基于EST-SSR標(biāo)記的青榨槭天然種群遺傳多樣性分析

穆 瑩， 張夢璐， 白云海， 張睿鸝， 鄭 健， 竇德泉

(北京農(nóng)學(xué)院園林學(xué)院 城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實驗室， 北京 102206)

青榨槭(AcerdavidiiFranch.)隸屬于槭樹科(Aceraceae)槭屬(AcerLinn.)，為落葉喬木，該種生長迅速，樹冠整齊，樹姿優(yōu)美，樹皮呈蛙綠色，葉片在秋季可變?yōu)辄S色、紅色或橙色，具有極佳的觀賞價值，是城市園林綠化的優(yōu)良樹種[1]。此外，青榨槭還具有葉片富含蛋白酶、材質(zhì)優(yōu)良等特點，具有一定的經(jīng)濟價值和醫(yī)用價值[2,3]。然而，由于青榨槭存在天然生境遭到人為破壞和自身更新困難等問題，其遺傳多樣性面臨巨大危機。目前，關(guān)于青榨槭天然種群遺傳多樣性的研究報道甚少，僅He等[4]利用青榨槭葉綠體基因組開發(fā)出20對SSR引物，并對陜西7個青榨槭種群的遺傳多樣性進行了分析。因此，亟需對青榨槭遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進行系統(tǒng)研究，這對其遺傳多樣性保護策略的制定具有重要意義。

微衛(wèi)星標(biāo)記(microsatellite marker)又稱簡單重復(fù)序列標(biāo)記(simple sequence repeat, SSR)，廣泛分布于真核生物基因組的編碼區(qū)和非編碼區(qū)[5]，具有共顯性、多態(tài)性高、對DNA要求不嚴(yán)格、重復(fù)性好及符合孟德爾遺傳規(guī)律等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性分析、比較作圖、瀕危物種保護、品種鑒定及種質(zhì)資源保存等方面研究[6-9]。EST-SSR標(biāo)記是基于表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tag，EST)開發(fā)的一種新型分子標(biāo)記，在同科不同屬或同屬不同種間具有良好的通用性，被廣泛應(yīng)用于植物基因組學(xué)研究[10-13]。

鑒于此，本研究利用28對多態(tài)性穩(wěn)定、條帶清晰的EST-SSR引物對北京、河南、陜西、廣東和浙江5個地區(qū)的青榨槭8個天然種群231株樣株的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進行了系統(tǒng)分析，以期為青榨槭天然種群的遺傳多樣性保護及該遺傳資源的開發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

根據(jù)青榨槭在中國的實際分布情況，選取北京、河南、陜西、廣東和浙江的青榨槭8個天然種群作為研究對象，共采集231株樣株的完整葉片，各種群的地理分布和樣株數(shù)見表1。其中，北京天池峽谷和陜西南五臺山地質(zhì)公園2個種群的葉片樣本于2019年10月采集；北京白羊溝自然風(fēng)景區(qū)、北京三岔萬澗、北京黃柏寺村、河南嵩山地質(zhì)公園和廣東南嶺國家森林公園5個種群的葉片樣本于2020年10月采集；浙江西天目山森林公園種群的葉片樣本于2020年11月采集。樣本采集時保證樣株間距在30 m以上，每個種群采集30株以上，樣株數(shù)量少于30株的種群則采集種群中的全部樣株。采集樣株頂部枝條上的健康、無病蟲害的完整嫩葉，置于裝有硅膠的塑封袋中保存并帶回實驗室。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取和質(zhì)量檢測 使用CTAB植物基因組DNA快速提取試劑盒(北京愛博森生物科技有限公司)提取每株樣株的基因組DNA。使用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA樣品的完整性，使用ND-1000超微量分光光度計(美國NanoDrop公司)檢測基因組DNA樣品的濃度和純度，并將DNA質(zhì)量濃度稀釋至50 ng·μL-1后，置于-20 ℃冰箱中保存、備用。

