復(fù)方黃柏液對內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移成管影響的機制研究

陳潤銘　杜玉青　李友山　劉亞莉　劉鳳桐　謝存香　安琪　董學(xué)宇

摘要 目的：探索復(fù)方黃柏液對內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移成管影響的機制，為復(fù)方黃柏溶液用于治療糖尿病足潰瘍提供依據(jù)。方法：用CCK-8法檢測藥物毒性，探索復(fù)方黃柏液使用的最佳藥物濃度、CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活力、細(xì)胞劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移率、成管實驗檢測細(xì)胞成管能力、蛋白質(zhì)印跡法（Western Blotting）實驗檢測蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果：使用復(fù)方黃柏液后，高糖組內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、成管能力較前有了提高，并降低了促血管生成素2（Ang-2）蛋白水平，增加血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和磷酸化酪氨酸激酶受體-2（P-Tie）蛋白水平。結(jié)論：復(fù)方黃柏液通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、成管以及影響蛋白表達(dá)水平，改善內(nèi)皮功能障礙來實現(xiàn)對糖尿病足潰瘍的恢復(fù)。

關(guān)鍵詞 復(fù)方黃柏液;中藥復(fù)方制劑;內(nèi)皮細(xì)胞;增殖;遷移;成管;機制;糖尿病足潰瘍

Effect and Mechanism of Fufang Huangbai Liquid on Proliferation，Migration，and Tube Formation of Endothelial Cells

CHEN Runming，DU Yuqing，LI Youshan，LIU Yali，LIU Fengtong，XIE Chunxiang，AN Qi¹，DONG Xueyu

（1 Department of Peripheral Blood Vessels，Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China;

2 Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China;

3 Hebei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Shijiazhuang 050013，China）

Abstract Objective：To explore the effect and mechanism of Fufang Huangbai Liquid on endothelial cell proliferation，migration，and tube formation and provide evidence for the treatment of diabetic foot ulcer by Fufang Huangbai Liquid.Methods：Cell Counting Kit-8（CCK-8） was used for the detection of drug toxicity to determine the optimal concentration of Fufang Huangbai Liquid.Cell proliferation activity was detected by CCK-8 assay，cell migration rate by wound healing assay，tube formation ability by tube formation assay，and protein expression changes by Western blot.Results：After Fufang Huangbai Liquid treatment，the proliferation，migration，and tube formation abilities of endothelial cells in the high-glucose group were potentiated.Furthermore，the angiopoietin 2（Ang2） protein expression was reduced，and the protein expression levels of vascular endothelial growth factor（VEGF） and phosphorylated tyrosine kinase receptor-2（p-Tie2） were up-regulated.Conclusion：Fufang Huangbai Liquid can relieve diabetic foot ulcer by promoting endothelial cell proliferation，migration，and tube formation，affecting protein expression，and improving endothelial dysfunction.

Keywords Fufang Huangbai Liquid; Chinese medicinal compound preparations; Endothelial cell; Proliferation; Migration; Tube formation; Mechanism; Diabetic foot ulcer

中圖分類號：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.06.006

糖尿病足是糖尿病最嚴(yán)重和危險的并發(fā)癥之一，它具有高致殘率、難愈合的特點。在最新版的糖尿病足防治指南指出，我國糖尿病足潰瘍的年發(fā)病率為8.1%，Wagner 3級以上的患者占到了45%，總截肢率19.03%，年死亡率為14.4%[1]。糖尿病足一旦發(fā)生，由于患者長期處于高血糖狀態(tài)，血管新生緩慢，愈合異常艱難。因而控制糖尿病足進(jìn)一步惡化以及促進(jìn)糖尿病足潰瘍的愈合是糖尿病足研究的重點和難題。

近年來，有研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞具有促進(jìn)血管新生的作用，而糖尿病足潰瘍則一直因為血管再生困難成為治療難題[2]。因而越來越多學(xué)者開始研究糖尿病足潰瘍與內(nèi)皮細(xì)胞的關(guān)系。張瑩[3]認(rèn)為血管內(nèi)皮功能紊亂是糖尿病足的始動環(huán)節(jié)，改善內(nèi)皮功能已經(jīng)成為糖尿病足治療的目標(biāo)之一。李桃等[4]認(rèn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞是糖尿病足潰瘍愈合的重要參與者。除此之外，中醫(yī)藥與內(nèi)皮細(xì)胞的關(guān)系也受到了關(guān)注。有研究表明，中藥能夠通過提高內(nèi)皮細(xì)胞生長因子水平等多途徑來保護內(nèi)皮細(xì)胞[5]。

