油莎豆抗旱基因CeDREB2.1的克隆與功能分析

柴乖強(qiáng)，秦媛媛，康雨欣，黃 凡，段義忠，亢福仁

(1. 榆林學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，陜西 榆林 719000；2. 陜西省陜北礦區(qū)生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 榆林 719000)

隨著全球氣候逐年變暖，越來(lái)越多的植物正遭受著干旱、高熱、高鹽等非生物逆境脅迫[1]。非生物脅迫可引發(fā)植物體多種形態(tài)生理變化，如葉片萎蔫、葉片脫落、相對(duì)含水量(RWC)降低、葉綠素含量和膜穩(wěn)定性降低、電解質(zhì)滲漏增加和活性氧(ROS)的產(chǎn)生等[2-3]。植物在受到逆境脅迫時(shí)，從周圍環(huán)境感知信號(hào)并適當(dāng)?shù)赝ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，建立相應(yīng)的防御機(jī)制[4]。轉(zhuǎn)錄因子能夠結(jié)合到特定順式作用元件，激活并調(diào)節(jié)下游大量基因表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)了植物對(duì)脅迫環(huán)境的耐受性。一般來(lái)說(shuō)，植物的抗旱性是由多個(gè)基因調(diào)控的復(fù)雜性狀，單個(gè)抗旱基因在植物抗旱過(guò)程中所起的作用比較有限[5]，而利用轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控其下游抗旱相關(guān)功能基因來(lái)提高植物抗旱性已經(jīng)是目前研究的熱點(diǎn)之一[6-7]。到目前為止，在植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多重要的抗旱性基因。其中，干旱響應(yīng)元件結(jié)合蛋白(Dehydration responsive element binding protein，DREB)家族存在于多種植物中，并在增強(qiáng)植物對(duì)各種非生物脅迫(包括干旱脅迫)的耐受性方面發(fā)揮著重要作用，DREB可以特異性地與啟動(dòng)子中的DREB/CRT順式作用元件結(jié)合，激活逆境相關(guān)基因的表達(dá)，提高作物的抗性[8]。

研究發(fā)現(xiàn)，DREB轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與調(diào)控生物和非生物脅迫應(yīng)答以及ABA響應(yīng)敏感性等各種反應(yīng)。其中利用DREB2亞家族轉(zhuǎn)錄因子改良植物抗逆性也取得理想的效果。比如在模式作物水稻中過(guò)量表達(dá)OsDREB2A和OsDREB2B能顯著增強(qiáng)水稻對(duì)干旱、鹽堿和高溫環(huán)境的耐受性[9]。

油莎豆(Cyperusesculentus)又名虎堅(jiān)果、油莎草、洋地栗和鐵荸薺等[10]，原產(chǎn)地是非洲尼羅河沿岸地區(qū)。油莎豆是一年生的塊莖類植物，屬于莎草科莎草屬[11]。油莎豆?fàn)I養(yǎng)豐富，是一種優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、綜合利用價(jià)值高的油、糧、飼、藥多用新型經(jīng)濟(jì)作物，產(chǎn)量遠(yuǎn)高于其他油料作物，號(hào)稱“油料之王”。油莎豆具有較強(qiáng)的抗旱、耐瘠、耐鹽堿等特性，其對(duì)生長(zhǎng)條件的要求不嚴(yán)格，甚至可以在沙漠荒地、鹽堿地和灘涂地上生長(zhǎng)，因此成為研究植物抗逆性的理想材料。當(dāng)前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于油莎豆的研究主要集中在栽培技術(shù)、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)分析、加工工藝、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及生物信息學(xué)分析等方面[12-13]。研究挖掘油莎豆耐逆相關(guān)基因，可以為今后培育植物抗旱種質(zhì)提供新的基因資源。

目前油莎豆DREB轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和潛在的作用機(jī)理還不明晰，因此本研究基于課題組前期建立的油莎豆葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，并在分析DREB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，擬采用PCR擴(kuò)增、生物信息分析、超表達(dá)載體構(gòu)建和非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)分析等方法，初步探究油莎豆CeDREB2.1的生物學(xué)功能，以期為解析CeDREB2.1參與抗逆的分子機(jī)制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

