• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    昆蟲病原線蟲共生菌NK殺蟲蛋白處理后大蠟螟幼蟲中腸細(xì)菌群落的變化

    2022-05-23 01:31:46廖春麗李紹沖王泓云梁家琪李冰冰
    關(guān)鍵詞:蠟螟殺蟲昆蟲

    廖春麗,袁 源,李紹沖,王泓云,梁家琪,趙 靜,楊 云,李冰冰

    (1.河南城建學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院,河南 平頂山 467036;2.河南城建學(xué)院 河南省健康食品工程技術(shù)研究中心,河南 平頂山 467036;3.河南城建學(xué)院 河南省水體污染防治與修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 平頂山 467036)

    昆蟲體內(nèi)的腸道微生物構(gòu)成了昆蟲腸道的微生態(tài)體系,它們在昆蟲腸道內(nèi)定殖,完成生長、代謝、增殖等全部生命活動(dòng)。昆蟲腸道定居著大量的微生物,其與宿主在長期協(xié)同進(jìn)化過程中形成了緊密的互利共生關(guān)系[1-2],影響著昆蟲的生長和發(fā)育,參與昆蟲的消化、營養(yǎng)吸收和繁殖,而且腸道細(xì)菌對信息素的產(chǎn)生、維生素的合成、殺蟲劑的降解以及病菌的防御也有重要作用。鑒于昆蟲腸道微生物的重要功能,相關(guān)研究已越來越受國內(nèi)外學(xué)者重視。

    大蠟螟(Galleria mellonella)是昆蟲病原線蟲重要寄主之一,人們常利用大蠟螟幼蟲對昆蟲病原線蟲進(jìn)行分離、誘集和對昆蟲致病力進(jìn)行測定[3]??刹捎么笙灻T捕法分離韭菜土壤樣品中的線蟲,從異小桿屬昆蟲病原線蟲腸道內(nèi)分離到具有較高殺蟲活性的腸桿菌株NK,通過其形態(tài)、生理和生化特征,并結(jié)合16S rDNA序列分析等手段將其鑒定為新屬-腸桿菌屬(Enterobacter)[4]。

    近年來,已有一些關(guān)于Bt殺蟲蛋白對昆蟲腸道細(xì)菌影響的研究報(bào)道。Broderick等[5-6]從舞毒蛾Lymantria dispar中腸中發(fā)現(xiàn)Bt殺蟲活性的發(fā)揮必須依賴于腸桿菌Enterobactersp.NAB3,并且還發(fā)現(xiàn)Bt活性與中腸微生物的關(guān)系因昆蟲種類而異。張浩等[7]發(fā)現(xiàn)腸道菌在Bt殺蟲過程中對棉鈴蟲起到保護(hù)作用。李振等[8]發(fā)現(xiàn)經(jīng)Bt殺蟲蛋白處理后二化螟幼蟲中腸細(xì)菌群落的豐富度出現(xiàn)變化,推測可能與二化螟取食Bt殺蟲蛋白有關(guān)。鑒于目前新屬-NK菌株(日溝維腸桿菌)殺蟲蛋白對大蠟螟腸道細(xì)菌群落的影響狀況仍未清楚,因此研究取食NK菌株殺蟲蛋白后大蠟螟幼蟲腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)的變化,對于明確大蠟螟腸道細(xì)菌與NK菌株殺蟲蛋白之間的關(guān)系具有重要的意義。

    隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,基于核酸序列分析的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)已廣泛應(yīng)用到昆蟲的腸道微生物學(xué)研究中。細(xì)菌核糖體16S rDNA 基因可變區(qū)是此類生物物種的特征核酸序列,可用來進(jìn)行細(xì)菌的分類鑒定。本文采用高通量測序技術(shù)手段對未飼喂蛋白和飼喂不同時(shí)間蛋白的大蠟螟幼蟲中腸細(xì)菌的16S rDNA 基因 V3-V4 區(qū)的PCR產(chǎn)物采集4個(gè)樣本,檢測其群落多樣性及群落結(jié)構(gòu)的變化,探討腸道細(xì)菌與昆蟲病原線蟲共生菌NK殺蟲蛋白之間的關(guān)系,進(jìn)而為闡明昆蟲病原線蟲共生菌NK殺蟲機(jī)制提供一定的借鑒和參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 共生菌NK殺蟲蛋白