中醫(yī)外治在糖尿病足潰瘍治療中發(fā)揮著特色的中醫(yī)藥作用。塌漬法屬于外治法的一種，它最早見于《劉涓子鬼遺方》的“豬蹄湯洗瘡”，利用中藥熬制而成的溶液對傷口進(jìn)行濕敷或者浸泡。復(fù)方黃柏液作為塌漬法的常用藥物之一，被廣泛應(yīng)用于改善糖尿病足潰瘍、肛周膿腫、濕疹等疾病。其中復(fù)方黃柏液對促進(jìn)糖尿病足潰瘍恢復(fù)效果尤為突出[6]。但復(fù)方黃柏液有關(guān)糖尿病足潰瘍的作用機制臨床鮮少報道。本研究探索復(fù)方黃柏液對內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移成管影響的機制，為復(fù)方黃柏溶液用于糖尿病足潰瘍治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 內(nèi)皮細(xì)胞購自無錫菩禾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，批號：CL-463。內(nèi)皮細(xì)胞在37 ℃，5% CO條件下加入10%胎牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS）在平衡鹽溶液（Earle′s Balanced Salt Solution，EBSS）培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.1.2 藥物 復(fù)方黃柏液（山東漢方制藥，生產(chǎn)批號：19042011）;葡萄糖（上海國藥，生產(chǎn)批號：63005518）;氯沙坦（上海陶術(shù)生物科技有限公司，生產(chǎn)批號：T0215L）

1.1.3 試劑與儀器 FBS（北京沃凱生物技術(shù)有限公司，批號：SH30084.03）;0.25%胰酶（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：C0205）;細(xì)胞計數(shù)試劑（Cell Counting Kit-8，CCK8）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：C0037）;Matrigel基底膠（BD Incorporated公司，美國，批號：354248）;Calcein AM（鈣黃綠素乙酰甲酯）、麗春紅S（北京索萊寶科技有限公司，批號：P8330、型號：C7600）;BCA蛋白定量試劑盒（廣州賽國科技公司，批號：BL521A）;聚偏二氟乙烯（Polyvinylidenefluoride，PVDF）膜（millipore公司，美國，批號：HATF00010）。細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Scientific公司，美國，型號：8000）;低速離心機（上海盧湘儀，型號：TDZ4B-WS）;倒置顯微鏡（OLYMPUS公司，日本，型號：IX71）;酶標(biāo)檢測儀（Thermo公司，型號：MK3）;光學(xué)顯微鏡（上海精密公司生產(chǎn)，型號：XDS-1A）;電泳儀（BIO-RAD公司，美國，型號：mini protean 3 cell）;電轉(zhuǎn)儀（大連競邁科技有限公司生產(chǎn)，型號：PS-9）;一體式化學(xué)發(fā)光成像儀（上海勤翔科學(xué)儀器公司生產(chǎn)，型號：5300 Pro）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 1）CCK-8法檢測藥物毒性。實驗設(shè)置8個組，觀察組按照1∶10，1∶20，1∶40，1∶80，1∶160，1∶320，1∶640（對應(yīng)的濃度分別為20 mg/mL，10 mg/mL，5 mg/mL，2.5 mg/mL，1.25 mg/mL，0.63 mg/mL，0.31 mg/mL）給藥復(fù)方黃柏液，空白組只有培養(yǎng)基，不加入復(fù)方黃柏液。2）CCK-8法檢測內(nèi)皮細(xì)胞增殖實驗、細(xì)胞劃痕實驗、成管實驗;蛋白質(zhì)印跡法（Western Blotting）實驗將設(shè)置A空白組、B高糖處理組（33 mmol/L）、C高糖處理組+復(fù)方黃柏涂液（1∶100、1∶200、1∶400）、D高糖處理組+氯沙坦（20 μmol/L）、E高糖處理組+復(fù)方黃柏涂液（1∶100）+氯沙坦（20 μmol/L）。

