超聲波輔助酶法提取柚子皮果膠的工藝研究

李明依，遲雪文，季青霞，畢艷紅，王小花，王朝宇，趙祥杰

（淮陰工學(xué)院 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江蘇淮安 223003）

0 引言

柚是桔屬的3個(gè)基本種之一，以其營(yíng)養(yǎng)豐富、耐儲(chǔ)藏和易運(yùn)輸?shù)忍攸c(diǎn)，素有“天然罐頭”之稱。我國(guó)柚類種質(zhì)資源的開發(fā)利用具有巨大的潛力，但目前柚子僅鮮食，少數(shù)被加工成產(chǎn)品，其消費(fèi)量有限。且柚子皮占柚子重量的30%～50%，被當(dāng)做廢棄物直接丟棄，資源浪費(fèi)嚴(yán)重且污染環(huán)境［1］。因此，研究柚子的深加工方法，既可以減少資源的浪費(fèi)，又可以提高產(chǎn)品的附加值。

果膠是植物特有的細(xì)胞壁組織［2］，是一種天然的聚半乳糖醛酸高分子多糖物質(zhì)［3-4］，也是膳食纖維的主要組成之一。因其良好的膠凝性和乳化穩(wěn)定的作用，可作為膠凝劑、增稠劑、乳化劑和穩(wěn)定劑等，在食品、醫(yī)藥和食品工業(yè)上有著廣泛的應(yīng)用［5-7］。另外，果膠還具有抗腹瀉、抗癌和降血糖等多種作用，更是醫(yī)藥和化妝品工業(yè)不可缺少的輔料［8］。果膠提取的原料來源廣泛，以西瓜、蘋果皮、橘皮和葡萄皮等為主［9-10］，主要涉及酸提取法、酶解法、微波提取法和超聲波提取法等［11-16］。

本文以柚子皮為原料，采用超聲波輔助酶法對(duì)其中的果膠進(jìn)行提取。在此基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化［17］，為柚子皮的綜合利用以及天然果膠的開發(fā)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新鮮柚子皮，從當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)收集。

1.2 試驗(yàn)試劑

纖維素酶（山東棗莊杰諾生物酶制劑公司）；磷酸氫二鈉、檸檬酸、無水乙醇、酚酞指示劑（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司）；氫氧化鈉（國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司）。所有試劑均為分析純或生化試劑。

1.3 主要設(shè)備

DJ-10A型中藥粉碎機(jī)（天津市中藥機(jī)械廠）；GL-20B型高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；GZX-GF-40X型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；HF-2.0B型超聲波循環(huán)提取器（弘祥隆生物技術(shù)開發(fā)有限公司）；RE-520型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海玻璃儀器二廠）；PHSJ-4A型pH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 試驗(yàn)工藝流程

新鮮柚子皮→滅酶→漂洗→干燥→粉碎→過篩（60目）→超聲波輔助酶法提取果膠→離心作用→提取液濃縮→乙醇沉淀→過濾→干燥→粉碎→果膠

1.4.2 原料處理

清洗柚子皮，除去黃色外果皮，以白色中果皮為原料切成小塊狀，于沸水中預(yù)煮3～5 min，冷水冷卻沖洗，瀝干水分，在60 ℃下烘至恒重，粉碎成粉末狀備用。

1.4.3 超聲波輔助酶法提取果膠

稱取5.0 g柚子皮粉于錐形瓶中，加入125 mL蒸餾水?dāng)嚢瑁尤胍欢康拿?，調(diào)節(jié)pH值和水浴溫度，在90 W的超聲波功率條件下酶解。將酶解液過濾，多次收集合并濾液得最終提取液。

1.4.4 乙醇沉淀法制備果膠

量取一定體積的柚子皮果膠濃縮提取液，加入提取液1.3倍體積的95%無水乙醇到柚子皮果膠提取液中攪拌，靜置1 h后抽濾。將果膠沉淀置60 ℃烘箱中干燥，稱重，計(jì)算柚子皮中果膠提取率。