1.2.2 PCR擴增條件及擴增結(jié)果檢測 以每株樣株的基因組DNA為模板，使用28對多態(tài)性穩(wěn)定且擴增條帶清晰的EST-SSR引物(表2)進行PCR擴增。

表1 青榨槭8個天然種群的地理分布和樣株數(shù)

表2 用于青榨槭8個天然種群樣株基因組DNA擴增反應(yīng)的引物序列

所有擴增反應(yīng)均使用S1000 PCR儀(美國ABI公司)完成，擴增體系總體積10.00 μL，包括基因組DNA樣品1.00 μL、2×Taq Master Mix for PAGE(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)5.00 μL、10 μmol·L-1正向和反向引物各0.25 μL、ddH2O 3.50 μL。擴增程序為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、相應(yīng)退火溫度下退火30 s、72 ℃延伸45 s，共32個循環(huán)；最后，72 ℃延伸10 min。

使用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果，檢測完畢后將擴增產(chǎn)物轉(zhuǎn)交北京睿博興科生物技術(shù)有限公司進行毛細(xì)管電泳檢測分析，檢測儀器為ABI3730基因測序儀(美國ABI公司)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Genemarker Version 2.2.0軟件讀取SSR熒光標(biāo)記片段大小，統(tǒng)計每個樣本的基因型，據(jù)此構(gòu)建231個樣本的基因型數(shù)據(jù)庫。利用POPGENE 32軟件計算觀測等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、觀測雜合度、期望雜合度、Shannon’s多樣性指數(shù)、Nei’s基因多樣性指數(shù)、基因流、遺傳分化系數(shù)、遺傳距離和遺傳相似系數(shù)。利用GenAlEx 6.5軟件進行Mantel檢驗，分析種群間遺傳距離與地理距離的相關(guān)性，并進行分子方差分析(AMOVA)，計算種群內(nèi)及種群間的遺傳變異貢獻(xiàn)率。利用Cervus Version v3.0.7軟件計算多態(tài)性信息含量?；谶z傳距離、利用NTSYS-pc2.1軟件對供試種群進行UPGMA聚類分析和繪圖。利用STRUCTURE 2.3.4軟件對供試種群進行分組和遺傳結(jié)構(gòu)分析，其中，遺傳結(jié)構(gòu)分析采用混合模型與等位基因相關(guān)模型，具體參數(shù)如下：分組K設(shè)為1～8，每個K值重復(fù)運算20次，將馬爾科夫鏈蒙特卡羅(MCMC)和burn-in均設(shè)為100 000。運行結(jié)束后，將結(jié)果壓縮(zip文件)并上傳到Structure Harvester網(wǎng)站(http:∥taylor0.biology.ucla.edu/structureHarvester/)上，計算ΔK，得到最佳分組的K值。

2 結(jié)果和分析

2.1 青榨槭天然種群的遺傳多樣性分析

基于28對EST-SSR引物對青榨槭8個天然種群基因組DNA的擴增結(jié)果，供試青榨槭天然種群的遺傳多樣性分析結(jié)果見表3。

由表3可見：廣東南嶺國家森林公園(P7)種群和浙江西天目山森林公園(P8)種群的觀測等位基因數(shù)為4，其余6個種群的觀測等位基因數(shù)均為3，供試種群觀測等位基因數(shù)的均值為3.2。P7種群的有效等位基因數(shù)最多，為1.8；北京黃柏寺村(P4)種群的有效等位基因數(shù)次之，為1.7；北京天池峽谷(P3)種群和P8種群的有效等位基因數(shù)最少，僅為1.5；其余4個種群的有效等位基因數(shù)均為1.6；供試種群有效等位基因數(shù)的均值也為1.6。

