不同脫毒技術(shù)對馬鈴薯病毒脫毒效果的影響

古麗米拉·熱合木土拉，徐琳黎，孫 慧，楊茹微

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院 綜合試驗場，烏魯木齊 830001)

馬鈴薯是以營養(yǎng)器官繁殖的無性繁殖作物，在種植過程中，容易感染病毒，病毒侵染馬鈴薯植株后會逐代傳遞并積累，最終導(dǎo)致馬鈴薯植株生長衰退、植株變矮、葉面皺縮、葉片出現(xiàn)黃綠相間的嵌斑，甚至葉脈壞死直至整個復(fù)葉脫落、塊莖小或出現(xiàn)尖頭龜裂，使產(chǎn)量降低，品質(zhì)下降，這種現(xiàn)象稱為馬鈴薯的退化[1～3]。馬鈴薯生產(chǎn)中病毒病一旦發(fā)生，沒有很好的防治辦法。目前也還沒有任何藥劑可以治療馬鈴薯植株體內(nèi)的病毒而不損傷馬鈴薯。因此，控制種薯帶毒率，對侵染病毒的馬鈴薯進(jìn)行莖尖組織培養(yǎng)，脫除病毒，再結(jié)合病毒檢測手段，獲得真正的脫毒苗是解決馬鈴薯退化最先進(jìn)的技術(shù)措施之一[4]。近年來植物組織脫毒技術(shù)發(fā)展迅速，除了傳統(tǒng)的莖尖剝離技術(shù)以外，熱處理技術(shù)和化學(xué)處理技術(shù)也廣泛應(yīng)用于植物組織脫毒技術(shù)中[5]。但是目前國內(nèi)的研究來看傳統(tǒng)的莖尖剝離技術(shù)技術(shù)莖尖成活率低，脫毒處理時間長等不足，而熱處理技術(shù)和化學(xué)處理技術(shù)存在對材料的處理時間溫度及藥品用量還沒有一個完善的研究結(jié)果[6]。因此要針對馬鈴薯病毒病的發(fā)病機理，從不同的熱處理及化學(xué)處理方法來深入研究對比，可以有效地解決馬鈴薯病毒性退化，提高馬鈴薯產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

實驗材料為新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院綜合試驗場馬鈴薯實驗室提供的已侵染不同馬鈴薯病毒的試管苗，共3個品種：J11試管苗株系只帶馬鈴薯 Y病毒; 隴10試管苗株系只帶馬鈴薯 V病毒; T9 試管苗株系只帶馬鈴薯 S病毒;

食物品質(zhì)優(yōu)才能避免拉肚子，喂新鮮魚也可以，建議將魚打成魚醬投喂，一定是入冰柜急凍為好，太久吃不完的食物處理掉。冰凍的食物解凍到常溫再去喂。

1.2 試驗試劑和儀器

6-BA,GA3,NAA, MS培養(yǎng)基，病毒唑，組培室，無菌操作間，超凈工作臺，顯微解剖鏡，莖尖剝離工具，光照培養(yǎng)箱，一次性針頭，微量離心管，PCR管，病毒檢測試劑盒及儀器。

1.3 試驗內(nèi)容和方法

按照常規(guī)的組培過程在已滅菌的超凈工作臺內(nèi)對實驗材料進(jìn)行莖尖剝離技術(shù)。本實驗脫毒技術(shù)為三種，分別為莖尖剝離技術(shù)，熱處理+莖尖剝離技術(shù)及化學(xué)處理+莖尖剝離技術(shù)。

酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)法檢測步驟：

1.3.2 熱處理+莖尖剝離方法 按組織培養(yǎng)操作流程將莖段轉(zhuǎn)切到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，每瓶放入10個莖段，培養(yǎng)。組培苗幼苗 7 d 生根后放入人工培養(yǎng)箱中進(jìn)行變溫處理。溫度 26℃/19 h,38℃/5 h 交替進(jìn)行，光照強度2 000 lux,光照時間為12 h/d。處理周期分別為 3 周、4 周和 5 周，以無熱處理莖尖剝離的組培苗做對比。熱處理后的莖段在超凈工作臺內(nèi)，利用顯微解剖鏡剝離帶有 1 個葉原基的莖尖，每個處理剝離 30 個。將莖尖接種至莖尖培養(yǎng)基中，在光強2 000 lux,光照時間為16 h/d,培養(yǎng)溫度(23士2)℃的條件下培養(yǎng)。接種 8 周后統(tǒng)計成活率，接種 12 周后統(tǒng)計成苗率。接種 12 周后，將成苗莖尖轉(zhuǎn)切到 MS 培養(yǎng)基中，待成苗后進(jìn)行病毒檢測。

聲波在煤巖體傳播過程中遇到異常體時，如斷層、陷落柱、煤層異常變化帶等，其傳播路徑及參數(shù)會發(fā)生部分改變，通過聲波探測可以獲得異常體的位置及規(guī)模。沖擊地壓的發(fā)生往往是應(yīng)力局部化和缺陷局部化造成的，這也是為什么采掘活動接近煤柱、斷層、煤層賦存急劇變化等異常區(qū)域時較易發(fā)生沖擊地壓的原因。通過聲波探測技術(shù)獲得異常區(qū)域的位置及其大小，就能間接獲得沖擊危險區(qū)域位置及其嚴(yán)重程度，因此該技術(shù)較多的應(yīng)用于沖擊危險預(yù)評價及危險區(qū)域劃分。

1.3.3 莖尖剝離+化學(xué)處理 化學(xué)處理方法用的試劑為病毒唑。待莖尖培養(yǎng)基滅完菌還未凝固時，將用無菌水溶解好的不同濃度的病毒唑溶液用一次性針頭注射到MS培養(yǎng)基中，加入的病毒唑濃度分別為25 mg/L、35 mg/L和45 mg/L。待加入病毒唑的培養(yǎng)基凝固后，將實驗材料接種到備好的培養(yǎng)基中置于組培室經(jīng)培養(yǎng)。培養(yǎng)三周后經(jīng)上述莖尖剝離法(1.3.1)得到莖尖，置于莖尖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每個處理剝離30個。接種6周后統(tǒng)計成活率，10周后統(tǒng)計成苗率。12 周后將成苗的莖尖接種到MS培養(yǎng)基中，置于組培室培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為 22℃-23℃，光照 16 h/d,光強 2 000 lx。待成苗進(jìn)行病毒檢測。

三是要有好裝備。首先當(dāng)然是車輛。越野車是首選，沒有越野車也得質(zhì)量相對過硬一些。因為所到之處，有些是尚未開放的景區(qū)或景點，道路設(shè)施不太完善，逢山爬山，遇水涉水。不能后退，只有前進(jìn)。另外，“零件”也不可忽視。想爬山最好準(zhǔn)備登山杖，想去沙漠最好備好沙地鞋，還有什么水具、地圖、指南針、照明燈、太陽眼鏡、雨傘、防曬衣、防曬霜、藥品等等，總之寧可備而不用，不可用而無備。

1.3.5 病毒檢測 本實驗采用酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)檢測法對供試材料進(jìn)行病毒檢測

1.3.1 莖尖剝離方法 在已滅菌的超凈工作臺內(nèi)利用顯微解剖鏡剝離帶有1個葉原基的莖尖，每份材料剝離 40 個莖尖，將莖尖接種至莖尖培養(yǎng)基中以 MS+瓊脂4.5 g/L+白糖30 g/L 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，另附加不同濃度 GA3，NAA 和 6-BA。接種后莖尖置于組培室培養(yǎng)，溫度(23士2)℃，光照 16 h/d,光強 2 000 lx。接種 8 周后統(tǒng)計成活率，接種 12周后統(tǒng)計成苗率并將成苗的莖尖轉(zhuǎn)切到 MS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)后進(jìn)行病毒檢測。

