基于分子對接與數(shù)據挖掘探討生姜解半夏毒的相關機制

李浩然　李維英　吳宏赟　彭偉　周嘉培

摘要 目的：基于分子對接與數(shù)據挖掘研究生姜解半夏毒的作用機制。方法：通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據庫與分析平臺（TCMSP）檢索生姜有效成分，通過SwissTargetPrediction數(shù)據庫預測生姜成分靶點，經Swiss-model同源建模半夏凝集素后進行分子對接。通過DisGeNET數(shù)據庫獲取炎癥相關靶點，通過基因映射獲取生姜治療炎癥的作用靶點。應用String構建靶點蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡并篩選關鍵基因。對靶點基因進行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析。結果：篩選得到生姜有效成分5種，與半夏凝集素均有較強結合力。生姜治療炎癥靶點49個，關鍵靶點有15個，包括MMP9、HSP90AA1、PPARG、RELA、APP、ICAM1、MMP2、mTOR等。通過GO與KEGG富集分析，49個靶點基因涉及急性炎癥反應、炎癥反應的調節(jié)、炎癥介質的產生、T細胞的激活、淋巴細胞遷移生物過程，且主要富集于Th17細胞分化相關通路。結論：生姜對半夏毒性成分產生抑制作用并通過減輕炎癥反應來發(fā)揮解毒作用。

關鍵詞 生姜;半夏;半夏凝集素;毒性;同源建模;分子對接;信號通路;炎癥

Mechanism of Zingiberis Rhizoma Recens in Detoxification of Pinelliae Rhizoma

Based on Molecular Docking and Data Mining

LI Haoran，LI Weiying，WU Hongyun，PENG Wei，ZHOU Jiapei

（1 Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji′nan 250014，China; 2 Weifang Maternal and Child Health Hospital，

Weifang 261011，China; 3 Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji′nan 250014，China）

Abstract Objective：To explore the mechanism of Zingiberis Rhizoma Recens in the detoxification of Pinelliae Rhizoma based on molecular docking and data mining.Methods：The chemical ingredients of Zingiberis Rhizoma Recens were obtained from the Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP）.The targets related to Zingiberis Rhizoma Recens were predicted from SwissTargetPrediction.Molecular docking was carried out after homologous modeling of agglutinin from Pinelliae Rhizoma by Swiss-model.Targets related to inflammation were screened out from DisGeNET，and the targets of Zingiberis Rhizoma Recens against inflammation were obtained by gene mapping.The protein-protein interaction（PPI） network of Zingiberis Rhizoma Recens in the treatment of inflammation was delineated by String，and the key genes were screened out.Gene Ontology（GO） and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） enrichment analyses were performed on target genes.Results：Five types of active compounds of Zingiberis Rhizoma Recens had strong binding force with agglutinin from Pinelliae Rhizoma.There were 49 targets of Zingiberis Rhizoma Recens in the treatment of inflammation，and 15 were key ones，including MMP9，HSP90AA1，PPARG，RELA，APP，ICAM1，MMP2，and mTOR.As revealed by GO and KEGG enrichment analyses，49 target genes were involved in biological processes such as acute inflammatory response，regulation of inflammatory response，inflammatory mediator production，T cell activation，and lymphocyte migration，and mainly enriched in the signaling pathways related to Th17 cell differentiation.Conclusion：Zingiberis Rhizoma Recens can inhibit the toxicity produced by Pinelliae Rhizoma by reducing inflammatory responses.

