異槲皮苷通過內質網應激/自噬途徑誘導宮頸癌細胞凋亡的作用機制

蔡穎　楊英捷

摘要 目的：研究異槲皮苷通過內質網應激和自噬途徑誘導宮頸癌細胞凋亡的作用機制。方法：將SiHa細胞隨機分為對照組、異槲皮苷低劑量組、異槲皮苷中劑量組和異槲皮苷高劑量組。異槲皮苷低、中、高劑量組細胞分別使用終濃度為20 μmol/L、40 μmol/L和80 μmol/L的異槲皮苷培養(yǎng)，對照組細胞使用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)。使用CCK-8分別在24 h、48 h和72 h檢測細胞增殖情況;EDU檢測各組細胞在72 h時的增殖情況;熒光定量PCR檢測各組細胞內質網應激相關mRNA的表達;Western Blotting檢測各組細胞蛋白表達情況;流式細胞術檢測細胞凋亡情況。結果：與對照組細胞比較，低、中、高劑量異槲皮苷作用后，細胞OD值均明顯降低;葡萄糖調節(jié)蛋白78 mRNA、CHOP mRNA以及葡萄糖調節(jié)蛋白78蛋白、C/EBP同源蛋白質（CHOP）、胱天蛋白酶12蛋白、Beclin 1蛋白、Bax蛋白、Cl-胱天蛋白酶-3蛋白表達水平以及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均明顯升高;P62蛋白、Bcl-2蛋白、p-JAK2蛋白和p-信號轉導及轉錄激活蛋白3表達水平均明顯降低;細胞凋亡率明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）。且異槲皮苷的作用呈劑量依賴性。結論：異槲皮苷可通過內質網應激途徑和自噬途徑，誘導宮頸癌細胞凋亡。

關鍵詞 異槲皮苷;宮頸癌;內質網應激;增殖;自噬;凋亡;JAK/信號轉導及轉錄激活蛋白信號通路

Mechanism of Isoquercitrin in Inducing Apoptosis of Cervical Cancer Cells Through

Endoplasmic Reticulum Stress and Autophagy Pathways

CAI Ying，YANG Yingjie

（1 School of Obstetrics and Gynecology，Graduate School of Guizhou Medical University，Guiyang 550000，China;

2 Gynecological Tumor Surgery of Guizhou Cancer Hospital，Guiyang 550000，China）

Abstract Objective：To explore the mechanism of isoquercitrin in the induction of apoptosis in cervical cancer cells through endoplasmic reticulum stress and autophagy pathways.Methods：The SiHa cells were randomly divided into a control group，and low-（20 μmol/L），medium-（40 μmol/L），and high-dose（80 μmol/L） isoquercitrin groups.The cells in the isoquercitrin groups were cultured with corresponding drugs，and those in the control group with normal medium.The cell proliferation was detected at 24 h，48 h，and 72 h using CCK-8 kits.EDU was used to detect the proliferation of cells in each group at 72 h.The expression of endoplasmic reticulum stress-related genes was detected by qRT-PCR.The protein expression in each group was detected by Western blot.Cell apoptosis was detected by flow cytometry.Results：Compared with the control group，the isoquercitrin groups showed reduced OD values in cells，increased expression levels of glucose-regulated protein 78（GRP78） mRNA，CHOP mRNA，GRP78 protein，CHOP protein，Caspase-12 protein，Beclin 1 protein，Bax protein，Cl-caspase-3 protein，and the LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ ratio，decreased expression levels of p62 protein，Bcl-2 protein，p-JAK2 protein，and p-STAT3 protein，and elevated apoptosis rate（P<0.05）.The effect of isoquercitrin was in a dose-dependent manner.Conclusion：Isoquercitrin can induce apoptosis of cervical cancer cells through endoplasmic reticulum stress and autophagy pathways.