油莎豆品種‘榆引-1’(圖1，見15頁(yè))，該品種莖葉叢生，分蘗能力極強(qiáng)，植株高度80～100 cm，生育期為150 d左右，根系發(fā)達(dá)，地下可形成塊莖，一般每蔸可結(jié)塊莖100～200粒，平均產(chǎn)量500～600 kg·667m-2。由陜西省陜北礦區(qū)生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室種植并保存。

圖1 油莎豆材料‘榆引-1’

1.2 研究方法

1.2.1 油莎豆葉片總RNA的提取和cDNA的合成 將生長(zhǎng)至有6～8片葉子的油莎豆幼苗進(jìn)行干旱脅迫處理10 d，干旱脅迫后采取油莎豆幼嫩葉片，放置于液氮中，采用國(guó)產(chǎn)君諾德RNA(型號(hào)2117A,武漢君諾德生物科技有限公司)提取試劑盒，提取出油莎豆葉片總RNA，并使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，-20℃保存[14]。

1.2.2 油莎豆CeDREB2.1的克隆 根據(jù)課題組前期建立的油莎豆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，從中挖掘出在干旱脅迫下表達(dá)量高的一條DREB序列，命名為CeDREB2.1，并依據(jù)開放閱讀框設(shè)計(jì)特異引物F1:AATTTTGCGGACATGGGTGCTTA和R1: CAGTCATTCCGTTCTTGCGTTCC。以cDNA為模板，擴(kuò)增CeDREB2.1基因，擴(kuò)增體系為25 μL：(2×Pfu Mix 12.5 μL，dNTP 2 μL，引物F、R各1 μL，cDNA 0.5 μL，ddH2O 8 μL)。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?預(yù)變性94℃ 3 min,94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 1 min，35循環(huán)；72℃ 10 min)，產(chǎn)物經(jīng)1.0的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并切膠回收目的片段。膠回收后的目標(biāo)片段末端加A后，連接到EZ-T克隆載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α細(xì)胞，在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)篩選出陽(yáng)性克隆，并通過(guò)菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆。最后挑選陽(yáng)性克隆菌液，送至上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，挑出正確的CeDREB2.1基因序列。

1.2.3 油莎豆CeDREB2.1的生物信息學(xué)分析 分別通過(guò)ProtScale analysis(https://web.expasy.org/)、NPS-Prabi(https://npsa-prabi.ibcp.fr/)、SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/interactive)在線分析軟件對(duì)CeDREB2.1的親疏水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。同時(shí)分別運(yùn)用DNAMAN和MEGA7.0分析CeDREB2.1的保守結(jié)構(gòu)域和物種親緣關(guān)系。

1.2.4 植物遺傳表達(dá)載體的構(gòu)建和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化 利用高保真酶從測(cè)序成功的質(zhì)粒上擴(kuò)增CeDREB2.1目標(biāo)片段，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行末端加A處理；同時(shí)，使用XcmⅠ對(duì)植物表達(dá)載體pCXSN進(jìn)行酶切，回收酶切后的大片段，使用T4連接酶將CeDREB2.1目標(biāo)片段與酶切回收的pCXSN進(jìn)行連接[15]，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞，在含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)篩選出陽(yáng)性克隆，并通過(guò)菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆。最后挑選陽(yáng)性克隆菌液，送至上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)采用浸花法進(jìn)行[15]。采用潮霉素平板對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥T1和T2代種子進(jìn)行篩選，獲得轉(zhuǎn)CeDREB2.1的純合株系，在T3代進(jìn)行干旱脅迫處理，處理方法如下[4]：將T3代種子播于營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中，放于光照培養(yǎng)箱中(14 h/10 h光周期，光照強(qiáng)度8 000 Lx，溫度22℃，相對(duì)濕度50%～55%)生長(zhǎng)約4周，再進(jìn)行控水10 d處理，待大多數(shù)葉片萎蔫并開始變黃時(shí)，進(jìn)行復(fù)水處理14 d。最后統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)基因株系和對(duì)照的成活率。每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)選用16株轉(zhuǎn)基因植株。