1.2.2 給藥方法 1）取處于對數(shù)生長周期的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，在相應(yīng)的孔中，加入濃度為20 mg/mL，10 mg/mL，5 mg/mL，2.5 mg/mL，1.25 mg/mL，0.63 mg/mL，0.31 mg/mL的復(fù)方黃柏液。2）A組僅保留培養(yǎng)基;B組給予33 mmol/L高糖處理;C組表示內(nèi)皮細(xì)胞給予33 mmol/L高糖后分別與濃度2 mg/mL、1 mg/mL、0.5 mg/mL的復(fù)方黃柏涂液（即原液1∶100、原液1∶200、原液1∶400）處理;D組表示內(nèi)皮細(xì)胞給予33 mmol/L高糖處理與20 μmol/L氯沙坦處理;E組表示內(nèi)皮細(xì)胞給予33 mmol/L高糖、2 mg/mL復(fù)方黃柏涂液和20 μmol/L氯沙坦處理。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法 1）CCK-8法檢測藥物毒性實驗。將內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)蘇，復(fù)蘇24 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞密度到達(dá)80%以上時，表示能傳代。用FBS漂洗2遍，加入0.25%的胰酶消化細(xì)胞，待細(xì)胞變圓后吸去胰酶，加入完全培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞吹打為單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞混勻;按一定的比例將細(xì)胞進(jìn)行分盤，加適量培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，放入37 ℃、5%濃度的CO培養(yǎng)箱中;待細(xì)胞長至對數(shù)生長期，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10 個/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，在37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h;24 h后，給每孔加入20 μL的CCK-8，在37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育2 h;酶標(biāo)儀450 nm波長測量光密度（Optical Density，OD），根據(jù)OD值進(jìn)行細(xì)胞活性分析。抑制率=1-觀察組OD/對照組OD。2）CCK-8檢測內(nèi)皮細(xì)胞增殖實驗。將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10 個/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，37 ℃，5% CO培養(yǎng)24 h，按照上述組別給藥24 h后，每孔加入20 μL的CCK8，在37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育2 h測出OD值，分析細(xì)胞的增殖情況。3）細(xì)胞劃痕實驗。直尺、記號筆等實驗儀器操作前紫外照射30 min，用記號筆在3.5 cm皿背后大約每隔0.5～1 cm用直尺均勻地劃橫線，每孔至少穿過5條線。在3.5 cm蒸發(fā)皿加入約含3×10個細(xì)胞懸液，保證過夜細(xì)胞密度為90%左右。第2天用200 μL槍頭比著直尺，盡量垂直于背后的橫線劃痕。用FBS洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞。處理24 h后，顯微鏡下拍照，測量劃痕寬度，觀察細(xì)胞遷移情況。4）成管實驗，實驗前1 d，將Matrigel基質(zhì)膠放入4 ℃冰盒過夜溶解，槍頭盒、EP管、96孔板均4 ℃過夜預(yù)冷;次日在冰盒上進(jìn)行鋪膠，將Matrigel基質(zhì)膠50 μL/孔加入96孔板，37 ℃培養(yǎng)箱中放置30 min;在膠凝固的過程中，按照分組，準(zhǔn)備細(xì)胞懸液，細(xì)胞消化后將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整到1×10 個/mL。每孔接種10 000細(xì)胞，然后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。24 h后加入鈣黃綠素染色，鈣黃綠素氨酰酯（Calcein Acetoxymethyl Ester，Calcein AM）終濃度為0.25 μg/mL。鈣黃綠素染色30 min后于熒光顯微鏡下觀察拍照。5）Western Blotting實驗。按照分組給藥24 h后，用放射免疫沉淀法（Radio-Immunoprecipitation Assay，RIPA）裂解細(xì)胞，并加入適量的蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟（Phenylmethylsulfonyl Fluoride，PMSF），置于冰上裂解、離心后棄上清提取細(xì)胞總蛋白。通過BCA蛋白定量試劑盒確定各組總蛋白濃度，然后通過蛋白定量結(jié)果上樣、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium Dodecyl Sulate（SDS）-Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE）、轉(zhuǎn)膜。用麗春紅染色檢測轉(zhuǎn)膜是否成功。封膜及孵育抗體、顯色拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，若符合正態(tài)分布，2組間比較采用配對樣本t檢驗，3組以上選擇單因素方差分析，若不符合正態(tài)分布，則采用秩和檢驗。計數(shù)資料用百分率表示，采用χ檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方黃柏液對細(xì)胞的毒性呈濃度依賴性 測得OD值與抑制率結(jié)果顯示，濃度越高，抑制率越高，即復(fù)方黃柏液濃度越高對細(xì)胞毒性越大。其IC值為13.499 1 mg/mL。如圖1。