Keywords Zingiberis Rhizoma Recens; Pinelliae Rhizoma; Pinelliae Rhizoma agglutinin; Toxicity; Homologous modeling; Molecular docking; Signaling pathways; Inflammation

中圖分類號：R289.5;R282文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.06.003

半夏為天南星科植物半夏的塊莖，經炮制后入藥，味辛，性溫，具有溫化寒痰之功效。然而生半夏多有毒，體現(xiàn)為對舌、咽喉具有強烈的刺激性，使口腔、舌咽麻木腫脹，出現(xiàn)惡心嘔吐等胃腸道癥狀，甚至影響呼吸，導致支氣管痙攣麻痹而死亡。半夏的應用歷史悠久，生姜可使半夏的毒性大大降低，早在《長沙藥解》就有記載：“洗去白礬用，妊娠姜汁炒。”《肘后備急方》中記載：“中半夏毒，生姜汁解之。”《中藥大辭典》指出：“生姜解半夏、天南星及魚蟹、鳥獸肉毒?！辈胂牡呐谥品偨Y為姜半夏、清半夏、法半夏、生半夏4種。目前國內對于生姜解半夏毒的研究存在不同意見，一種觀點認為生姜對降低半夏毒性并無作用，姜半夏炮制過程中加入的明礬才是降低毒性的真正原因;另一種觀點認為生姜能抑制多種炎癥介質，通過緩解炎癥反應來降低半夏的毒性[1]。然而，2種觀點均未涉及生姜對半夏毒性成分是否存在直接抑制作用。目前國內學者已對半夏的毒性進行了深入研究，發(fā)現(xiàn)半夏中主要的毒性成分半夏毒針晶是一種由草酸鈣和半夏凝集素（Pinellia Ternata Agglutinin，PTA）組成的復合物，其刺入舌頭和咽喉的組織中破壞細胞，引發(fā)炎癥反應[2]。已有實驗表明，使用明礬溶液浸泡半夏毒針晶后，溶液中的AL3+與草酸鈣中的CO2-結合，能破壞草酸鈣的結構，從而證明了明礬的解毒作用[3]。另有實驗發(fā)現(xiàn)生姜能抑制白細胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）的分泌與拮抗半夏所致滲出液中前列腺素E（Prostaglandin E，PGE）的增加，證明了生姜能夠通過緩解炎癥反應來降低半夏的毒性[4-5]。然而生姜能否對半夏毒針晶中的PTA產生直接抑制作用以及生姜對抗半夏所引起炎癥反應的機制仍未完全明了，本研究借助生物信息學就這兩方面展開進一步研究。

1 資料與方法

1.1 生姜活性成分及作用靶點的提取 從中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）中檢索生姜的化學成分，并將上述檢索得到的化學成分根據藥代動力學（ADME）參數(shù)篩選有效成分，篩選條件為口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%、類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18。并根據篩選得到的有效成分，進一步提取并預測其對應的作用靶點。

1.2 PTA的同源建模 在進行分子對接前，需要確定蛋白質的空間結構。蛋白質數(shù)據庫（Protein Data Bank，PDB）是目前最主要的收集生物大分子結構的數(shù)據庫，而PDB數(shù)據庫未收錄PTA結構信息，因此需要通過在線同源建模系統(tǒng)Swiss-model來構建PTA的同源模型。首先從NCBI Protein數(shù)據庫檢索“Pinellia ternata agglutinin”，將檢索得到編號為AEZ35184.1的PTA序列輸入Swiss-model同源建模系統(tǒng)，Swiss-model根據蛋白序列找到1 361種已知蛋白模板，選擇其中最優(yōu)3種模板（5d5g.2.B、5j76.1.A、5ayw.1.B）進行下一步運算，經過計算得到3種PTA結構模型，經GMQE、QMEAN評價后，選擇最可靠的由5d5g.2.B構建的模型確定為PTA結構[6]。應用QMEAN對構建的PTA結構進行整體能量分析。

1.3 生姜有效成分與PTA分子對接 通過PubChem數(shù)據庫下載有效成分的化學結構式，并利用Chem 3D將其轉化為2D結構。將同源建模得到的PTA結構通過Discovery Studio預測活性位點，使用AutoDock Tools加氫、計算電荷、分配原子類型后，使用Autodock vina進行分子對接，最后采用Discovery Studio分析對接結果。PTA具有類似金字塔的外形結構，因蛋白本身不含配體，活性位點未知，故需要預測PTA活性位點。經過Discovery Studio運算得到PTA活性位點。配體與受體結合越穩(wěn)定其結合能量越低，生姜的5種有效成分中Clionasterol與PTA的結合能最低，結合最穩(wěn)定，因此以Clionasterol與PTA為例，簡要分析分子對接結果。