⑦用酶標(biāo)儀在405 nm波長下檢測結(jié)果。陽性結(jié)果：微孔中有明顯顏色變化；陰性結(jié)果：微孔中沒有明顯顏色變化。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 成活率，莖尖分生組織發(fā)育為可見的綠點謂之成活；成苗率，成活莖尖長出帶有兩個以上葉片的小植株謂之成苗；脫毒率為無病毒植株數(shù)與檢測總株數(shù)的百分比。

④洗版。卵育結(jié)束后，將反應(yīng)孔中的試劑倒出，加入250 uL的PBST緩沖液，之后快速導(dǎo)出，重復(fù)6～8次。將微孔板倒扣在吸水紙上以控干孔中殘留液體。

病株主要特點：該病主要是由于病菌從植株根部進(jìn)入，進(jìn)而在植株體內(nèi)蔓延，以此來危害玉米根部和玉米莖。最初的病癥會造成玉米根部和莖部木質(zhì)部分變成褐色，然后根部會逐漸壞死，包括次生根都會壞死，最后導(dǎo)致整個根莖部全部腐爛，引起植株的枯死。而地上部分一開始會由于缺乏養(yǎng)分葉片變黃，后續(xù)因為沒有養(yǎng)分病株變得枯黃。

③配制的ECI緩沖液稀釋到1倍，按酶標(biāo)記物標(biāo)簽上的稀釋倍數(shù)將酶標(biāo)記物加到ECI緩沖液中，混合均勻。

②取0.35 g馬鈴薯組織放入研磨袋中加入1 000 uL的樣品提取液，繼續(xù)研磨。將研磨好的植物組織液裝入離心管中離心30。吸取100 uL的上清液加入提前準(zhǔn)備好的微孔板中，加入陽性及陰性對照，在恒濕箱中卵育2 h。

熱處理結(jié)合莖尖剝離成活率及脫毒率方差分析結(jié)果顯示(表 3)，經(jīng)過 3 種不同周期熱處理的莖尖成苗率及脫毒率差異不顯著，成苗率有顯著性差異。不同處理周期中3周熱處理的植株成活率最高，但成苗率和脫毒率較低，4周熱處理的植株成活率和3周熱處理無明顯差異，成苗率則最高，脫毒率最低。由表3可見，5周熱處理的植株的成活率，成苗率均在中等水平上。但是脫毒率明顯高于其他周期熱處理的植株，最高達(dá)到了100%。以此對比的為無任何熱處理的植株，成活率及成苗率上都低于3周和4周熱處理周期的植株的成活率及成苗率，但是脫毒率則高于后兩個處理的植株的脫毒率。這說明3周和4周熱處理沒有達(dá)到任何增強脫毒的效果。

⑥卵育結(jié)束前15分鐘，制備PNP底物溶液，用PNP緩沖溶液溶解PNP底物片。再講微孔板拿出進(jìn)行洗版，步驟同上④，重復(fù)8次。再各反應(yīng)空中加入100 UL的PNP底物溶液，恒濕箱中卵育60 min。

①按照說明書配比，配制PBST緩沖液，通用提取緩沖液(GEB)，ECI緩沖液及PNP緩沖液。

2 結(jié)果與分析

2.1 莖尖剝離技術(shù)對馬鈴薯不同病毒的脫毒效果

表1表明，在莖尖剝離法中剝離了只帶一個葉原基的莖尖作為實驗材料，3個不同品種材料莖尖的成活率和成苗率中等水平。3種病毒中脫毒率最低的為馬鈴薯S病毒，脫毒率僅為32%，脫毒率最高的馬鈴薯V病毒，脫毒率達(dá)到68，馬鈴薯Y病毒脫毒率與V病毒脫毒率沒有明顯的差異。此結(jié)果表明馬鈴薯 S 病毒在生長點很近處也有分布，屬于較難脫的病毒。相比之下馬鈴薯V病毒在成活率及脫毒率的綜合考慮下表現(xiàn)為最好，因此馬鈴薯V病毒適合用莖尖剝離方法來脫毒。