1.2.5 油莎豆CeDREB2.1在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的半定量表達(dá)分析 野生型Col-2和轉(zhuǎn)CeDREB2.1基因擬南芥葉片RNA的抽提采用國(guó)產(chǎn)君諾德RNA提取試劑盒進(jìn)行，提取出擬南芥葉片總RNA后，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆?。以擬南芥AtACTIN基因?yàn)閮?nèi)參，以上述轉(zhuǎn)基因擬南芥cDNA為模板，用Taq聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系(20 μL)為：Mix-Taq buffer(2×) 10 μL，引物F和R (10 pmol·μL-1)各1 μL，cDNA(10 ng·μL-1) 0.5 μL，ddH2O 7.5 μL。PCR反應(yīng)程序參數(shù)為：94℃ 3 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃，40 s，循環(huán)數(shù)為30；72℃ 10 min，4℃永久保存。根據(jù)電泳結(jié)果，調(diào)整樣品cDNA的濃度，繼續(xù)完成PCR擴(kuò)增，直至內(nèi)參AtACTIN的電泳條帶亮暗完全一致時(shí)，以調(diào)整后的擬南芥cDNA為模板，用引物RT-CeDREB2.1(表1)進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)[16]，并照相保存。

1.2.6 油莎豆中CeDREB2.1的表達(dá)分析 選取約180粒飽滿的油莎豆種子，采用體積濃度10%的NaClO消毒后，播種于含有營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的花盆中，放置于科研溫室，正常澆水。待生長(zhǎng)至5葉期后，將油莎豆幼苗從基質(zhì)土中輕輕取出，清洗掉根上的基質(zhì)土，進(jìn)行逆境脅迫處理。對(duì)于干旱處理：取30株幼苗，每10株為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)，用漂浮板固定好，將其漂浮在含有10%的PEG6000溶液中處理24 h；高溫和低溫處理：分別取30株油莎豆幼苗，將其漂浮在無(wú)菌水中，分別放置于42℃培養(yǎng)箱和4℃春化培養(yǎng)箱處理24 h；對(duì)于鹽脅迫和ABA處理：分別取30株油莎豆幼苗，用漂浮板固定好，將其漂浮在含有300 mM的NaCl和100 μM的ABA溶液中處理24 h；對(duì)照用無(wú)菌水處理24 h[17]。處理完成后，剪取葉片，用干凈的鋁箔紙包好，液氮速凍。每個(gè)處理取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。樣品RNA的抽提采用國(guó)產(chǎn)君諾德RNA提取試劑盒進(jìn)行，提取出油莎豆葉片總RNA后，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆肹10]。

選取油莎豆CsACTIN為內(nèi)參，以相應(yīng)的cDNA為模板，選用TaKaRa的SYBR? Premix Ex TaqTM II試劑盒，采用CFX96TM Real-Time PCR Detection System，進(jìn)行qRT-PCR表達(dá)量分析(表1)。qPCR反應(yīng)體系總體積為25.0 μL：cDNA(10 ng·μL-1)0.5 μL，SYBR? Premix Ex Taq(2×) 12.5 μL，引物F和R (10 pmol·μL-1)各1 μL，ddH2O 10 μL。qRT-PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃ 變性15 s，54℃退火30 s，65℃延伸10 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表1 基因表達(dá)分析所使用的引物

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用SigmaPlot 12.5完成作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 油莎豆CeDREB2.1基因克隆

使用Tiagen TrizolRNA提取試劑盒提取油莎豆葉片總RNA，檢測(cè)RNA提取結(jié)果(圖2A)，3條條帶清晰明亮，說(shuō)明RNA純度較高，可以進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。再用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以稀釋6倍的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一條長(zhǎng)度約為1 200 bp的條帶(圖2 B)，條帶大小與預(yù)期相一致。

將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到EZ-T測(cè)序載體上，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，轉(zhuǎn)化后取50μL均勻涂布在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)8～12 h，挑取單克隆菌落，利用菌液PCR篩選陽(yáng)性克隆(圖2C)，選取3個(gè)陽(yáng)性克隆送至上海生物工程有限公司測(cè)序檢測(cè)。測(cè)序成功后，將序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中(登錄號(hào)為：MZ713253)，并將此基因命名為CeDREB2.1，其開放閱讀框長(zhǎng)度為1 191 bp，編碼397個(gè)氨基酸。