由表3還可見：P4種群的觀測雜合度最低(0.197 6)，P7種群的觀測雜合度最高(0.298 9)，供試種群觀測雜合度的均值為0.237 9；P8種群的期望雜合度最低(0.244 4)，P7種群的期望雜合度最高(0.307 7)，供試種群期望雜合度的均值為0.276 9；河南嵩山地質(zhì)公園(P5)種群的Shannon’s多樣性指數(shù)最低(0.441 5)，P7種群的Shannon’s信息指數(shù)最高(0.599 9)，供試種群Shannon’s多樣性指數(shù)的均值為0.512 7；P5種群的Nei’s基因多樣性指數(shù)最低(0.240 1)，P7種群的Nei’s基因多樣性指數(shù)最高(0.302 8)，供試種群Nei’s基因多樣性指數(shù)的均值為0.271 9；P5種群的多態(tài)性信息含量最低(0.214 8)，P7種群的多態(tài)性信息含量最高(0.276 0)，供試種群多態(tài)性信息含量的均值為0.243 6。

表3 基于EST-SSR引物擴增結(jié)果青榨槭8個天然種群的遺傳多樣性分析

整體來看，在供試種群中，P7種群的遺傳多樣性最高，P5種群的遺傳多樣性最低，且各種群的不同遺傳多樣性指標(biāo)存在一定差異。例如：基于Shannon’s多樣性指數(shù)進行排序，供試種群的遺傳多樣性從大到小依次為P7種群、P4種群、北京白羊溝自然風(fēng)景區(qū)(P1)種群、陜西南五臺地質(zhì)公園(P6)種群、P8種群、北京三岔萬澗(P2)種群、P3種群、P5種群；基于Nei’s基因多樣性指數(shù)進行排序，供試種群的遺傳多樣性從大到小依次為P7種群、P4種群、P1種群、P6種群、P2種群、P3種群、P8種群、P5種群。

2.2 青榨槭天然種群的遺傳分化和遺傳結(jié)構(gòu)分析

分子方差分析(AMOVA)結(jié)果表明：青榨槭8個天然種群間的遺傳分化系數(shù)為0.334 5，種群間基因流為0.508 8，種群內(nèi)遺傳變異貢獻(xiàn)率為66.55%，而種群間遺傳變異貢獻(xiàn)率為33.45%。說明青榨槭天然種群的遺傳分化主要分布于種群內(nèi)。

青榨槭8個天然種群間的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離見表4。結(jié)果顯示：供試種群間的遺傳相似系數(shù)為0.584 3～0.960 3，其中，北京白羊溝自然風(fēng)景區(qū)(P1)種群與北京三岔萬澗(P2)種群間的遺傳相似系數(shù)最大，北京黃柏寺村(P4)種群與浙江西天目山森林公園(P8)種群間的遺傳相似系數(shù)最小。值得注意的是，廣東南嶺國家森林公園(P7)種群和P8種群與其余6個種群間的遺傳相似系數(shù)相對較低，但這2個種群間及其余6個種群間的遺傳相似系數(shù)卻較高。供試種群間的遺傳距離為0.040 5～0.537 3，其中，P1種群與P2種群間的遺傳距離最小，P4種群和P8種群間的遺傳距離最大。同樣，P7種群和P8種群與其余6個種群間的遺傳距離相對較大，而這2個種群間及其余6個種群間的遺傳距離卻較小。據(jù)此推斷青榨槭天然種群間的遺傳距離與地理距離呈正關(guān)聯(lián)。Mantel檢驗結(jié)果表明：各種群間的遺傳距離與地理距離呈極顯著正相關(guān)(R2=0.568 6，P=0.002)。

UPGMA聚類分析結(jié)果(圖1)顯示：在遺傳距離0.51處，供試的青榨槭8個天然種群被分成2個集群，其中，P1種群、P2種群、北京天池峽谷(P3)種群、P4種群、河南嵩山地質(zhì)公園(P5)種群和陜西南五臺地質(zhì)公園(P6)種群聚為一個集群，P7種群和P8種群聚為另一個集群。