2.2 復(fù)方黃柏液增強高糖細(xì)胞活性 當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞給予高糖處理后，OD值明顯下降，細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞活性顯著下降（P<0.01）。細(xì)胞高糖處理后給予復(fù)方黃柏液處理，細(xì)胞活性增強（P<0.01）。內(nèi)皮細(xì)胞高糖處理同時給予氯沙坦（20 μmol/L）處理，細(xì)胞活性相對高糖處理有一定程度的升高，而此時再給予復(fù)方黃柏液（1∶100）處理時細(xì)胞活性進(jìn)一步增強（P<0.01）。見圖2。

2.3 復(fù)方黃柏液提高高糖細(xì)胞遷移能力 與對照組比較，高糖組細(xì)胞遷移率出現(xiàn)明顯下降（P<0.001）;與高糖組比較，加入復(fù)方黃柏液后，細(xì)胞遷移率有增長趨勢（P<0.05）;但當(dāng)復(fù)方黃柏液濃度為1∶200、1∶400，此2組與高糖組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。高糖組給予氯沙坦（20 μmol/L）處理，細(xì)胞遷移較高糖組強（P<0.05），加入復(fù)方黃柏液后，細(xì)胞遷移能力進(jìn)一步增強（P<0.01）。見圖3。

2.4 復(fù)方黃柏液促進(jìn)細(xì)胞成管能力 7個組別在熒光顯微鏡成像，各組成管能力見圖4。與對照組比較，高糖導(dǎo)致細(xì)胞管腔數(shù)目減少，成管能力減弱（P<0.01）。加入復(fù)方黃柏液或氯沙坦后，細(xì)胞成管能力較高糖組增強（P<0.05），其中復(fù)方黃柏液的濃度增強，成管能力增強，但仍小于對照組。

2.5 復(fù)方黃柏液具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長的作用 Western Blotting結(jié)果顯示高糖導(dǎo)致促血管生成素2（Angiopoietin-2，Ang-2）蛋白水平增加（P<0.01），與較高糖組比較，加入復(fù)方黃柏液及氯沙坦的組別出現(xiàn)Ang-2蛋白水平降低（P<0.05）。高糖導(dǎo)致血管內(nèi)皮生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）蛋白水平和P-Tie2即磷酸化酪氨酸激酶受體-2（Endothelial-enriched Tunica Interna Endothelial Cell Kinase 2，P-Tie2）蛋白水平下降（P<0.01），而加入復(fù)方黃柏液及氯沙坦組別的VEGF和p-tie蛋白水平較高糖組升高（P<0.01）。見圖5。

3 討論

糖尿病足屬中醫(yī)學(xué)之“脫疽”，指發(fā)于四肢末端，嚴(yán)重時趾（指）節(jié)壞疽脫落的一種慢性周圍血管疾病。糖尿病足創(chuàng)面處理是目前治療糖尿病足潰瘍最主要的治療方式之一。常用的創(chuàng)面處理方式有用液體傷口敷料、生長因子進(jìn)行換藥或封閉式負(fù)壓引流[7]。中醫(yī)的塌漬法則是在此基礎(chǔ)上提供的新選擇。塌漬法既無注射或口服給藥帶來的肝、腎損害，又不會破壞內(nèi)服藥物療效，具有綠色健康、療效顯著的特點。由于塌漬法有促進(jìn)炎癥消退、去腐、改善瘡周微循環(huán)，促進(jìn)肉芽生長的作用，所以塌漬法常被用于糖尿病足的治療[8]。