注：A. 油莎豆葉片總RNA的檢測(cè);B. CeDREB2.1的擴(kuò)增PCR;C.連接測(cè)序載體后篩選陽(yáng)性克隆。

2.2 油莎豆CeDREB2.1的生物信息學(xué)分析

利用ProtScale analysis軟件分析蛋白親疏水性，結(jié)果表明，CeDREB2.1編碼的多肽鏈中異亮氨酸(Ile)具有最高的分值4.500，疏水性最強(qiáng)；精氨酸(Arg)具有最低的分值-4.500，賴氨酸(Lys)分值為-3.900，該氨基酸序列內(nèi)含有較多的親水區(qū)域(圖3 A)，表明油莎豆CeDREB2.1編碼為親水性蛋白。

使用ProtParam在線軟件分析，得出CeDREB2.1蛋白質(zhì)的分子式為C1872H2873N537O647S17，分子量為43.80 kDa，理論等電點(diǎn)為4.67，編碼20種氨基酸，其中絲氨酸(Ser)含量最高(10.9%)。二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α螺旋(h)、延伸鏈(e)、β折疊(t)和無(wú)規(guī)卷曲(c)分別占26.01%、6.57%、2.78%和64.65%，可見無(wú)規(guī)卷曲和α螺旋是CeDREB2.1的大量結(jié)構(gòu)元件(圖3 B)。CeDREB2.1三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析表明，其與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)相似(圖3C)。

圖3 油莎豆CeDREB2.1的結(jié)構(gòu)分析

同時(shí)通過(guò)在線軟件，對(duì)油莎豆CeDREB2.1的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果表明此蛋白有一個(gè)AP2/ERFBP結(jié)構(gòu)域(圖4A，見17頁(yè))，前人研究表明含有AP2結(jié)構(gòu)域的蛋白廣泛存在于植物中，該結(jié)構(gòu)域通常依賴于ABA、JA、SA和乙烯等激素來(lái)調(diào)控下游基因的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)植物的抗逆能力[18-19]。將CeDREB2.1與已知生物學(xué)功能的其他植物如小麥、胡楊、楊樹、大豆、馬鈴薯、玉米、水稻、擬南芥、谷子、高粱、蘋果、向日葵等12個(gè)物種的DREB進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)莎豆CeDREB2.1與12個(gè)其他物種的DREB蛋白序列的相似性較高(圖4B，見17頁(yè))。運(yùn)用MEGA7.0軟件中的鄰接法(Neibor-Joining)算法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4C,見17頁(yè))，結(jié)果表明，油莎豆CeDREB2.1與胡楊(Populuseuphratica)、楊樹(Populustrichocarpa)和蘋果(Malusdomestica)的DREB蛋白的親緣關(guān)系比較近。

圖4 油莎豆CeDREB2.1保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)和在不同物種間的系統(tǒng)發(fā)育分析

2.3 油莎豆CeDREB2.1超表達(dá)載體的構(gòu)建及功能驗(yàn)證

根據(jù)CeDREB2.1序列的長(zhǎng)度和超表達(dá)載體序列，選擇XcmⅠ進(jìn)行單酶切pCSXN質(zhì)粒(圖5A)，片段大小為5 kbp，大小與預(yù)期相符，并將大片段切膠回收。同時(shí)，擴(kuò)增CeDREB2.1基因并做末端加A處理，再利用T4連接酶將pCSXN與CeDREB2.1連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10，挑取單克隆并利用PCR篩選陽(yáng)性克隆(圖5 B)。提取陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒，將pCXSN-CeDREB2.1重組質(zhì)粒用XcmⅠ酶做單酶切鑒定，切出的小片段與CeDREB2.1基因大小一致(圖5 C)，表明目的基因的超表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖5 油莎豆pCSXN-CeDREB2.1超表達(dá)載體的構(gòu)建