使用STRUCTURE 2.3.4軟件對青榨槭8個天然種群的遺傳結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果(圖2)顯示：K=2時，ΔK值最大，遺傳結(jié)構(gòu)最清晰，說明供試青榨槭8個天然種群可劃分為2個集群。

表4 青榨槭8個天然種群間的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離

P1: 北京白羊溝自然風(fēng)景區(qū)Baiyanggou Natural Scenic Area of Beijing; P2: 北京三岔萬澗Sancha Wanjian of Beijing; P3: 北京天池峽谷Tianchi Canyon of Beijing; P4: 北京黃柏寺村Huangbaisi Village of Beijing; P5: 河南嵩山地質(zhì)公園Songshan Mountain Geopark of Henan; P6: 陜西南五臺地質(zhì)公園Nanwutai Geopark of Shaanxi; P7: 廣東南嶺國家森林公園Nanling National Forest Park of Guangdong; P8: 浙江西天目山森林公園West Tianmu Mountain Forest Park of Zhejiang.

P1: 北京白羊溝自然風(fēng)景區(qū)Baiyanggou Natural Scenic Area of Beijing; P2: 北京三岔萬澗Sancha Wanjian of Beijing; P3: 北京天池峽谷Tianchi Canyon of Beijing; P4: 北京黃柏寺村Huangbaisi Village of Beijing; P5: 河南嵩山地質(zhì)公園Songshan Mountain Geopark of Henan; P6: 陜西南五臺地質(zhì)公園Nanwutai Geopark of Shaanxi; P7: 廣東南嶺國家森林公園Nanling National Forest Park of Guangdong; P8: 浙江西天目山森林公園West Tianmu Mountain Forest Park of Zhejiang.

3 討論和結(jié)論

3.1 青榨槭天然種群的遺傳多樣性

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，與青榨槭同屬的廟臺槭(A.miaotaienseP. C. Tsoong.)(Shannon’s多樣性指數(shù)為0.290 9，Nei’s基因多樣性指數(shù)為0.193 3)[14]、五小葉槭(A.pentaphyllumDiels)(Shannon’s多樣性指數(shù)為0.392 4，Nei’s基因多樣性指數(shù)為0.249 8)[15]和五角楓〔A.pictumsubsp.mono(Maxim.) H. Ohashi〕(Shannon’s多樣性指數(shù)為0.568 6，Nei’s基因多樣性指數(shù)為0.389 2)[16]的遺傳多樣性普遍較高。本研究中青榨槭8個天然種群的基因多樣性也較高，Shannon’s多樣性指數(shù)均值為0.512 7，Nei’s基因多樣性指數(shù)均值為0.271 9，明顯高于廟臺槭和五小葉槭的相應(yīng)指標(biāo)，但卻低于五角楓的相應(yīng)指標(biāo)。槭屬植物的遺傳多樣性水平較高可能與物種分布范圍廣有關(guān)[17]53,[18]。青榨槭是分布于華北、華東、中南和西南各省份的廣布種，地理分布范圍廣和風(fēng)媒傳播的特性可能是其遺傳多樣性水平較高的重要原因[17]53,[18]。

