］。體外實驗還發(fā)現(xiàn)香葉木素呈劑量依賴性方式抑制PC-3 細胞的成球能力、集落形成能力等干細胞特性。此外，香葉木素以劑量依賴性方式抑制PC-3 細胞的黏附能力和遷移能力，這些結果表明香葉木素在體外可影響PC-3 細胞的干細胞特性及遷移能力。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)香葉木素能抑制非激素依賴性前列腺癌PC-3 細胞的增殖并促進其凋亡，且還顯著抑制PC-3 細胞的干細胞特性及遠處轉移能力，上述實驗結果顯示香葉木素在體外具有較好的抗前列腺癌活性。目前尚未探討其發(fā)揮抑制前列腺癌生長與轉移作用的潛在機制和體內抑瘤效果，因此在下一步研究中將會重點研究其抑制前列腺癌生長與轉移作用的詳細機制，并通過體內實驗進一步驗證其抗瘤活性，為香葉木素用于臨床治療前列腺癌及其骨轉移瘤提供充分的實驗依據。