1.4 炎癥疾病基因的獲取 DisGeNET是目前涵蓋人類疾病基因最豐富的數(shù)據庫之一，以“Inflammation”作為檢索詞，尋找炎癥的相關基因。

1.5 預測生姜有效成分作用靶點并與疾病基因匹配 從TCMSP下載生姜有效成分的mol2結構文件，使用Babel轉換工具將結構文件轉換為SMILE格式，并將這5種有效成分的SMILE格式輸入SwissTargetPrediction，預測其作用靶點。Uniprot是國際知名的蛋白質數(shù)據庫，生姜有效成分作用的靶點蛋白在Uniprot中均有與其對應的Gene Symbol。將靶點蛋白Gene Symbol與炎癥相關基因進行匹配，并取交集，得到生姜對炎癥有治療作用的靶點。隨后對靶點進行String分析，以提取其關鍵作用靶點。

1.6 靶點蛋白的富集分析 使用Cytoscape插件ClueGo對靶點蛋白進行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析生物過程（Biological Process，BP）功能富集分析與京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，研究生姜治療炎癥的生物過程，研究其治療炎癥的作用通路，獲得各通路相關網絡圖，并根據重要程度繪制信號通路占比餅狀圖。

2 結果

2.1 生姜有效成分 共得到5種生姜有效成分。見表1。

2.2 PTA結構 PTA結構域上的殘基對于模板（5d5g.2.B）上的殘基，大都保持0.8以上的相似度，具有較好的相似性。PTA同源模型具有較高的穩(wěn)定性。見圖1。

PTA結構模型的整體能量值為-0.66（能量值越接近0穩(wěn)定性越好），能量值較低，符合模型穩(wěn)定性要求。PTA結構模型的全球模型質量估計（Global Model Quality Estimation，GMQE）評分（評分越高可信度越高）為0.21，可信度較高。見圖2。

2.3 生姜有效成分與PTA分子對接 PTA活性位點見圖3，紅色球體為PTA活性位點，5種有效成分在此位點與PTA結合。5種有效成分與PTA結合能均<-5.0 kcal/mol（1 cal=4.184 J），5種有效成分與PTA均有很好的結合力。見表2。

Clionasterol與PTA在活性位點發(fā)生結合，并與活性位點附近的氨基酸存在相互作用，其a環(huán)與Trp186、Phe231、Trp218形成疏水作用，與Trp186形成π-sigma作用;a、b環(huán)間的甲基與Leu179形成疏水作用;b環(huán)與Phe238形成疏水作用;c環(huán)與Lys183形成疏水作用。其結合方式見圖4。其余4種生姜有效成分與PTA的結合方式見表3。

2.4 生姜有效成分的靶點預測與炎癥基因的獲取 從TCMSP篩選出生姜有效成分共5種，共得到289個作用靶點。炎癥相關基因467個。生姜（Ginger）治療炎癥的作用靶點49個。見圖5。49個作用靶點PPI網絡見圖6。Count值篩選出前15位靶點為關鍵靶點。見圖7。

2.5 靶點蛋白的GO功能富集分析 49個基因的富集結果主要集中在急性炎癥反應（Acute inflammatory response）、炎癥反應的調節(jié)（Regulation of inflammatory response）、炎癥介質的產生（Cytokine production involved in inflammatory response）、T細胞的激活（T cell activation involved in immune response）、淋巴細胞遷移（Lymphocyte migration）、神經炎癥反應（Neuroinflammatory response）、白細胞介素-12的正向調節(jié)（Positive regulation of interleukin-12 production）等炎癥相關過程。見圖8。