1.4.5 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）不同提取方法的比較。分別稱取5.0 g干柚子皮粉于9個(gè)錐形瓶中，其中1，2，3號(hào)錐形瓶只采用超聲波輔助法進(jìn)行提取；4，5，6號(hào)錐形瓶只采用酶解法進(jìn)行提取；7，8，9號(hào)錐形瓶采用超聲波輔助酶解法進(jìn)行提取。

（2）料液比對(duì)果膠提取率的影響。分別稱取5.0 g干柚子皮粉，按料液比 1：15，1：20，1：25，1：30，1：35（g/mL）加入緩沖液調(diào)節(jié)pH值到4.5，在溫度、加酶量和超聲功率分別為40 ℃、2%（U/mL）和90 W的條件下提取50 min，比較不同料液比對(duì)果膠提取率的影響。

（3）時(shí)間對(duì)果膠提取率的影響。分別稱取5.0 g干柚子皮粉，按料液比1：20（g/mL）加入緩沖液調(diào)節(jié)pH值到4.5，在溫度、加酶量和超聲功率分別為40 ℃、2%和90 W的條件下分別提取20，30，40，50，60 min，比較不同提取時(shí)間對(duì)果膠提取率的影響。

（4）加酶量對(duì)果膠提取率的影響。分別稱取5.0 g干柚子皮粉，按料液比1：20加入緩沖液調(diào)節(jié)pH值到4.5，在溫度為40 ℃，加酶量分別為0.5%，1.0%，1.5%，2%，2.5%（U/mL）和超聲功率為90 W的條件下提取50 min，比較不同加酶量對(duì)果膠提取率的影響。

（5）pH值對(duì)果膠提取率的影響。分別稱取5.0 g干柚子皮粉，按料液比1：20加入緩沖液分別調(diào)節(jié)pH 值為 3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，在溫度、加酶量和超聲功率分別為40 ℃、2%和90 W的條件下提取50 min，比較不同pH值對(duì)果膠提取率的影響。

（6）溫度對(duì)果膠提取率的影響。分別稱取5.0 g干柚子皮粉，按料液比1：20加入緩沖液調(diào)節(jié)pH值為 4.5，分別在溫度為 30，35，40，45，50 ℃，加酶量為2%及超聲功率90 W的條件下提取50 min，比較不同提取溫度對(duì)果膠提取率的影響。

1.4.6 響應(yīng)面法優(yōu)化果膠提取工藝

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken方法設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)［18］。選取料液比、pH值、加酶量和提取時(shí)間4個(gè)對(duì)果膠提取效果影響顯著的因素，以果膠提取率為響應(yīng)值，采用4因素3水平的響應(yīng)面分析方法，確定最佳提取工藝參數(shù)，試驗(yàn)方案如表1所示。每組試驗(yàn)進(jìn)行3次，果膠提取率取其平均值。數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行處理，結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。響應(yīng)面組合試驗(yàn)運(yùn)用Design-Expert.V 8.0.6軟件。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Tab.1 Table of factors and levels for response surface analysis

響應(yīng)面試驗(yàn)采用29組完全設(shè)計(jì)，用來估計(jì)試驗(yàn)誤差。優(yōu)化結(jié)果將得出1個(gè)響應(yīng)值（Y）與變量（X1、X2、X3、X4）間的二元多項(xiàng)回歸模型：

式中 β0——常數(shù)；

Bi——一次項(xiàng)系數(shù)；

Bii——二次項(xiàng)系數(shù)；

Bij——交互作用系數(shù)；

k ——因素個(gè)數(shù)（k=4）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法比較

超聲波輔助法、酶解法及超聲波輔助酶解法的比較結(jié)果見表2。由結(jié)果可知，在其他提取條件相同的情況下，超聲波輔助酶解法提取柚子皮中果膠的提取率最高，并且操作簡(jiǎn)便，大大縮短了時(shí)間，環(huán)保高效。酶能高效溫和地分解大分子物質(zhì)［19-20］，且超聲波的機(jī)械振動(dòng)和空化作用能加速分子的振動(dòng)和擴(kuò)散，從而更有利于有效成分的溶出［21］。酶法提取過程中采用超聲波協(xié)同處理可以充分利用這2種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，從而提高柚子皮果膠的提取率。