Keywords Isoquercitrin; Cervical cancer; Endoplasmic reticulum stress; Proliferation; Autophagy; Apoptosis; JAK/STAT signaling pathway

中圖分類號：R284;R737.33文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.06.008

宮頸癌是一種常見的婦科惡性腫瘤，是威脅女性健康的第二大癌癥，其產生的原因可能與人乳頭瘤病毒（Human Papilloma Virus，HPV）感染、性混亂及初次性交年齡過早等高危因素有關[1]。盡管宮頸癌的廣泛篩查和疫苗開發(fā)取得了重大進展，但宮頸癌在發(fā)展中國家的發(fā)病率和死亡率仍較高。目前對晚期或復發(fā)性宮頸癌還是以放射治療和化療作為主要的治療方法，但放射治療和化療會產生嚴重的不良反應和耐藥性[2]。因此，近年來對于天然藥物在腫瘤的治療過程中的研究越來越得到關注，天然藥物具有多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點、不良反應小等優(yōu)勢，已成為抗癌藥物的重點研發(fā)對象[3-4]。異槲皮苷屬黃酮類化合物，也被稱為羅麻甲素和槲皮素3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，異槲皮苷是桑葉、荷葉、黃秋葵、辣木葉等中草藥和天然植物中的重要活性成分[5]。具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗菌、抗病毒、降血壓、降血脂、抗動脈粥樣硬化、降血糖、神經保護等生物活性，具有較大的藥用價值和應用前景[6]。現對異槲皮苷對宮頸癌細胞的作用進行研究，并進一步探究其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人宮頸癌細胞株SiHa（已查無污染）購于美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC）。細胞解凍后，轉入含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM細胞培養(yǎng)基中，1 000 r/min，離心半徑10 cm，離心10 min，棄上清，用培養(yǎng)基重懸細胞并接種于培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃，5% CO的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。2 d更換1次培養(yǎng)基，待細胞融合度達到80%時進行傳代。本研究經過貴州醫(yī)科大學倫理委員會審核批準（倫理審批號：貴L200618）。

1.1.2 藥物 異槲皮苷（中國食品藥品檢定研究院，批號：111809-201804）。

1.1.3 試劑與儀器 DMEM細胞培養(yǎng)基[賽百慷（上海）生物技術股份有限公司，貨號：iCell-0001];CCK-8 Cell Counting Kit（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，貨號：A311-02）;Trizol（北京索萊寶科技有限公司，貨號：15596-026）;T7高效RNA轉錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，貨號：DD4201）;Talent qPCR PreMix（SYBR Green）[天根生化科技（北京）有限公司，貨號：FP209-02];BCA蛋白定量試劑盒（上?？道噬锟萍加邢薰荆浱枺篕L-X126）;ECL化學發(fā)光檢測試劑盒[愛必信（上海）生物科技有限公司，貨號：abs920];細胞凋亡檢測試劑盒（日本同仁化學公司，貨號：AD10-3）;DAPI（北京索萊寶科技有限公司，貨號：D8200-10）;EdU細胞增殖檢測試劑盒（廣州市銳博生物科技有限公司，貨號：C10310）;GRP78（貨號：ab21685）、胱天蛋白酶12（貨號：ab62484）抗體購買于英國Abcam公司;CHOP（貨號：2895）、LC3 A/B（貨號：12741）、Beclin 1（貨號：3495）、P62（貨號：88588）、Bcl-2（貨號：4223）、Bax（貨號：89477）、Cleaved-caspase-3（貨號：9579）、Phospho-JAK2（貨號：3771）、JAK2（貨號：3230）、Phospho-STAT3（貨號：9145）、STAT3（貨號：9139）、GAPDH（貨號：5174）抗體、HRP標記的山羊抗兔IgG（貨號：7074）均購買于美國CST公司。二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific公司，美國，型號：Forma Steri-Cycle）;全波長酶標儀（Thermo Fisher Scientific公司，美國，型號：Multiskan Sky）;PCR儀（Bio-Rad公司，美國，型號：T100）;熒光定量PCR儀（諾禾致源，型號：Q225）;全自動電泳凝膠成像系統（Bio-Rad公司，美國，型號：Gel Doc EZ）;流式細胞儀（貝克曼庫爾特公司，美國，型號：CytoFLEX S）;倒置熒光顯微鏡（徠卡公司，德國，型號：DMi8）。

1.2 方法

1.2.1 分組 將對數生長期細胞隨機分為對照組、異槲皮苷低劑量（20 μmol/L）組、異槲皮苷中劑量（40 μmol/L）組和異槲皮苷高劑量（80 μmol/L）組，每組細胞均做9次重復。