本研究中，廣東南嶺國家森林公園種群的遺傳多樣性水平最高，河南嵩山地質(zhì)公園種群的遺傳多樣性水平最低。植物種群的遺傳多樣性可能與自然環(huán)境中種群的大小或個體密度等有關(guān)[17]5,[18]。筆者在野外調(diào)查時發(fā)現(xiàn)，廣東南嶺國家森林公園種群中青榨槭個體數(shù)量最多，且該種群的人為干擾較少，生境完整；而河南嵩山地質(zhì)公園種群中青榨槭個體數(shù)量較少，受人為干擾影響，該種群的生境遭到嚴(yán)重破壞，種群內(nèi)的青榨槭個體呈片段化分布狀態(tài)。據(jù)此推測種群個體數(shù)量多、人為干擾較少、生境完整是廣東南嶺國家森林公園種群遺傳多樣性高的重要原因。值得注意的是，本研究調(diào)查的青榨槭各天然種群的生境總體上受人為干擾較大，其天然種群呈片段化分布，種群規(guī)模較小。研究發(fā)現(xiàn)，種群片段化分布會迫使植物進行自交繁殖，而自交和近交繁殖勢必導(dǎo)致植物的遺傳多樣性下降[18]。據(jù)此認(rèn)為，青榨槭天然種群的遺傳多樣性有下降風(fēng)險，應(yīng)引起人們的重視。

3.2 青榨槭天然種群的遺傳分化和遺傳結(jié)構(gòu)

本研究結(jié)果顯示：青榨槭的遺傳分化主要存在于種群內(nèi)(種群內(nèi)遺傳變異貢獻(xiàn)率為66.55%)，而種群間的遺傳分化相對較小(種群間遺傳變異貢獻(xiàn)率為33.45%)，青榨槭的種群間遺傳變異貢獻(xiàn)率與同屬植物廟臺槭(41.54%)[14]和五小葉槭(37.22%)[15]的種群間遺傳變異貢獻(xiàn)率相近。本研究還發(fā)現(xiàn)，青榨槭種群間基因流僅0.508 8，明顯小于l，說明供試青榨槭8個天然種群間的基因交流較少。上述研究結(jié)果均可能與各青榨槭天然種群所處的地形地貌差異或地理距離較遠(yuǎn)有關(guān)。供試青榨槭8個天然種群間相距35～1 792 km，種群地分屬于秦嶺山脈、太行山山脈、燕山山脈和南嶺山脈，除太行山山脈與燕山山脈相連，其余山脈均片段化分布，據(jù)此推斷地理屏障也是造成青榨槭天然種群間基因交流困難的主要原因，導(dǎo)致青榨槭天然種群間的遺傳分化較為嚴(yán)重。另外，槭屬植物還存在花粉流不同期、種群間種子流難形成的問題[14-16]，也會造成種群間的基因交流較少，導(dǎo)致青榨槭的遺傳分化主要存在于種群內(nèi)的個體間。總體來看，供試青榨槭8個天然種群的觀測雜合度小于期望雜合度，表明供試青榨槭天然種群內(nèi)存在一定程度的自交或近交現(xiàn)象。

綜合聚類和遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果，供試青榨槭8個天然種群被分成2個集群，即廣東南嶺國家森林公園種群和浙江西天目山森林公園種群為一個集群，其余6個種群為另一個集群。Mantel檢驗結(jié)果表明：供試青榨槭8個天然種群間的遺傳距離與地理距離呈極顯著正相關(guān)。

3.3 青榨槭天然種群的保護策略

上述研究結(jié)果表明：雖然青榨槭天然種群的遺傳多樣性水平較高，但是各種群內(nèi)均存在一定程度的自交或近交現(xiàn)象，導(dǎo)致種群逐漸衰退，因此，應(yīng)加強對青榨槭天然種群的保護力度。相關(guān)部門既要重視對青榨槭各天然種群內(nèi)不同個體的保護，又要注重對不同種群的保護。廣東南嶺國家森林公園種群的遺傳多樣性水平最高，建議優(yōu)先保護。當(dāng)然，還要對各天然種群進行適當(dāng)?shù)娜斯じ深A(yù)(如人為促進種群間種子與花粉的傳播)，以減少種群內(nèi)植株的自交和近交現(xiàn)象。此外，還可以收集不同天然種群的種質(zhì)資源，選擇合適地點構(gòu)建種質(zhì)圃；開展青榨槭的引種栽培研究，使栽培資源能夠滿足市場需求，從而減少其野生資源被破壞。