2.6 靶點蛋白的KEGG富集分析 靶點蛋白KEGG信號通路富集分析發(fā)現(xiàn)，42.11%的基因顯著富集在Th17細胞分化（Th17 cell differentiation）相關信號通路，此外癌癥相關通路（Pathways in cancer）、流體剪切應力與動脈粥樣硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis）也存在富集，占比分別為28.95%、10.53%。見圖9、圖10。

3 討論

3.1 分子對接的意義 分子對接（Molecular Docking）是一種從已知結構的受體和配體出發(fā)，通過化學計量方法計算其分子間作用力以進行分子間相互作用識別的生物信息學方法。首先，分子對接技術可以極大提高藥物研究的效率。藥物研究過程一般是先找到在分子和細胞水平活性較好的化合物，然后再進行動物實驗，在這個過程中，利用分子對接找到活性較好、與目標靶點結合度較好的小分子化合物，能更有效地減少人力、物力和時間成本。其次，小分子化合物能夠與靶標生物大分子作用并抑制或激活蛋白質的生物功能[7]。因此依靠分子對接技術分析生姜有效成分與PTA的結合程度，能夠預測生

姜有效成分對PTA有無直接作用，為接下來的基礎驗證實驗提供方向并對進一步研究具有指導意義。

3.2 生姜對PTA的作用探討 南京中醫(yī)藥大學學者史閏均等[8]進行的與生姜解半夏毒相關的動物實驗表明，生姜灌胃給藥能明顯減輕半夏所致的炎癥反應，包括抑制小鼠毛細管通透性增加，降低炎癥介質PGE的釋放，減輕大鼠足腫脹的程度。說明生姜確實可以降低因服用半夏而導致的炎癥反應。然而，實驗中生姜汁均為灌胃給藥，半夏毒針晶生理鹽水混懸液均為局部注射，二者不存在直接接觸，無法說明生姜有效成分對半夏毒針晶及PTA存在直接抑制作用。而南京中醫(yī)藥大學吳皓等[9]進行的一項小鼠扭體實驗表明生姜汁配置的半夏混懸液與生理鹽水配置的半夏混懸液比較能顯著降低小鼠扭體發(fā)生率。本實驗生姜汁與半夏汁混合后通過腹腔注射進入小鼠體內，生姜有效成分與半夏毒性成分直接接觸。因此，有理由作出生姜有效成分對半夏毒性成分可能存在直接抑制作用的假設。為驗證這一假設，本研究通過分子對接技術，分析生姜有效成分與PTA的結合能力。

分子對接結果表明，生姜的5種有效成分與PTA結合較強，因為小分子化合物能夠與靶標生物大分子作用并抑制或激活蛋白質的生物功能，所以生姜有效成分對半夏毒性成分半夏毒針晶中的PTA很可能存在直接抑制作用，通過與小分子配體與蛋白質受體結合，抑制PTA的生物功能或破壞半夏毒針晶的結構[7]。然而此項結論并不嚴謹，因為分子對接是基于計算機運算的結果，仍需要基礎實驗驗證。目前國內有關生姜與半夏凝集素的研究仍較空白，本研究的分子對接結果有助于為相關實驗研究提供思路。

3.3 生姜減輕炎癥反應的機制研究 相關實驗表明生姜能夠明顯減輕半夏所致的炎癥反應，然而其抗炎機制仍未明了[8]。本研究通過基因映射發(fā)現(xiàn)生姜治療炎癥的靶點主要為MMP9、HSP90AA1、PPARG、RELA、APP、ICAM1、MMP2、mTOR。MMP9具有抗炎特性，其與口腔炎癥密切相關，有實驗表明敲除基質金屬蛋白酶（Matrix Metalloproteinase，MMP）9基因動物的牙周病變更大，炎癥反應更強，提示MMP9在炎癥反應中發(fā)揮重要作用[10-11];MMP2和MMP9所編碼的蛋白屬于MMPs中的明膠酶類，其與局部內皮損傷，引導血小板活化，誘導炎癥反應密切相關[12];細胞間黏附分子（Intercelluar Adhesion Molecule，ICAM）1使白細胞與內皮細胞間的黏附作用增強，并更容易穿過血管壁[13];實驗表明淀粉樣前體蛋白（Amyloid Precusor Protein，APP）與阿爾茨海默病的神經炎癥有關[14];哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian Target of Rapamycin，mTOR）在調節(jié)先天性免疫應答時有重要作用，雷帕霉素抑制mTOR后，通過增加核因子κB上調促炎癥介質的生成，同時通過抑制信號轉導及轉錄激活因子3（Signal Transduction and Activator of Transcription，STAT3）減少抗炎細胞因子IL-10的釋放[15-16]。