1.2.2 干預方法 異槲皮苷低劑量組、異槲皮苷中劑量組和異槲皮苷高劑量組分別加入終濃度為20 μmol/L、40 μmol/L和80 μmol/L的異槲皮苷進行培養(yǎng)[7]，對照組細胞加入等量的DMEM正常培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 CCK-8檢測各組細胞增殖情況 制備SiHa細胞懸液，調整細胞密度為1×10個/mL，接種于96孔板中，每孔100 μL/孔，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。異槲皮苷低劑量組、異槲皮苷中劑量組和異槲皮苷高劑量組加入濃度為20 μmol/L、40 μmol/L和80 μmol/L的異槲皮苷，對照組加入等量細胞培養(yǎng)基，每組設9個復孔，分別在培養(yǎng)24 h、48 h和72 h時往孔內加入CCK-8溶液10 μL，放入培養(yǎng)箱中避光孵育2 h，使用酶標儀在450 nm波長下檢測各組細胞的OD值。

1.2.3.2 EdU檢測各組細胞增殖情況 細胞按照1.2.2方法進行分組培養(yǎng)，在培養(yǎng)72 h時，往細胞中加入5-乙炔基-2′-脫氧尿苷（5-Ethynyl-2′-deoxyuridine，EdU），并在37 ℃下孵育2 h[8]。然后使用4%多聚甲醛固定30 min，在用Triton X-100透化細胞[9]。然后加入1×Apollo反應混合物培養(yǎng)細胞30 min。加入4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride，DAPI）溶液對細胞核染色5 min。在熒光顯微鏡下觀察并拍照，對EdU陽性細胞進行計數，并計算陽性細胞百分率。

1.2.3.3 熒光定量PCR檢測各組細胞內質網應激相關mRNA的表達水平 使用Trizol試劑法提取各組細胞的RNA，使用超微量紫外分光光度儀檢測所提取RNA的純度和濃度。使用T7高效RNA轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。按照Talent qPCR PreMix（SYBR Green）說明書方法配置熒光定量反應體系，使用熒光定量PCR儀進行反應，使用2-△△Ct法計算目標mRNA的相對表達量[10]。

1.2.3.4 Western Blotting檢測各組細胞蛋白表達情況 收集各組細胞，并用預冷的磷酸鹽緩沖溶液（Phosphate-buffered Saline，PBS）清洗3次，加入放射免疫沉淀測定（Radioimmune Precipitation Assay，RIPA）裂解液和苯甲磺酰氟（Benzylsulfonyl Fluoride，PMSF）蛋白酶抑制劑，冰上靜置30 min使細胞充分裂解。4 ℃、12 000 r/min，離心15 min，取上清液。使用2，2-聯喹-啉-4，4-二甲酸二鈉（Bicinchoninic Acid Disodium Salt，BCA）試劑盒檢測蛋白質濃度，十二烷基硫酸鈉（Sodium Dodecyl Sulfate，SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，隨后轉移至聚偏氟乙烯（Poly Vinylidene Fluoride，PVDF）膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h[11]。加入葡萄糖調節(jié)蛋白78（1∶600）、C/EBP同源蛋白質（CHOP）（1∶1 000）、胱天蛋白酶12（1∶800）、LC3 A/B（1∶1 000）、Beclin 1（1∶1 000）、P62（1∶1 000）、Bcl-2（1∶2 000）、Bax（1∶1 000）、Cl-胱天蛋白酶-3（1∶1 000）、p-JAK2（1∶1 000）、JAK2（1∶1 000）、p-信號轉導及轉錄激活蛋白3（STAT3）（1∶1 000）、STAT3（1∶800）、GAPDH（1∶1 000）抗體，4 ℃孵育過夜。Tris-HCl緩沖鹽溶液+Tween（Tris Buffered Saline with Tween-20，TBST）洗膜后，加入辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔IgG（1∶5 000），37 ℃孵育1 h。增強化學發(fā)光（Enhanced Chemiluminescence，ECL）試劑盒曝光顯影，全自動凝膠成像儀拍照分析，根據灰度值計算目的蛋白表達水平。