    從昆蟲病原線蟲共生菌NK胞內(nèi)提取純化殺蟲蛋白(-80 ℃冷凍保存)。

    1.1.2 供試?yán)ハx

    大蠟螟3齡幼蟲(Galleria mellonella larvae),于網(wǎng)上選購。將3齡的大蠟螟幼蟲,每個(gè)平板分裝15條,用含有0.2 mg/g濃度殺蟲蛋白的飼料進(jìn)行投喂,飼喂3個(gè)不同時(shí)間段(36 h、48 h和60 h)作為3個(gè)實(shí)驗(yàn)組,編號(hào)分別為BG1、BG2、BG3,每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)平行,同時(shí)用不含殺蟲蛋白的飼料喂養(yǎng)大蠟螟幼蟲作為空白對照組,編號(hào)為BG0。培養(yǎng)溫度25~30 ℃,濕度75%,避光。

    1.2 方法

    1.2.1 腸道的解剖與保存

    選取實(shí)驗(yàn)組和對照組大蠟螟幼蟲120條。在無菌操作條件下解剖出中腸,將中腸放入2 mL離心管中,每管放入40條幼蟲的中腸,每個(gè)處理3管。離心管中提前放入0.7% 的生理鹽水500 μL,單管編號(hào),放入-80 ℃冰箱保存待用。

    1.2.2 DNA的提取和 PCR擴(kuò)增

    使用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit(OMEGA,美國)試劑盒,參照說明書提取大蠟螟幼蟲腸道總基因組,并用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提質(zhì)量,檢測合格后的樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

    PCR接頭引物如表1所示,引物為Miseq測序平臺(tái)中細(xì)菌16S rDNA,V3-V4區(qū)通用引物。

    表1 PCR擴(kuò)增時(shí)引物序列

    PCR反應(yīng)的擴(kuò)增程序包含兩輪。第一輪擴(kuò)增:首先在94 ℃、 94 ℃、45 ℃、65 ℃溫度下,依次進(jìn)行 3 min、 30 s、20 s、30 s,共5個(gè)循環(huán);然后在94 ℃、55℃、 72 ℃溫度下,依次進(jìn)行20 s、20 s、30 s,共20個(gè)循環(huán);最后在72 ℃條件持續(xù)延伸5 min。第二輪擴(kuò)增(引入Illumina橋式PCR兼容引物):首先在94 ℃、94 ℃、55 ℃、72 ℃ 溫度下,依次進(jìn)行3 min、20 s、20 s、30 s,共5個(gè)循環(huán),然后在72 ℃持續(xù)延伸5 min;最后將得到的PCR產(chǎn)物,進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,對其進(jìn)行質(zhì)量檢測。濃度和特異性合格后送上海生工生物有限公司進(jìn)行高通量測序。上樣順序依次為BG0、BG1、BG2和BG3。

    1.2.3 大蠟螟幼蟲中腸微生物基因組高通量測序及數(shù)據(jù)分析

    采用Illumina Miseq 測序平臺(tái)對1個(gè)對照組和3個(gè)實(shí)驗(yàn)組樣品的16S rDNA V3-V4區(qū)PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙端測序。利用RDP、Silva、NCBI 16S數(shù)據(jù)庫對大蠟螟中腸細(xì)菌16S rDNA序列進(jìn)行物種注釋,群落分類?;贠UT的統(tǒng)計(jì)結(jié)果,利用Mothur軟件計(jì)算Alpha多樣性指數(shù),包括反映樣品中群落豐富度的Chao1指數(shù)和觀測物種數(shù)(number of observed species)以及反映樣品中物種多樣性的Shannon 指數(shù)和 Simpson 指數(shù)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 大蠟螟腸道DNA的提取和PCR擴(kuò)增