表1 不同品種莖尖剝離技術(shù)培養(yǎng)的莖尖組織的成活率及成苗率的影響

2.2 熱處理加莖尖剝離技術(shù)對不同馬鈴薯病毒脫毒率的影響

實驗設(shè)計的熱處理溫度為 26℃,19 h,38℃,5 h 交替進(jìn)行，光照強度2 000 lux,光照時間為12 h/d。處理周期分別為 3 周、4周和 5 周，以無熱處理莖尖剝離的組培苗做對比。表2 結(jié)果可見，經(jīng)過三種不同熱變溫處理之后莖尖剝離的植株成活率及脫毒率沒有呈現(xiàn)規(guī)律性變化。三種不同病毒的脫毒率比較中3周熱處理馬鈴薯Y病毒的脫毒率最低20%。而在5周熱處理水平上達(dá)到了86%的脫毒率，其他V病毒以及S病毒同樣也在5周熱處理水平上達(dá)到了最高脫毒率100%和96%。而3周和4周熱處理的植株的脫毒率明顯低于無任何熱處理莖尖剝離的植株。以上結(jié)果表明熱處理周期對不同病毒脫毒效果有一定的影響，從整體水平來看，馬鈴薯V病毒脫毒率最高，其次是馬鈴薯S病毒，馬鈴薯Y病毒的脫毒率為最低。

There was no significant difference in length of postoperative hospital stay.

表2 經(jīng)過熱處理+莖尖剝離脫毒技術(shù)培養(yǎng)的莖尖組織成活率，及脫毒率統(tǒng)計

⑤微孔板中加入100 UL酶標(biāo)記物稀釋液,在恒濕箱中卵育2 h。

表3 熱處理結(jié)合莖尖剝離成活率及脫毒率分析結(jié)果

2.3 化學(xué)處理加莖尖剝離技術(shù)對不同馬鈴薯病毒脫毒率的影響

莖尖剝離結(jié)合病毒唑方法中，首先將帶實驗材料單個切段，接種到帶有不同濃度病毒挫的培養(yǎng)基中(濃度為25 mg/L、35 mg/L和45 mg/L)培養(yǎng)三周后莖尖剝離，以無加入病毒挫的培養(yǎng)基培養(yǎng)的莖尖作為對照。再對其進(jìn)行成活率及成苗率統(tǒng)計。由表4可見，對于不同馬鈴薯病毒不同病毒唑濃度處理，培養(yǎng)基中的病毒唑濃度的變化與莖尖生長率脫毒有明顯關(guān)系。對于三種不同病毒的脫毒效果比較中，馬鈴薯Y病毒在35 mg/L和45 mg/L水平上出現(xiàn)的100%的脫毒率，但是45水平上的成苗率才13%，明顯低于其他濃度處理的的出苗率。馬鈴薯V病毒則在45 mg/L水平上出現(xiàn)了最高脫毒率100%，而且此處理中植株成活率和成苗率也在比較高的水平分別為93%和47%。馬鈴薯S病毒病毒在25 mg/L水平上出現(xiàn)了最高脫毒率92%。三種病毒脫毒率以未加入病毒唑培養(yǎng)的植株脫毒率作為比較，除了45 mg/L處理的馬鈴薯S病毒以外其他處理的脫毒率均高于未加入病毒唑剝離的莖尖的脫毒率。這說明，病毒唑加莖尖剝離的植株脫毒率并未隨著病毒唑濃度的提高出現(xiàn)規(guī)律性變化，因此病毒唑濃度對脫毒率的主要因素，但是對提高脫毒率有一定的影響，通過莖尖剝離結(jié)合病毒唑法脫毒率可以有效提高Y病毒的脫毒效果。

