酶法輔助膠體磨同時提取糯米淀粉和蛋白質(zhì)的工藝研究

何述棟 ，王雍飛 ，潘姝曉 ，李興江 ，王家良 ，繆新亞 ，王振山 ，孫漢巨

（1.合肥工業(yè)大學 食品與生物工程學院，合肥 230061；2.蚌埠學院 食品與生物工程學院，安徽蚌埠 233030；3.安徽湘園食品科技有限公司，安徽蚌埠 233400；4.匯福糧油泰州有限公司，江蘇泰州 225327）

0 引言

安徽省懷遠縣地處淮河流域腹地，氣候適宜糯稻種植，是我國最大的糯米生產(chǎn)基地和交易集散地［1］。糯米是糯稻脫殼后的產(chǎn)品，北方俗稱江米［2］，按照形狀、黏度和種植區(qū)域分為梗糯和秈糯。糯米營養(yǎng)價值豐富，含有豐富的淀粉和蛋白質(zhì)，大量的鈣、磷、鐵等金屬元素以及維生素B1、維生素B2和煙酸等微量元素［3］。糯米具有補中益氣、健脾養(yǎng)胃和潤肌養(yǎng)顏的功效。因此，糯米深受我國消費者喜愛，是我國諸多傳統(tǒng)食物，如年糕、八寶粥、粽子、湯圓等的重要原材料，也是釀制黃酒的主要來源［4］。隨著現(xiàn)代營養(yǎng)健康食品的發(fā)展，以糯米淀粉和蛋白質(zhì)為原料開發(fā)保健功能性食品成為新的市場關注點，前景巨大。然而，由于農(nóng)村當?shù)厝狈ε疵拙罴庸つ芰?，無法滿足農(nóng)業(yè)增收、農(nóng)民增收的新需求。我國相關糧食作物研究多以大米為主，關于糯米的研究和開發(fā)報道較少。傳統(tǒng)糯米深加工以水磨法制備糯稻淀粉為主，存在著得率低、能耗高的實際問題［5］，廢水中含有大量的水溶性蛋白，造成了浪費和環(huán)境污染，蛋白質(zhì)和淀粉分子均被植物細胞所束縛。因此，本文嘗試采用酶法輔助破壞糯米結(jié)構，有效增加蛋白質(zhì)和淀粉分子的溶出率，結(jié)合膠體磨和離心處理，通過物理特性差異同時制備糯米淀粉和蛋白質(zhì)。試驗結(jié)果可為糯稻綜合加工的全面開展奠定基礎，降低廢水污染，提升產(chǎn)品附加值，具有較好的實際生產(chǎn)指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糯米原料：安徽湘園食品科技有限公司提供，產(chǎn)自安徽省懷遠縣，收獲年份為2019年。纖維素酶（來源于黑曲霉，10 000 u/g，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；果膠酶（來源于黑曲霉，10 000 u/g，北京百靈威科技有限公司）。所用化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV-1800型紫外可見光分光光度計（上海元析儀器有限公司）；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華（常州）儀器制造有限公司）；FW100型小型高速萬能粉碎機（上海楚定分析儀器有限公司）；JMFB-80型膠體磨（上海科勞機械設備有限公司）；TGL18M型臺式高速冷凍離心機（鹽城市凱特實驗儀器有限公司）；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；K1160型凱氏定氮裝置（濟南海能儀器股份有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 酶法輔助膠體磨同時提取糯米蛋白質(zhì)和淀粉的工藝

取一定量的糯米樣品用蒸餾水洗滌2次，粗粉碎后，加入與糯米質(zhì)量比1：10的蒸餾水，調(diào)節(jié)pH值，加入酶制劑，在一定溫度下酶解一段時間后，采用膠體磨碾磨成糯米漿，在4 ℃經(jīng)6 500 rad/min離心作用后，獲得富含蛋白質(zhì)的上清液和富含淀粉的濾餅。上清液經(jīng)乙醇逆流交換后，蛋白質(zhì)析出，42 ℃干燥，得糯米蛋白粉；糯米粉餅經(jīng)50 ℃干燥后，得糯米淀粉（水分含量小于12.5%）。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量的測定

原料以及烘干蛋白粉的粗蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法（GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質(zhì)的測定》第一法）進行測定。

水提上清液中蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍法進行測定，以系列濃度（mg/mL）牛血清白蛋白經(jīng)考馬斯亮藍G-250染色后在595 nm處的相應吸光度值做標準曲線［6］。

式中 m1——水提上清液中蛋白質(zhì)含量；

m2——原料中蛋白質(zhì)含量。

1.3.3 糯米淀粉含量的測定

依據(jù)GB 5009.9—2016《食品安全國家標準食品中淀粉的測定》，采用酸水解法（第二法）對原料中糯米粗淀粉含量進行測定。

式中 m3—— 膠體磨離心沉淀的糯米粉餅淀粉質(zhì)量；

m4——原料中淀粉質(zhì)量。

1.3.4 糯米水分含量的測定

糯米粗水分含量的測定采用GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》中的直接干燥法（第一法）。

1.4 酶法輔助單因素優(yōu)化試驗設計

1.4.1 酶種類的選擇

按工藝處理物料，分別加入物料重0.8%的纖維素酶、果膠酶、纖維素酶和果膠酶的復配（活性比1：1），進行后續(xù)處理，確定酶種類。

1.4.2 酶添加量的確定

按工藝處理物料，分別加入物料重0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%確定酶的量，進行后續(xù)處理，確定最佳酶添加量。