1.2.3.5 流式細胞術檢測細胞凋亡情況 取各組細胞，使用胰酶消化，然后PBS漂洗，加入banding buffer重懸細胞，然后加入Annexin V-FITC和PI，放入培養(yǎng)箱中避光染色5 min，上流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況[12]。

1.3 統計學方法 將所得實驗數據采用SPSS 26.0統計軟件進行數據分析，首先對數據進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的數據采用均值±標準差（±s）表示，不符合正態(tài)分布的數據使用非參數檢驗。對于符合正態(tài)性分布的數據，多組間數據比較采用單因素方差分析，2組數據比較時采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 異槲皮苷抑制SiHa細胞增殖 由表1結果可以看出，在24 h時異槲皮苷不同劑量組OD值均較對照組明顯降低（P<0.05）。在48 h時，異槲皮苷不同劑量組OD值較對照組明顯降低（P<0.05）;且與異槲皮苷低劑量組比較，異槲皮苷中劑量組和高劑量組OD值明顯降低（P<0.05）。在72 h時，異槲皮苷不同劑量組OD值均較對照組明顯降低（P<0.05），且異槲皮苷低、中、高劑量組差異有統計學意義（P<0.05），異槲皮苷高劑量組OD值最低。與對照組比較，異槲皮苷作用后EdU陽性細胞率明顯降低，且異槲皮苷濃度越高，EdU陽性細胞率越低，各組差異有統計學意義（P<0.05）。見圖1、表1。

2.2 異槲皮苷體外激活內質網應激 與對照組比較，異槲皮苷不同劑量組葡萄糖調節(jié)蛋白78 mRNA、CHOP mRNA以及葡萄糖調節(jié)蛋白78蛋白、CHOP蛋白、胱天蛋白酶12表達水平均明顯升高，即異槲皮苷可促進內質網應激相關指標的表達，且隨著異槲皮苷所用劑量的升高，對于各項指標的促進作用增強，各組間差異有統計學意義（P<0.05）。見圖2、表2。

2.3 異槲皮苷促進SiHa細胞發(fā)生自噬 與對照組比較，不同劑量異槲皮苷作用后LC3Ⅱ和LC3Ⅰ蛋白表達比值明顯升高，Beclin 1蛋白表達水平明顯升高，P62蛋白表達水平明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖3、表3。

2.4 異槲皮苷誘導SiHa細胞凋亡 與對照組細胞比較，異槲皮苷作用后細胞凋亡率較對照組明顯升高（P<0.05），且隨著異槲皮苷劑量的升高，細胞凋亡率也呈明顯增高的趨勢。在異槲皮苷作用后，Bcl-2蛋白表達水平較對照組明顯降低，Bax蛋白和Cl-胱天蛋白酶-3蛋白表達水平較對照組明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖4、表4。

2.5 異槲皮苷抑制SiHa細胞中JAK/信號轉導及轉錄激活蛋白通路磷酸化水平 各組JAK2蛋白和信號轉導及轉錄激活蛋白3蛋白表達量比較，差異無統計學意義（P>0.05）。p-JAK2蛋白和p-信號轉導及轉錄激活蛋白3蛋白在低、中、高劑量異槲皮苷作用后表達水平與對照組比較均明顯降低，且p-JAK2蛋白和p-信號轉導及轉錄激活蛋白3水平隨異槲皮苷劑量升高而降低，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖5，表5。

3 討論

宮頸癌是一種臨床較為常見的、發(fā)生于宮頸部位的婦科惡性腫瘤，其臨床表現主要是陰道出血、陰道排液等癥狀，且多發(fā)病于絕經初期及圍絕經期的女性[13]。宮頸癌的轉移和復發(fā)是導致患者死亡的主要原因。宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展、消退與細胞凋亡有著密切聯系，誘導癌細胞凋亡已是腫瘤治療的熱點和新靶點[14]。近年的研究發(fā)現，異槲皮苷可誘導癌癥細胞凋亡，且可能存在抑制細胞癌化的作用[15-16]。

