血液透析對腎衰大鼠心功能的影響及機制研究*

張 培,朱新旺,孫亞南,穆中一

(1.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腎內科,沈陽 110000;2.遼寧省腫瘤醫(yī)院泌尿外科,沈陽 110000)

腎衰患者病死率高,45%～60%的死亡患者死因為心血管疾病,包括心臟結構改變、心力衰竭等[1-2]。研究表明,炎癥為腎衰患者發(fā)生心血管疾病的機制之一。血液透析為腎衰常用腎臟替代治療方式之一,可經(jīng)對流、彌散等方式進行物質交換,對體內代謝廢物進行清除,糾正酸堿、電解質失衡,提升心血管穩(wěn)定性[3-4]。此外,血液透析在緩解腎衰患者炎性反應、氧化應激中有一定價值,有利于保護心功能,增強右心室游離壁縱向收縮功能,但其作用機制尚不明確[5]。本研究通過建立腎衰大鼠模型,重點分析血液透析對腎衰大鼠心功能的影響,并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物

40只清潔級健康雄性SD大鼠,購自北京生物制品研究所有限責任公司,許可證號：SYXK(京)2016-0051。

1.1.2儀器與試劑

Toll樣受體4(TLR4)/核因子-κB(NF-κB)通路激動劑脂多糖(LPS，美國Sigma公司)；磷酸肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)試劑盒(北京利德曼生物技術有限公司)；白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；兔抗大鼠TLR4、p-NF-κB p65、NF-κB p65、caspase-3一抗(美國CST公司)；AK-200血液透析器(瑞典Gambro醫(yī)療器械公司)。

1.2 方法

1.2.1模型制備及分組

40只大鼠中取10只作為假手術組,其余30只制備腎衰大鼠模型[6]。大鼠麻醉后,于左側肋弓下0.5 cm、脊柱左旁1 cm處,作垂直于脊柱的切口,暴露左腎,結扎、縫合左腎動脈2/3分支,1周后將右腎摘除。建模4周后取尾靜脈血檢測肌酐、尿素氮水平高于假手術組(P<0.05),表示建模成功。30只大鼠建模成功24只,成功率80%。將24只大鼠隨機分為模型組、激動劑組、血液透析組,每組各8只,假手術組大鼠不結扎左腎動脈，其余步驟同上。

1.2.2動物干預

建模成功24 h后,血液透析組大鼠右股靜脈留置8 F雙腔靜脈導管,通過小兒專用動靜脈透析管路,連接血液透析器,透析面積0.7 m2。肝素抗凝,初始劑量50 U/kg,維持劑量25 U/(kg·h)。血液透析速度隨大鼠血壓變化而調整,維持55～90 mL/min,透析時間1 h，1周3次,持續(xù)3周。激動劑組血液透析方法同血液透析組,每次透析后,尾靜脈注射10 μg/mL LPS。假手術組和模型組以1.5 mL 0.9%氯化鈉溶液灌胃,每天1次,持續(xù)3周。

1.2.3心臟超聲檢查

治療結束后72 h,超聲檢測左心室舒張期末壓(LVEDP)、左心室收縮壓(LVSP)、左心室內壓最大上升速率(+dp/dtmax)、左心室內壓最大下降速率(-dp/dtmax)。

1.2.4腎功能指標檢測

處死大鼠,取下腔靜脈血,離心取上清液,采用全自動生化分析儀檢測肌酐和尿素氮水平。

1.2.5酶聯(lián)免疫法

取下腔靜脈血,離心,分離血清,采用全自動生化分析儀檢測CK、CK-MB水平。

1.2.6HE染色法

切取心肌組織置于4%多聚甲醛,浸蠟、包埋、切片,行HE染色,中性樹膠封片,光學顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.7ELISA法

取部分心肌組織,勻漿,離心取上清液,嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作。

1.2.8qRT-PCR法

取部分心肌組織,提取總RNA,逆轉錄為cDNA,進行RT-PCR反應,以β-actin為內參,2-ΔΔCT計算mRNA相對表達強度，引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.9Western blot法

取心肌組織,裂解,離心,取上清液,BCA法測定蛋白水平,上樣、電泳、濕轉、封閉后,各蛋白抗體(1∶500)4 ℃孵育過夜,二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h,ECL顯影,Image J分析條帶灰度值,目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值計算目的蛋白表達水平。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 心功能指標

與模型組比較,激動劑組和血液透析組LVEDP升高,LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax降低(P<0.05)；與激動劑組比較,血液透析組LVEDP升高,LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax降低(P<0.05),見表2。