復(fù)方黃柏液是全國著名骨髓炎專家謝景龍主任醫(yī)師經(jīng)過30多年的外科臨床經(jīng)驗總結(jié)而來，他運用散結(jié)排膿、清熱解毒的連翹與能解毒療瘡、清熱燥濕的黃柏作為君藥，選用性苦甘寒，能夠清熱解毒散結(jié)的蒲公英與氣味芳香，透達(dá)祛邪，具有清熱解毒作用的金銀花共為臣藥來增強連翹、黃柏的排膿、解毒之功;蜈蚣具有通絡(luò)散結(jié)、退炎治瘡的功效。用量雖小卻能增強破血逐瘀功效。諸藥合用，有清熱解毒、消腫排膿、去腐生肌之功。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為脫疽在濕熱毒盛，熱盛肉期開始出現(xiàn)破潰，這個時期應(yīng)該要用清熱解毒的藥物，而復(fù)方黃柏液是由清熱解毒藥物組成的復(fù)方溶劑。復(fù)方黃柏液直接作用于患處，易被創(chuàng)面吸收，使腠理開疏，藥力直達(dá)病所，促進(jìn)靜脈、淋巴回流，改善患處周圍微循環(huán)，進(jìn)而對潰瘍面起到一個消炎鎮(zhèn)痛、促進(jìn)傷口愈合的作用。李友山等[9]和徐炯[10]將局部應(yīng)用復(fù)方黃柏液涂劑沖洗及浸潤作為觀察組，用其他的洗劑作為對照組進(jìn)行療效觀察。結(jié)果顯示觀察組的療效要優(yōu)于對照組（P<0.05），證實了復(fù)方黃柏液涂劑具有明顯促進(jìn)糖尿病足潰瘍愈合的作用，然而復(fù)方黃柏液作用于糖尿病足潰瘍機制仍不明確。

已有研究證實內(nèi)皮細(xì)胞具有增強血管生成和促進(jìn)傷口修復(fù)的作用，血管生成不足導(dǎo)致的傷口修復(fù)能力降低是糖尿病病足潰瘍難愈合的重要原因[11]。蘆陽和劉宏偉[12]認(rèn)為內(nèi)皮細(xì)胞通過分泌，誘導(dǎo)自身的增殖參與血管新生。完整的血管形成需要經(jīng)歷內(nèi)皮細(xì)胞被激活，內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖形成血管周圍的基質(zhì)以及萌芽狀結(jié)構(gòu)、環(huán)狀結(jié)構(gòu)[13]。因此內(nèi)皮細(xì)胞對傷口愈合起到至關(guān)重要的作用。本實驗選用的是人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，是血管生成實驗的經(jīng)典模式細(xì)胞[14]。根據(jù)內(nèi)皮細(xì)胞的生成過程，本研究設(shè)計了4個實驗，囊括血管生成的增值、遷移、成管基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌等過程，旨在挖掘復(fù)方黃柏液與血管內(nèi)皮細(xì)胞的關(guān)系，找到復(fù)方黃柏液治療糖尿病足的起效原因。