接著，將超表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌GV3101中，利用農(nóng)桿菌浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥，并采用潮霉素對(duì)T1、T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥種子進(jìn)行篩選，同時(shí)結(jié)合PCR檢測(cè)(圖6B)，最終獲得轉(zhuǎn)CeDREB2.1基因植株，并在種植的T3代選擇兩個(gè)株系Line2和Line5，分別種植48株進(jìn)行抗旱處理，并通過(guò)統(tǒng)計(jì)成活率對(duì)其表現(xiàn)型進(jìn)行分析，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)CeDREB2.1基因擬南芥株系在干旱10 d后并復(fù)水2周后，其成活率極顯著高于野生型(圖6A、6C)，說(shuō)明CeDREB2.1在植物中具有抗旱的功能。

注：(A)轉(zhuǎn)CeDREB2.1擬南芥在干旱處理下的表型鑒定；(B)干旱脅迫處理下CeDREB2.1在擬南芥中的表達(dá)分析；(C)干旱脅迫處理后，擬南芥成活率統(tǒng)計(jì)分析。柱形圖上**表示數(shù)據(jù)間具有極顯著差異(P<0.01)。

2.4 油莎豆CeDREB2.1在不同逆境脅迫下的表達(dá)分析

為了研究CeDREB2.1基因在不同非生物脅迫下的表達(dá)差異，分別用10% PEG6000干旱模擬、300 mmol·L-1的NaCl鹽脅迫，100 μmol·L-1的ABA處理，高溫(42℃)和低溫(4℃)5種脅迫處理油莎豆幼苗24 h。分別采集脅迫處理后的油莎豆葉片提取出RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA后應(yīng)用半定量RT-PCR和熒光定量PCR檢測(cè)CeDREB2.1在油莎豆中的表達(dá)量。RT-PCR結(jié)果表明，CeDREB2.1能夠被不同類型的脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)表達(dá)程度存在一定差異(圖7 A)，在干旱、低溫、高溫和鹽脅迫條件下，CeDREB2.1基因的表達(dá)量要高于ABA激素處理。熒光定量PCR結(jié)果和RT-PCR結(jié)果相似(圖7B)。說(shuō)明CeDREB2.1基因參與油莎豆對(duì)多種非生物脅迫的響應(yīng)過(guò)程。

3 討 論

隨著全球氣候的逐年變化，干旱、熱、冷、高鹽等極端環(huán)境也隨之頻繁發(fā)生，這些極端環(huán)境造成的滲透脅迫直接影響植物生長(zhǎng)發(fā)育和作物的產(chǎn)量[20]。為了應(yīng)對(duì)不利的外界環(huán)境，植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中逐漸進(jìn)化出一系列復(fù)雜且有序的生理生化機(jī)制來(lái)感應(yīng)環(huán)境變化、抵御環(huán)境帶來(lái)的不利影響[21]。其中激活植物體內(nèi)一些功能基因的表達(dá)，進(jìn)而產(chǎn)生耐受性是對(duì)極端環(huán)境作出的響應(yīng)之一[22]。目前為止，已經(jīng)有很多基因和信號(hào)途徑參與了植物對(duì)逆境的調(diào)控，如NAC[23]、DREB[24]、MYB[25]、WRKY[26]、bZIP[27]等，其中DREB蛋白家族作為AP2/ERF亞家族之一，屬于植物適應(yīng)逆境的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在調(diào)控非生物和生物脅迫反應(yīng)中的發(fā)揮著重要作用，近年來(lái)受到了廣泛的關(guān)注和研究[28]。

研究表明，植物界中的DREB蛋白主要分為6個(gè)亞家族(A1～A6)，目前已知的大多數(shù)DREB均屬于A1和A2亞家族。其中擬南芥AtDREB1A/CBF3，屬于A1亞家族，能夠在冷脅迫下被誘導(dǎo)表達(dá)。DREB2A和DREB2B屬于A2亞家族，研究表明，這兩類基因能夠被干旱脅迫、熱脅迫、鹽脅迫、ABA等多種因素誘導(dǎo)表達(dá)，因此是比較重要的一類亞家族[4,29]。本實(shí)驗(yàn)中，我們根據(jù)課題組前期建立的油莎豆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，從中挖掘出在干旱脅迫下表達(dá)量高的一條DREB序列，通過(guò)PCR擴(kuò)增，從油莎豆葉片中克隆到一個(gè)DREB基因，命名為CeDREB2.1，通過(guò)同源序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)CeDREB2.1與其他物種中的DREB2具有較高的相似性，因此其屬于DREB家族中的A2亞家族。