表2 各組LVEDP、LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax比較

2.2 血清肌酐、尿素氮水平

與模型組比較,激動劑組和血液透析組肌酐、尿素氮水平降低(P<0.05)；與激動劑組比較,血液透析組肌酐、尿素氮水平降低(P<0.05),見表3。

表3 各組肌酐、尿素氮水平比較

2.3 血清CK、CK-MB水平

與模型組比較,激動劑組和血液透析組CK、CK-MB水平降低(P<0.05)；與激動劑組比較,血液透析組CK、CK-MB水平降低(P<0.05),見表4。

表4 各組CK、CK-MB水平比較

2.4 HE染色結果

模型組大鼠心肌細胞肥大,細胞核溶解、碎裂,心肌纖維排列紊亂,大量炎癥細胞浸潤；激動劑組和血液透析組大鼠肌纖維、肌外膜完整性及心肌細胞肥大、炎癥細胞浸潤均有所改善,見圖1。

圖1 各組大鼠心肌細胞形態(tài)變化比較(HE×400)

2.5 ELISA檢測結果

與模型組比較,激動劑組和血液透析組IL-6、TNF-α、IL-1β水平降低(P<0.05)；與激動劑組比較,血液透析組IL-6、TNF-α、IL-1β水平降低(P<0.05),見表5。

表5 各組IL-6、TNF-α、IL-1β水平比較

續(xù)表5 各組IL-6、TNF-α、IL-1β水平比較

2.6 PCR檢測結果

與模型組比較,激動劑組和血液透析組TLR4、caspase-3 mRNA相對表達量降低(P<0.05)；與激動劑組比較,血液透析組TLR4、caspase-3 mRNA相對表達量降低(P<0.05)。各組NF-κB p65 mRNA相對表達量組間比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表6。

表6 各組TLR4、NF-κB p65、caspase-3 mRNA相對

2.7 Western blot法檢測結果

與模型組比較,激動劑組和血液透析組TLR4、p-NF-κB p65、caspase-3 蛋白相對表達量及p-NF-κB p65/NF-κB p6降低(P<0.05)；與激動劑組比較,血液透析組TLR4、p-NF-κB p65、caspase-3 蛋白相對表達量及p-NF-κB p65/NF-κB p6降低(P<0.05)。各組NF-κB p65 蛋白相對表達量組間比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見圖2、表7。

圖2 心肌組織TLR4、p-NF-κB p65、NF-κB p65、caspase-3 蛋白灰度值比較

表7 各組TLR4、p-NF-κB p65、NF-κB p65、caspase-3蛋白相對表達量及p-NF-κB p65/NF-κB p65比較

3 討 論

目前,腎衰患者心功能損傷具體機制尚不明確,其中,炎癥為腎衰患者發(fā)生心血管疾病的獨立危險因素[7]。血液透析屬于血液凈化技術的一種,可減輕炎性反應、氧化應激反應[8]。目前,國內尚無腎衰大鼠血液透析的相關報道。

章穎虹[9]研究認為血液透析與心功能指標、炎癥狀態(tài)有一定相關性。此外,血液透析還被證實能通過對心血管相關蛋白結合毒素進行清除,發(fā)揮保護心血管作用[10]。本研究結果顯示,血液透析可促使大鼠LVEDP升高,LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax、血肌酐、尿素氮、CK、CK-MB及心肌組織IL-6、TNF-α、IL-1β水平下降；病理學分析發(fā)現(xiàn),血液透析可改善大鼠心肌纖維、肌外膜完整性,減輕心肌細胞肥大、炎性細胞浸潤,這說明血液透析可保護腎衰大鼠心功能,減輕炎性反應,減少心肌損傷。

TLR4是一種信號轉導受體蛋白,與免疫炎性反應密切相關,在巨噬細胞、內皮細胞、心肌細胞內廣泛表達,可啟動氧化應激、炎性反應[11]。TLR4激活后可通過髓樣分子依賴途徑,對下游NF-κB進行激活,介導下游炎癥級聯(lián)反應,導致IL-6、TNF-α、IL-1β等大量炎癥因子分泌、釋放,促進心肌細胞凋亡[12]。而心肌細胞凋亡在心功能損傷中也發(fā)揮重要作用,且由相關基因調控,其中caspase家族較常見[13]。本研究結果顯示,血液透析可抑制TLR4、p-NF-κB p65、caspase-3 蛋白相對表達量并降低p-NF-κB p65/NF-κB p65,且經(jīng)應用TLR4/NF-κB通路激動劑進一步驗證,這提示血液透析可抑制TLR4/NF-κB信號通路,這可能是血液透析發(fā)揮大鼠心功能保護作用的機制之一。

綜上所述,血液透析可減輕腎衰大鼠腎損傷及炎性反應,保護心功能,并可能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路發(fā)揮作用。由于本研究涉及的樣本量較少,今后仍需進一步擴大樣本量,進行后續(xù)實驗分析。