通過對生姜治療炎癥的靶點基因進行GO功能富集分析與KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，生姜對急性炎癥反應、炎癥反應的調節(jié)、炎癥介質的產生、T細胞的激活、淋巴細胞遷移、神經炎癥反應、白細胞介素-12的正向調節(jié)等炎癥相關過程有密切的影響。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，Th17細胞分化相關通路存在顯著富集，核因子κB信號通路也存在明顯富集。Th17細胞分泌的IL-17是一種重要的炎癥介質，它可以調控其他炎癥介質如IL-6、TNF-α以及趨化因子如單核細胞趨化蛋白（Monocyte Chemoattractant Protein，MCP）-1、巨噬細胞炎癥蛋白（Macrophage Inflammatory Protein，MIP）-2等的表達，來動員中性粒細胞，在炎癥反應中發(fā)揮積極作用[17]。相關實驗發(fā)現(xiàn)IL-17基因缺陷的小鼠更容易遭受肺部的細菌感染，其原因與中性粒細胞聚集減少相關[18]。核因子κB是細胞中的核轉錄因子，與很多疾病特別是慢性炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展機制密切相關[19]。核因子κB不僅與B細胞發(fā)育和功能有關，還與T細胞、胸腺細胞、巨噬細胞的發(fā)育有關[20]。故生姜有效成分可通過調控Th17細胞分化信號通路和核因子κB信號通路來治療炎癥。

4 小結

最早用生姜炮制半夏解半夏毒記載于《劉涓子鬼遺方》，經過現(xiàn)代藥理研究，姜制半夏炮制過程中加入的明礬對半夏毒針晶具有銹蝕、溶解作用，AlSO可以與不溶性草酸鈣反應，從而使其鋒利細長的針尖銹蝕、脫落、溶解，晶形結構破壞，從而失去刺激性的作用，證明了姜制半夏的炮制解毒作用[21]。另有研究發(fā)現(xiàn)生姜汁可使半夏對眼結膜刺激下降，對半夏的刺激反應呈現(xiàn)出較強的拮抗作用[22]。生姜汁冷浸半夏對小鼠腹腔刺激性與生半夏比較明顯降低[23]。因此，即使不加入明礬炮制，生姜對半夏仍存在解毒作用。本研究正是經過分子對接計算，發(fā)現(xiàn)生姜所含成分與半夏毒針晶中的PTA具有較強的結合力，因此推論，生姜有效成分會對半夏毒性成分產生抑制作用。

綜上所述，生姜解半夏毒主要通過3個方面來實現(xiàn)，一是姜制半夏，炮制減毒;二是生姜對半夏毒性成分產生抑制作用，三是生姜可以減輕半夏所致的炎癥反應。

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（2021-03-29收稿 本文編輯：楊覺雄）

基金項目：山東省名老中醫(yī)藥專家傳承工作室建設項目（魯衛(wèi)函〔2019〕67號）

作者簡介：李浩然（1996.02—），男，碩士研究生在讀，研究方向：中醫(yī)藥治療神經系統(tǒng)疾病，E-mail：812050413@qq.com

通信作者：周嘉培（1995.11—），女，碩士研究生在讀，研究方向：中醫(yī)脾胃病的臨床與研究，E-mail：zjpdyx95@163.com