表4 經(jīng)過病毒唑+莖尖剝離脫毒技術(shù)培養(yǎng)的莖尖組織成活率，及脫毒率統(tǒng)計

由表5可知 3種不同處理成活率之間的差異分析結(jié)果。無病毒唑加入的莖尖的成活率與病毒唑濃度為 25 mg/L,35 mg/L ,45 mg/L處理的成活率有顯著差異，各處理成苗率及脫毒率之間的無顯著性差異。成活率及成苗率最高的病毒唑濃度 35 mg/L，成活率達(dá)到95.67%。其次是25mg/L 成活率為89%，未加入病毒唑培養(yǎng)的植株的成活率最低64.67%。各個處理的成苗率上則沒有明顯差異，出苗率均在33%左右。脫毒率最高的為25 mg/L 濃度，達(dá)到85%。其次的為45 mg/L和35 mg/L，以上水平均高于未加入病毒唑的植株的脫毒率。3個不同病毒的脫毒率均在35 mg/L水平上達(dá)到最高，當(dāng)濃度到了45 mg/L時成活率及脫毒率都開始規(guī)律性下降。這說明高濃度的病毒唑濃度對植株的生長狀態(tài)有一定的影響，也不利于提高莖尖的脫毒效果。

表5 莖尖剝離法結(jié)合病毒唑處理的成活率及成苗率分析

3 討論

(1)通過莖尖剝離對不同病毒剝離的莖尖的成活率、成苗率以及多種病毒的脫除效果比較可知,馬鈴薯S的脫毒率極低，在 32%左右；馬鈴薯V病毒在各試驗處理中表現(xiàn)為最易脫除,脫毒效果在各品種表現(xiàn)均達(dá)到 68%。馬鈴薯Y病毒脫毒率與V病毒脫毒率無差明顯的差異。從國內(nèi)大量的研究內(nèi)容來看，馬鈴薯病毒種類中最難脫除的為馬鈴薯S病毒和馬鈴薯X病毒，都需要切去帶一個葉原基的莖尖，才能達(dá)到脫毒的效果而，且莖尖的成活率與莖尖的大小，帶的葉原基數(shù)量有非常重要的關(guān)系。莖尖越小,成活率越低,脫毒率越高;反之,莖尖越大,成活率越高,脫毒率越低[7]。本次實驗的莖尖剝離技術(shù)中只取一個葉原基培養(yǎng)莖尖之后結(jié)果也比較符合以上觀點。實驗中馬鈴薯S病毒的脫毒率達(dá)到32%。但是成苗率極低，也就失去了實際的使用價值。因此利用莖尖剝離技術(shù)脫去S病毒時取的莖尖大小如何選擇還需要做更多的研究。

在經(jīng)濟發(fā)展的新形勢下，涉農(nóng)企業(yè)面臨的內(nèi)外部環(huán)境發(fā)生著改變，這就要求企業(yè)能夠適時調(diào)整并優(yōu)化完善公司治理結(jié)構(gòu)，在加強黨的領(lǐng)導(dǎo)下提高涉農(nóng)企業(yè)公司治理的自主創(chuàng)新能力，提升治理效率，從而實現(xiàn)涉農(nóng)企業(yè)穩(wěn)定發(fā)展，助推我國農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化實現(xiàn)、農(nóng)村繁榮和農(nóng)民增產(chǎn)增收。