1.4.3 酶解時間的確定

按工藝處理物料，添加已確定的酶和量，分別酶解 30，45，60，75，90 min，進行后續(xù)處理，確定最優(yōu)酶解時間。

1.4.4 酶解pH值的確定

按工藝處理物料，調(diào)節(jié)pH值至3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，添加已確定的酶和量，按最優(yōu)酶解時間進行后續(xù)處理，確定最佳pH值。

1.4.5 酶解溫度的確定

按工藝處理物料，調(diào)節(jié)到最佳pH值，添加已確定的酶和量，分別在40，50，60 ℃按最優(yōu)時間進行酶解，再進行后續(xù)處理，確定酶解溫度。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗最少進行3次重復，結(jié)果以平均值±SD值表示；采用SPSS軟件進行方差分析，P<0.05為差異顯著；采用Origin軟件進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 糯米原料的基本成分

經(jīng)測定，試驗用糯米原料的基本成分組成：粗水分含量為（11.5±1.2）%，粗蛋白質(zhì)含量為（6.72±0.30）%，粗淀粉含量為（73.5±2.5）%。

糯米的主要組分是淀粉。糯稻是稻的黏性變種，其支鏈淀粉含量可達95%以上，因此加熱可形成獨特的黏性口感。依據(jù)糯稻的種植地域，不同品系的糯米其基本成分組成略有不同［7］。

2.2 酶種類的選擇

傳統(tǒng)的糯米蛋白質(zhì)或淀粉的提取研究多以酶法為主［8］，常采用蛋白酶或淀粉酶，以水解某一主要成分為主要技術手段，而富集另外一個主要組分，不能同時制備2個完整的大分子。基于細胞破壁考慮，試驗擬采用纖維素酶、果膠酶以及纖維素酶和果膠酶的復配（活力比1：1）分別處理糯米細胞壁，使水溶性蛋白和包裹其中的淀粉盡量釋放出來，試驗結(jié)果如圖1所示。

圖1 酶種類對同時提取糯米淀粉和蛋白質(zhì)的影響Fig.1 Effect of enzyme types on simultaneous extraction of glutinous rice starch and protein

單酶酶解效果好于復合酶的處理，且果膠酶協(xié)同膠體磨制備了較高提取率的糯米蛋白質(zhì)和淀粉（P<0.05），這與鄭典元等［9］對褐藻的酶處理結(jié)果相似。植物細胞壁的主要成分為纖維素、半纖維素和果膠，而糯米細胞間質(zhì)的主要成分是果膠。因此，果膠酶在破開植物細胞壁的胞間層，解離細胞組織方面，會優(yōu)于纖維素酶，緊接著在膠體磨作用力下，可以釋放出較多的水溶性蛋白和淀粉分子［10］。纖維素酶可以水解細胞中 β -1，4 糖苷鍵鏈接的非淀粉多糖，導致膠體磨沉淀物的相對降低以及上清液組分的一定增多。在表觀試驗結(jié)果上，雙酶復合處理呈現(xiàn)出蛋白質(zhì)提取率與纖維素酶單酶處理差異不顯著（P >0.05），但淀粉得率顯著降低（P<0.05）的現(xiàn)象。根據(jù)江婭梅［11］采用纖維素酶和果膠酶對南瓜漿處理的研究報道可知，果膠酶在50 ℃時的酶解活力要好于纖維素酶，這也可能是本試驗現(xiàn)象的一個原因。因此，在后續(xù)試驗優(yōu)選果膠酶進行處理。

2.3 酶添加量的確定

采用果膠酶處理浸泡糯米，酶添加量對膠體磨同時提取糯米淀粉和蛋白質(zhì)的影響如圖2所示。當果膠酶添加量比重為0.6%時，果膠酶對膠體磨同時提取糯米淀粉和蛋白質(zhì)的影響顯著提升。當添加量為0.8%時，同時獲得最高的蛋白質(zhì)提取率40.50%和最高的淀粉得率90.90%。隨著酶添加量的繼續(xù)提高，得率并未有顯著提升，反而略有下降。隨著酶添加量的增加，果膠酶水解膠質(zhì)的反應速率加快，利于糯米顆粒破壁，使蛋白質(zhì)和淀粉從細胞內(nèi)和細胞間溶出，但是過量的果膠酶無法獲得更多的酶作用位點，提取率不會繼續(xù)顯著提升。因此，試驗優(yōu)選果膠酶添加比重為0.8%繼續(xù)進行單因素優(yōu)化研究。