表2 不同提取方法對(duì)果膠提取率的影響Tab.2 Effects of different extraction methods on the pectin extraction ratio

2.2 超聲波輔助酶法提取果膠的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 料液比對(duì)果膠提取率的影響

由圖1可知，料液比小不利于柚子皮果膠的溶出，提取率較低；隨著料液比的增大，果膠易轉(zhuǎn)移到提取液中，從而增加果膠提取率。當(dāng)料液比為1：30時(shí)，果膠提取率達(dá)到最大；料液比繼續(xù)增加，果膠提取率反而降低，可能是由于此時(shí)提取體積過大，纖維素酶作用的底物濃度顯著降低的原因；此外，料液比過大，乙醇沉淀過程中果膠損失也增大［22］，且乙醇的消耗量多也會(huì)造成生產(chǎn)成本過高。因此，料液比選擇1：30為宜。

圖1 料液比對(duì)果膠提取率的影響Fig.1 Effects of material-to-liquid ratio on the pectin extraction ratio

2.2.2 時(shí)間對(duì)果膠提取率的影響

酶解反應(yīng)需要酶與底物的充分相互作用，時(shí)間太短酶促反應(yīng)不完全，時(shí)間太長(zhǎng)不利于生產(chǎn)。由圖2可以看出，果膠提取率先隨時(shí)間的增加而迅速上升，當(dāng)酶解時(shí)間為50 min時(shí)，果膠提取率達(dá)到最大峰值，為23.80%，之后提取率有所下降。這可能是由于超聲波的機(jī)械振動(dòng)和空化作用等影響，使分子振動(dòng)加快，極大地促進(jìn)酶解反應(yīng)速度，提高了酶促反應(yīng)效率；而當(dāng)處理時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，超聲波的空化作用將某些大分子物質(zhì)破壞成小分子物質(zhì)，造成提取率有所下降。因此，超聲波輔助酶解法的最佳處理時(shí)間選擇50 min。

圖2 提取時(shí)間對(duì)果膠提取率的影響Fig.2 Effects of extraction time on the pectin extraction ratio

2.2.3 加酶量對(duì)果膠提取率的影響

從圖3可以看出，當(dāng)纖維素酶的添加量小于2%時(shí)，隨著酶添加量的增大，柚子皮果膠的提取率也不斷增大，這可能是由于柚子皮被纖維素酶不斷破壞，使得更多果膠溶出。當(dāng)加酶量超過2%時(shí)，繼續(xù)添加纖維素酶，果膠提取率并未增加，這可能是由于底物已經(jīng)同酶完全結(jié)合，繼續(xù)加大酶量反而浪費(fèi)。綜合考慮，最終選取2%的纖維素酶添加量。

圖3 加酶量對(duì)果膠提取率的影響Fig.3 Effects of amount of enzyme on the pectin extraction ratio

2.2.4 pH值對(duì)果膠提取率的影響

圖4顯示，pH值在4.5時(shí)果膠的提取率最高，達(dá)24.69%，表明在此處酶的活性最大。pH值增大或者減小，都會(huì)使纖維素酶遠(yuǎn)離最適pH值，造成酶活性的降低，從而導(dǎo)致果膠提取率的降低。因此酶的最適pH值為4.5。

圖4 pH值對(duì)果膠提取率的影響Fig.4 Effects of pH value on the pectin extraction ratio

2.2.5 溫度對(duì)果膠提取率的影響

由圖5可以看出，溫度對(duì)果膠提取率的影響較大，主要原因有2個(gè)：一是溫度的升高能夠增強(qiáng)果膠溶出的傳質(zhì)動(dòng)力；二是酶有最適的作用溫度。在溫度低于40 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，果膠提取率逐漸增大；而當(dāng)溫度高于40 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，果膠提取率又呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。因此提取溫度選擇40 ℃。

圖5 溫度對(duì)果膠提取率的影響Fig.5 Effects of temperature on the pectin extraction ratio

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化果膠提取工藝研究

2.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

采用Box-Behnken設(shè)計(jì)方案，對(duì)方差分析所篩選出的 4 個(gè)因素進(jìn)行編碼，X1、X2、X3、X4分別為料液比、提取pH值、加酶量和提取時(shí)間，以果膠提取率為響應(yīng)值進(jìn)行檢驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)采用29組完全設(shè)計(jì)，其中包括24個(gè)析因試驗(yàn)和5個(gè)中心點(diǎn)試驗(yàn)，用來估計(jì)試驗(yàn)誤差。