高糖組模擬的是糖尿病患者的細(xì)胞情況，高糖組加入藥物則反映的是糖尿病足潰瘍用藥之后的狀態(tài)，結(jié)果顯示運用復(fù)方黃柏液后的細(xì)胞遷移、成管、增殖都比高糖組細(xì)胞提高（P<0.05）。在之前的研究表明高糖會誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，造成血管新生困難[15]。而我們的實驗則發(fā)現(xiàn)復(fù)方黃柏液對內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、成管具有促進(jìn)作用，進(jìn)一步說明復(fù)方黃柏液能夠改善高糖導(dǎo)致的內(nèi)皮功能障礙。實驗中還增加了一組氯沙坦作為參照。管緋等[16]認(rèn)為氯沙坦能增加血液的供應(yīng)，改善受損的血液循環(huán)情況，促進(jìn)糖尿病足潰瘍的愈合。鄭麗麗等[17]實驗發(fā)現(xiàn)氯沙坦通過影響晚期糖基化終末產(chǎn)物（Advanced Glycation End-products，AGEs）能夠減少糖尿病血管病變的發(fā)生。單純使用氯沙坦與氯沙坦、復(fù)方黃柏液聯(lián)合使用結(jié)果顯示，聯(lián)合使用的效果比單純應(yīng)用氯沙坦要好（P<0.05）。這進(jìn)一步說明了復(fù)方黃柏液對治療糖尿病足潰瘍有明顯療效。血管的生成還要受到多種因子的影響，尤其是受到生長因子的影響，因此生長因子的數(shù)量變化也可以側(cè)面反映出血管重建所處的狀態(tài)。Western Blotting實驗選取了內(nèi)皮細(xì)胞重建中的重要因子包括Tie-2、VEGF、Ang-2，通過復(fù)方黃柏液對這幾種蛋白的影響來觀察其對內(nèi)皮細(xì)胞的作用。VEGF誘導(dǎo)血管生成以及血管滲透，在血管生成調(diào)節(jié)中起著核心作用[18]。梁清月等[19]發(fā)現(xiàn)糖尿病足患者的VEGF水平要比血糖正常人低，這也說明VEGF水平變化可以起到評價糖尿病足療效好壞的作用。VEGF通過內(nèi)皮特異性受體酪氨酸激酶家族的成員起作用，Tie-2的受體酪氨酸激酶就是成員之一[20]。它是最新發(fā)現(xiàn)的血管生成信號通路[21]。p-Tie2即磷酸化的Tie2，是Tie2的活化狀態(tài)，更能反映血管生成和血管結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。因此磷酸化水平越高，血管生成越穩(wěn)定。在本實驗中，VEGF和p-tie蛋白水平升高說明使用復(fù)方黃柏液后的內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)了一定的生長，也就是證實了復(fù)方黃柏能夠加速糖尿病足潰瘍創(chuàng)面內(nèi)皮細(xì)胞增殖進(jìn)而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。Benigni等[21]認(rèn)為血管緊張素系統(tǒng)在高血壓的病因和人類心臟和腎臟疾病的病理生理學(xué)中起著一定的作用。Ang-2是該系統(tǒng)的核心產(chǎn)物，Ang-2增加血管氧氣的產(chǎn)生，并誘導(dǎo)內(nèi)皮一氧化氮（Nitric Oxide，NO）合成酶脫鉤，從而進(jìn)一步增強血管組織的氧化應(yīng)激，因而降低了NO的可用性。當(dāng)NO作用受限時，血管舒張功能也會受到限制[22]。而本研究結(jié)果顯示Ang-2下降，一氧化氮受限會減弱，其對血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護作用得以保留。

綜上所述，復(fù)方黃柏液通過促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移、成管以及影響蛋白表達(dá)水平來實現(xiàn)對糖尿病足潰瘍的康復(fù)，這為其治療糖尿病足潰瘍提供了理論依據(jù)，為進(jìn)一步找到其治療靶點提供了實驗基礎(chǔ)。本研究也存在一些不足之處，未找到復(fù)方黃柏液作用于糖尿病足潰瘍的通路，從阻斷通路的途徑來反向證明復(fù)方黃柏液對糖尿病足潰瘍的作用，目前相關(guān)研究報道較少，缺乏驗證依據(jù)，課題組將在日后深入對復(fù)方黃柏液與內(nèi)皮細(xì)胞關(guān)系的研究，進(jìn)一步完善復(fù)方黃柏液對血管內(nèi)皮細(xì)胞機制的研究。

參考文獻(xiàn)

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（2020-03-03收稿 本文編輯：王明）

基金項目：國家自然科學(xué)基金面上項目（81973849-H2709）——基于AGEs-bFGF/PDGF-β通路研究中醫(yī)外治“溻漬法”促進(jìn)糖尿病足潰瘍愈合的分子機制;北京中醫(yī)藥大學(xué)2017“青苗人才”計劃項目（DZMYS-201701）——中醫(yī)外治“溻漬法”（復(fù)方黃柏液涂劑）調(diào)控血管新生作用及其機制研究;北京中醫(yī)藥大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費項目（2016-JYB-JSPY-018）——中藥外治干預(yù)大鼠自體骨髓干細(xì)胞移植治療糖尿病潰瘍對miRNA-146a的影響

作者簡介：陳潤銘（1995.08—），女，碩士研究生在讀，研究方向：中醫(yī)外科治療周圍血管疾病，E-mail：chenrm95@163.com

通信作者：李友山（1979.10—），男，博士，副教授，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向中醫(yī)外科治療周圍血管疾病，E-mail：lys4626@sina.com