研究發(fā)現，內質網應激（Endoplasmic Reticulum Stress，ERS）發(fā)生于多種形式的癌癥中，可能是調節(jié)細胞凋亡和增殖的重要環(huán)節(jié)[17]。未折疊蛋白質反應（Unfolded Protein Reaction，UPR）是介導ERS發(fā)生最重要的信號機制。葡萄糖調節(jié)蛋白78是參與UPR的標志性蛋白分子，可以用來提示ERS的發(fā)生。當ERS激活時間延長時，可能通過CHOP和胱天蛋白酶12的過表達引發(fā)細胞凋亡。CHOP可以改變許多凋亡相關基因的表達，通過線粒體依賴途徑誘導細胞凋亡[18]。胱天蛋白酶12凋亡信號通路是ERS獨有的凋亡轉導途徑，有研究發(fā)現，在ERS過度狀態(tài)下胱天蛋白酶12凋亡信號通路會被激活，活化形式的裂解胱天蛋白酶-12（Cl-caspase-12）和裂解胱天蛋白酶-3（Cl-caspase-3）蛋白表達水平顯著升高，從而介導應激細胞凋亡[19]。本研究結果發(fā)現，異槲皮苷可促進葡萄糖調節(jié)蛋白78、CHOP和胱天蛋白酶12蛋白的表達，說明異槲皮苷可激活內質網應激途徑。

研究發(fā)現，適度的ERS可通過UPR產生細胞保護作用，但當ERS持續(xù)存在或應激過度則會誘導細胞自噬和凋亡的發(fā)生[20-21]。Kassan等[22]研究發(fā)現，血管緊張素Ⅱ會誘導高血壓小鼠延髓腹外側區(qū)頭端區(qū)發(fā)生ERS，p-eIF2α與ATF4-CHOP表達升高，從而導致自噬發(fā)生。本研究結果發(fā)現，異槲皮苷作用后可明顯抑制Bcl-2蛋白和P62蛋白的表達，促進Beclin 1蛋白、Bax蛋白和Cl-胱天蛋白酶-3蛋白表達，LC3Ⅱ和LC3Ⅰ蛋白表達量的比值明顯升高，推測異槲皮苷可能通過激活內質網應激途徑，從而促進細胞自噬和凋亡的發(fā)生。Wang等[23]發(fā)現維替泊芬（Verteporfin，VP）能激活內質網應激途徑，且VP處理后的宮頸癌細胞凋亡變化依賴于內質網應激途徑，這與本研究結果具有一致性。

研究發(fā)現，JAK2/信號轉導及轉錄激活蛋白3信號轉導通路涉及生長、發(fā)育、腫瘤生成、炎癥反應等生理和生物學作用過程[24-25]。在惡性腫瘤中JAK2/信號轉導及轉錄激活蛋白3信號通路處于持續(xù)活化狀態(tài)，JAK2與信號轉導及轉錄激活蛋白3會發(fā)生磷酸化，活化的信號轉導及轉錄激活蛋白3能不斷進入細胞核中使其調控的下游靶基因表達失調，導致細胞異常增殖、侵襲和轉移，并導致其向惡性轉化[26-27]。趙林和劉四清[28]研究發(fā)現，JAK2/信號轉導及轉錄激活蛋白3信號通道可能參與介導調節(jié)宮頸癌組織中bax、bcl-2的表達，從而達到誘導癌細胞凋亡的作用。本研究結果發(fā)現，異槲皮苷可抑制p-JAK2蛋白和p-信號轉導及轉錄激活蛋白3蛋白表達，抑制JAK2/信號轉導及轉錄激活蛋白3信號通路的激活，從而對細胞增殖和凋亡起到調控作用。

綜上所述，異槲皮苷可通過激活內質網應激途徑，進一步激活凋亡信號通路，從而誘導細胞凋亡。且異槲皮苷可通過抑制JAK2/信號轉導及轉錄激活蛋白3信號通路對宮頸癌細胞的增殖和凋亡起到調控作用。

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（2021-12-31收稿 本文編輯：張雄杰）

基金項目：國家自然科學基金青年科學基金項目（81601259）

作者簡介：蔡穎（1995.09—），女，碩士研究生在讀，研究方向：婦產科學，E-mail1：559007956@qq.com

通信作者：楊英捷（1964.11—），男，博士，主任醫(yī)師，研究方向：婦產科學，E-mail1：edusclt@vip.163.com