2.3.2 回歸方程的建立及統(tǒng)計(jì)分析

用方差分析的F檢驗(yàn)對(duì)回歸模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果列于表3。

表3 回歸方程系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)Tab.3 Regression equation coefficients and significant test

以果膠的提取率為響應(yīng)值，經(jīng)回歸擬合后，各因子對(duì)響應(yīng)值的影響可用以下回歸方程表示：

模型的F值為27.81，顯著性分析得P﹤0.001，說明所得的回歸模型對(duì)果膠的提取率有很好的預(yù)測(cè)性。失擬項(xiàng)F值為0.15，P>0.05，差異不顯著，說明該回歸方程對(duì)試驗(yàn)擬合情況良好，未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果干擾性小，說明殘差均由隨機(jī)誤差引起［23］。同時(shí)，表3中的各項(xiàng)方差分析表明，X1、X2、X3、X4、X12、X22、X32、X42項(xiàng)（P<0.05）對(duì)果膠提取率的影響顯著。模型顯示，相關(guān)系數(shù)R2（0.965 3）與調(diào)整的相關(guān)系數(shù)Adj-R2（0.930 6）都接近1，說明測(cè)定值與預(yù)測(cè)值之間有極高的擬合度［24］。

綜上所述，該回歸方程為優(yōu)化超聲輔助酶法提取果膠的工藝提供了良好的模型。

2.3.3 響應(yīng)面分析及提取工藝優(yōu)化

圖6直觀反映了料液比、pH值、加酶量和提取時(shí)間之間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。發(fā)現(xiàn)響應(yīng)面開口方向向下，隨著因素的增大，其響應(yīng)值增大；當(dāng)響應(yīng)值達(dá)到極值以后，隨著因素的增大，響應(yīng)值則逐漸減小。說明該模型有穩(wěn)定點(diǎn)，且穩(wěn)定點(diǎn)是交互作用的最大值。從圖中還看出，各因素之間的交互作用均呈現(xiàn)先上升后下降的拋物線形關(guān)系，說明兩兩交互均對(duì)柚子皮果膠提取率有較大的影響；且等高線是橢圓形的，也表明2者之間的交互作用明顯［25-27］。

圖6 不同因素對(duì)果膠提取率的影響Fig.6 Effects of different factors on pectin extraction ratio

2.4 模型驗(yàn)證

通過響應(yīng)面軟件對(duì)試驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得到柚子皮果膠提取率的最佳工藝條件：料液比1：26.30，pH 值 4.65，加酶量 1.87% 和提取時(shí)間47.49 min。在提取溫度40 ℃下，柚子皮果膠提取率達(dá)到24.81%。為考察模型的可靠性和準(zhǔn)確性，隨機(jī)抽取3組試驗(yàn)組合與最優(yōu)試驗(yàn)組合，進(jìn)行實(shí)測(cè)值和預(yù)測(cè)值之間的吻合度對(duì)比，結(jié)果見表4。果膠提取率的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值非常吻合，說明試驗(yàn)得到的模型有效并可靠。在最優(yōu)條件下，果膠提取率的實(shí)測(cè)值為24.81%，是隨機(jī)組1提取率的1.46倍。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.4 Design and test results of confirmatory experiment

3 結(jié)語

試驗(yàn)通過研究料液比、pH值、加酶量、提取時(shí)間和提取溫度對(duì)柚子皮果膠提取率的影響，從5個(gè)單因素中選取影響較為顯著的4個(gè)因素，進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，通過響應(yīng)面優(yōu)化得到的柚子皮果膠提取率的最佳工藝條件：料液比 1：26.30，pH 值 4.65，加酶量 1.87%，提取溫度40 ℃和提取時(shí)間47.49 min。在此條件下，柚子皮果膠提取率達(dá)到24.81%，與模型的預(yù)測(cè)值基本一致。