    大蠟螟腸道DNA提取結(jié)果如圖1所示,圖1中4個(gè)不同處理組中1條帶存在輕微的降解與斷裂,不影響PCR擴(kuò)增的結(jié)果,其他2、3、4條帶明亮清晰,表明DNA含量豐富,符合PCR擴(kuò)增所需的濃度要求。大蠟螟腸道DNA16S rDNA V3-V4區(qū)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物見圖2,經(jīng)電泳檢測均在600 bp左右出現(xiàn)明顯的條帶,與預(yù)期產(chǎn)物大小相符,且特異性良好,故直接用于高通量測序。

    注:1、2、3、4分別代表BG0、BG1、BG2和BG3。

    注:1、2、3、4分別代表BG0、BG1、BG2和BG3。

    2.2 序列拼接組裝信息

    大蠟螟幼蟲腸道細(xì)菌16S rDNA高通量測序基本信息見表2。

    表2 大蠟螟幼蟲腸道細(xì)菌16S rDNA高通量測序基本信息

    由表2可知:大蠟螟幼蟲中腸腸道細(xì)菌 4個(gè)樣本(BG0、BG1、BG2和BG3)16S rRNA高通量測序共產(chǎn)生原始序列分別為71 722、67 559、65 549、63 200條;質(zhì)控拼接后得到優(yōu)質(zhì)序列分別為70 350、67 559、64 370、61 725條;基于97%的相似水平,大蠟螟幼蟲腸道細(xì)菌OTU聚類分析分別獲得1 872、1 445、1 262和1 591個(gè)OTUs?;贠TUs的分類結(jié)果,大蠟螟幼蟲腸道樣本中細(xì)菌分屬于14、15、9、11個(gè)門,27、27、20、22個(gè)綱,41、33、31、39個(gè)目,58、58、45、56個(gè)科,71、80、57、84個(gè)屬。

    2.3 大蠟螟腸道細(xì)菌的種類組成及其豐度

    大蠟螟幼蟲腸道樣本在高通量測序的16S rDNA序列4個(gè)處理組注釋:在門、綱、目和科分類階元水平上的微生物群落組成如表3所示。在門分類階元上,厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)細(xì)菌為絕對優(yōu)勢菌。在綱分類階元上,芽孢桿菌綱(Bacilli)和γ-變形桿菌綱(Gammaproteobacteria)細(xì)菌為絕對優(yōu)勢菌。在目分類階元上,乳桿菌目(Lactobacillales)和腸桿菌目(Enterobacteriales)細(xì)菌為絕對優(yōu)勢菌。在科分類階元上腸球菌科(Enterococcaceae)和腸桿菌科(Enterobacteriaceae)細(xì)菌為絕對優(yōu)勢菌。當(dāng)然還有一些未注釋成功的。

    表3 大蠟螟幼蟲腸道內(nèi)在門、綱、目和科分類階元上相對豐度(%)靠前的細(xì)菌

    運(yùn)用Blast軟件對本次樣本的物種分類進(jìn)行分析,在4個(gè)樣本屬的水平上共注釋到48個(gè)菌屬,如圖3所示。相對豐度靠前的細(xì)菌見表4。從圖3和表4可知:厚壁菌門中的腸球菌屬(Enterococcus)為優(yōu)勢菌,在4個(gè)處理組中所占比重分別為94.85%、48.02%、55.99%、48.94%;變形菌門中的腸桿菌屬(Enterobacter)為優(yōu)勢菌,在4個(gè)處理組中所占比重分別為1.00%、40.39%、19.54%、36.22%,其次變形桿菌屬、假單胞菌屬和鞘脂單胞菌屬等也占一定比重。