圖2 酶添加量對同時提取糯米淀粉和蛋白質(zhì)的影響Fig.2 Effect of enzyme addition on simultaneous extraction of glutinous rice starch and protein

2.4 酶解時間的確定

酶解時間對膠體磨同時提取糯米淀粉和蛋白質(zhì)的影響如圖3所示。隨著酶解時間的延長，糯米蛋白質(zhì)提取率和淀粉得率均呈現(xiàn)緩慢增加的變化趨勢。當酶解時間達到60 min時，糯米蛋白質(zhì)和淀粉得率后續(xù)變化差異不顯著（P>0.05），差異幅度較小，表明果膠酶在60 min時已基本與糯米顆粒結(jié)合完全，酶解較充分，繼續(xù)增加酶解時間無法繼續(xù)提高酶反應效率。因此，從經(jīng)濟成本考慮，試驗確定60 min為最佳酶解時間。

圖3 酶解時間對同時提取糯米淀粉和蛋白質(zhì)的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis time on simultaneous extraction of glutinous rice starch and protein

2.5 酶解pH值的確定

依據(jù)Osborne分級法，糯米等稻谷蛋白一般由清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白組成［12］。其中，清蛋白溶于水，球蛋白易溶于鹽溶液，2者約占蛋白總含量的4%～15%；谷蛋白約占蛋白總量的80%，多溶于稀酸、稀堿溶液；其余蛋白為醇溶蛋白，約占蛋白總量的1%～5%。前期研究表明，pH值對稻米蛋白的溶解性影響顯著，在pH值4.0～7.0的環(huán)境中，稻米谷蛋白的溶解性緩慢增長，當pH值為9.0時，谷蛋白的溶解性顯著提高。因此，為提高稻米蛋白質(zhì)提取率，前期研究多采用NaOH等堿法提取，該條件下不但容易產(chǎn)生處理成本較高的大量廢水，而且會誘發(fā)蛋白質(zhì)變性，甚至生成一些有毒性化合物，嚴重限制了堿法蛋白提取在食品工業(yè)中的應用。為溫和獲得糯米大分子蛋白質(zhì)，試驗探究以果膠酶破壁為基礎的pH值范圍，對膠體磨同時提取糯米淀粉和蛋白質(zhì)的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 酶解pH值對同時提取糯米淀粉和蛋白質(zhì)的影響Fig.4 Effect of enzymatic pH value on simultaneous extraction of glutinous rice starch and protein by colloid mill

隨著pH值的升高，蛋白質(zhì)提取率和淀粉得率均呈現(xiàn)先升高后緩慢降低的變化趨勢。當pH值為4.5時，蛋白質(zhì)和淀粉的同時得率最高。已有研究表明，果膠酶的最適酶作用pH值在4.0～5.0范圍內(nèi)［13］，此時浸泡破壁效率較高，在膠體磨處理過程中可以釋放出較多的蛋白質(zhì)和淀粉。當pH>5.0時，雖然谷蛋白的溶解性緩慢提高，但是果膠酶的酶活性降低，細胞間膠質(zhì)的完好性限制了蛋白質(zhì)的提取率，同時也導致淀粉得率降低。因此選取4.5作為最佳的酶作用pH值。

2.6 酶解溫度的確定

考慮工業(yè)化生產(chǎn)操作適宜性，試驗基于以上最優(yōu)條件，選擇40，50，60 ℃研究酶解溫度對膠體磨同時提取糯米淀粉和蛋白質(zhì)的影響，試驗結(jié)果如圖5所示。

圖5 酶解溫度對同時提取糯米淀粉和蛋白質(zhì)的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on simultaneous extraction of glutinous rice starch and protein

隨著溫度從40 ℃升溫至50 ℃，蛋白質(zhì)提取率和淀粉得率均呈現(xiàn)顯著升高的變化趨勢。當溫度升至60 ℃時，蛋白質(zhì)提取率和淀粉得率均最低。已有研究表明，果膠酶的最適作用溫度為50 ℃，溫度過高或過低均會抑制酶活性［14］，造成蛋白質(zhì)和淀粉溶出效果的降低。糯米開始糊化的溫度在60～75 ℃，溫度過高時，支鏈淀粉溶脹，黏度增加，進一步阻礙蛋白質(zhì)和淀粉的溶出。過高的溫度不利于提取，因此最佳的酶解溫度為50 ℃。

3 結(jié)語

本文提出酶法輔助膠體磨偶聯(lián)離心處理同時制備糯米淀粉和蛋白質(zhì)的新工藝，基于果膠酶破壁和水提工藝，最大限度保留產(chǎn)品的營養(yǎng)性質(zhì)。進行單因素優(yōu)化試驗可知，選用果膠酶對糯米（料液比1：10）進行浸泡處理，酶添加量為0.8%，酶解時間60 min，酶解pH值為4.5，酶解溫度為50 ℃時，蛋白質(zhì)提取率可達43.8%，淀粉得率可達93.2%，達到預期目標，可為后續(xù)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支撐和依據(jù)。