(2)熱處理加莖尖剝離脫毒處理中，在進(jìn)行不同變溫處理再經(jīng)過莖尖剝離脫毒培養(yǎng)后，其成活率、成苗率和各種病毒的脫除效果均為最好的還是馬鈴薯V病毒，其次是馬鈴薯S病毒，而脫毒效果最差的是馬鈴薯Y病毒。根據(jù) Dawson 和 Coworker 研究證明植株在 40℃高溫處理時，病毒和寄主 RNA合成都是較為緩慢的，而植物正常生長能適應(yīng)的極限溫度為 42℃[8]。但是由于本實驗用的材料為組培苗，而常規(guī)組培苗比較幼嫩，耐高溫能力弱，持續(xù)高溫可能會造成組培苗不同程度的燒苗甚至死亡,所以這次實驗熱處理最高溫度選擇在38℃。Dawson 和 Coworker 同時指出熱處理的下限溫度達(dá) 25℃時，病毒寄主RNA 的合成便立即恢復(fù)，即植物完全恢復(fù)正常生長狀態(tài)，但4～8 h后病毒 RNA重新恢復(fù)合成功能，因此在最高溫度、最低溫度以及處理時間中間找到一個平衡點，既能脫除病毒又不影響植株正常生長是成功脫毒的關(guān)鍵問題。張婧穎也莖尖剝離法結(jié)合熱處理法在 39℃(6h)+26℃(18h)交替處理，得到較好的脫毒效果[9]。筆者試驗在熱處理結(jié)合莖尖剝離處理法中，選擇熱處理溫度為26℃/19h,38℃/5h，交替時間5 h，由結(jié)果顯示，三種病毒在5周熱處理時均可達(dá)到較高的脫毒率，其中馬鈴薯S病毒也可達(dá)到96%的脫毒率。但是在變溫處理過程中部分4周熱處理的植株和5周熱處理的植株都出現(xiàn)，植株生長緩慢，葉片皺縮等現(xiàn)象。因此，對于熱處理時間和溫度還需通過試驗進(jìn)一步研究，需要找出脫毒效果更好的時間和溫度。

長春市作為吉林省的省會城市在長吉圖戰(zhàn)略發(fā)展中處于核心地位。近幾年來，隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展，長春市對外交往更加頻繁，與外國經(jīng)貿(mào)往來增多 ，外國游客也日益增加，越來越多的外國朋友選擇來到長春學(xué)習(xí)、工作、生活。在這種大環(huán)境下，長春市整體的對外形象和優(yōu)良規(guī)范的語言環(huán)境對于促進(jìn)長春市的發(fā)展是有著重大意義的。

(3)試驗參考 Klein、Cassel、Heide Bittner、Nagayoshi[10]、Peter L.Conrad[11]等研究，將病毒唑加入培養(yǎng)基中，將病毒唑與莖尖剝離法組合進(jìn)行脫毒試驗。試驗結(jié)果表明病毒唑與其他方法相結(jié)合具有較好的脫毒效果，比起傳統(tǒng)的莖尖剝離方法病毒唑組合莖尖剝離方法能得到更高的脫毒率。通過此方法將馬鈴薯病毒脫毒率可高達(dá)100%，尤其是馬鈴薯Y病毒和馬鈴薯V病毒。最難脫除的馬鈴薯S病毒的脫毒率也可以達(dá)到92%。筆者試驗還發(fā)現(xiàn)將不同濃度病毒唑放入培養(yǎng)基中對組培苗的生長產(chǎn)生不同程度的影響。隨病毒唑濃度增加組培苗產(chǎn)生植株矮小和分叉現(xiàn)象增多，25 mg/L和35 mg/L濃度影響較小、45 mg/L濃度影響較大，植株出現(xiàn)生長緩慢，葉片微黃等現(xiàn)象。將病毒唑應(yīng)用于馬鈴薯脫毒技術(shù)，國外很早就有試驗研究，而我國在這方面研究還非常少，楊瓊芬[12]曾研究使用病毒唑防止細(xì)菌對脫毒苗浸染，取得了良好的效果。因此根據(jù)我國馬鈴薯品種及常見病毒如何將病毒唑運用于馬鈴薯脫毒，從而提高馬鈴薯脫毒技術(shù)進(jìn)展，還需進(jìn)一步研究。