植物的耐逆性是多個(gè)基因共同作用的結(jié)果，為了提高植物的抗旱性，可以選擇將抗旱相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入植物體內(nèi)，獲得過(guò)量表達(dá)的植株，最終應(yīng)用于生產(chǎn)。轉(zhuǎn)基因植物之所以能表現(xiàn)出較好的特性，是因?yàn)楫?dāng)植物受到脅迫時(shí)，這些應(yīng)激反應(yīng)基因表達(dá)上調(diào)，應(yīng)激相關(guān)蛋白隨后與下游的靶蛋白相互作用，以減緩植物體內(nèi)活性氧的積累，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，最終增強(qiáng)植物對(duì)不利環(huán)境的耐受性[30]。其中，在DREB基因的應(yīng)用方面，已經(jīng)有許多抗旱基因被克隆出來(lái)，并且通過(guò)轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)、轉(zhuǎn)基因敲除或編輯技術(shù)，一部分基因的生物學(xué)功能已經(jīng)明晰。在水稻中分別過(guò)表達(dá)OsDREB2A和OsDREB2B，轉(zhuǎn)基因植株在水分極度虧缺和高鹽脅迫下均表現(xiàn)出很高的存活率[31]。Zhou 等[32]將大豆GmDREB1轉(zhuǎn)入小麥中，不僅提高了小麥的產(chǎn)量，而且在干旱條件下小麥的各種生理狀態(tài)均顯著優(yōu)于對(duì)照，說(shuō)明GmDREB1能增強(qiáng)作物的抗旱性。綜上，筆者推測(cè)從油莎豆中克隆的CeDREB2.1基因也可能參與調(diào)控油莎豆抵抗干旱、高溫、高鹽等非生物脅迫過(guò)程，因此在本試驗(yàn)中，筆者成功地構(gòu)建了CeDREB2.1的植物表達(dá)載體，并通過(guò)農(nóng)桿菌浸花法將其轉(zhuǎn)入擬南芥中，獲得了T3代轉(zhuǎn)CeDREB2.1的純合株系，并通過(guò)干旱脅迫處理，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)CeDREB2.1的擬南芥植株具有較好的抗干旱能力，初步驗(yàn)證了CeDREB2.1的生物學(xué)功能。

植物體內(nèi)一些DREB2對(duì)外界不同脅迫會(huì)作出迅速的響應(yīng)，如構(gòu)樹BpDREB2對(duì)干旱和高鹽脅迫能作出較快的響應(yīng)，在干旱條件下，BpDREB2的表達(dá)量在1～24 h間呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì)，并且在6 h時(shí)達(dá)到最大值。但是在外源激素ABA處理?xiàng)l件下，其表達(dá)量很低，說(shuō)明構(gòu)樹BpDREB2是不依賴于ABA的轉(zhuǎn)錄因子[33]。本研究對(duì)油莎豆CeDREB2.1在不同生物脅迫下的表達(dá)量進(jìn)行了分析，結(jié)果表明CeDREB2.1對(duì)干旱、低溫、高溫、高鹽和ABA均能作出響應(yīng)，說(shuō)明CeDREB2.1是一種依賴于激素ABA的轉(zhuǎn)錄因子，這與Li等[34]的結(jié)論相似，而與Cortés等[35]研究的結(jié)論不同，這可能是與植物體內(nèi)的可變剪接所引起的核酸多樣性有關(guān)。綜上所述，本研究從油莎豆中克隆出一個(gè)CeDREB2.1基因，為進(jìn)一步研究油莎豆抗旱特性，并且從分子水平上驗(yàn)證其生物學(xué)功能和抗旱新品種培育提供了新的思路。

共同第一作者貢獻(xiàn)說(shuō)明：柴乖強(qiáng)博士和秦媛媛碩士共同完成了本實(shí)驗(yàn)的實(shí)施和論文寫作等過(guò)程。其中柴乖強(qiáng)博士主要完成基因的克隆、表達(dá)分析、表達(dá)載體的構(gòu)建和擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化工作；秦媛媛碩士主要完成了轉(zhuǎn)基因擬南芥后代植株純合株系的篩選與種植、抗旱性鑒定等工作。