    昆蟲病原線蟲共生菌NK胞內(nèi)殺蟲蛋白的侵入不僅影響了屬的類別,而且改變了不同菌屬間的數(shù)量。與對照組相比,實(shí)驗(yàn)組腸球菌屬的數(shù)量明顯降低,而實(shí)驗(yàn)組腸桿菌屬、變形桿菌屬、假單胞菌屬的數(shù)量則明顯上升。由圖3和表4可知,昆蟲病原線蟲共生菌NK胞內(nèi)殺蟲蛋白對大蠟螟中腸微生物的腸球菌屬、腸桿菌屬、變形桿菌屬、假單胞菌屬的數(shù)量影響最大。

    基于OTU的樣本聚類樹圖見圖4。根據(jù)圖4樣本間的距離可以看出,樹枝的長度代表樣本間的距離,越相似的樣本會(huì)越靠近,反之越遠(yuǎn)。實(shí)驗(yàn)組與對照組的樣本群落相似度相差甚遠(yuǎn),而3個(gè)處理組的樣本群落相似性則較為接近,尤其是48 h和60 h處理組相似性最為接近,說明用昆蟲病原線蟲共生菌胞內(nèi)殺蟲蛋白飼喂大蠟螟會(huì)改變大蠟螟中腸微生物群落之間的相似性,并且飼喂時(shí)間越長,對照組和實(shí)驗(yàn)組大蠟螟中腸微生物群落之間的相似性相差越大。

    圖3 不同處理二化螟幼蟲中腸細(xì)菌物種注釋結(jié)果柱狀圖

    表4 大蠟螟幼蟲腸道內(nèi)在屬分類階元上相對豐度(%)靠前的細(xì)菌

    圖4 基于OTU的樣本聚類樹圖

    2.4 大蠟螟腸道細(xì)菌Alpha分析

    Alpha多樣性指數(shù)評估可以反映樣本內(nèi)菌群的多樣性。選取觀測物種數(shù)、Chao1、Shannon、Simpson和Coverage 5個(gè)常用指數(shù)來分析大蠟螟腸道菌群的多樣性,見表5。觀測物種數(shù)和 Chao1(物種總數(shù)指數(shù)) 指數(shù)值越大,表示樣品中群落豐富度越高;Shannon 指數(shù)越高,Simpson指數(shù)越小,說明樣品中的物種多樣性越高;Coverage表明樣品序列的覆蓋率,其值越大覆蓋越完全。由表5可知,大蠟螟腸道中細(xì)菌種類均具有較高的豐富度和一定的多樣性,并且樣品序列的覆蓋率也很高。

    表5 大蠟螟幼蟲腸道細(xì)菌多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)

    圖5 大蠟螟幼蟲腸道細(xì)菌OTUs的Rank-abundance曲線

    和對照組相比,實(shí)驗(yàn)組中隨著飼喂殺蟲蛋白時(shí)間越長,其Chao1指數(shù)越小,表明昆蟲病原線蟲殺蟲蛋白的侵入降低大蠟螟中腸微生物的物種總數(shù);其Shannon指數(shù)越大,Simpson指數(shù)越小,表明昆蟲病原線蟲殺蟲蛋白的侵入增加大蠟螟中腸微生物的群落多樣性。但在BG3(60 h)樣本,物種總數(shù)又稍微升高,推測在60 h大蠟螟已經(jīng)死亡,微生物大量繁殖的結(jié)果;Shannon指數(shù)稍微降低,Simpson指數(shù)稍微變大,推測在60 h大蠟螟已經(jīng)死亡,起分解作用的微生物增加,降低群落多樣性。

    Rank-abundance 曲線可以同時(shí)展現(xiàn)4個(gè)樣品中所含物種的豐富程度和均勻程度,見圖5。由圖5可知:大蠟螟腸道中的細(xì)菌組成豐富,因?yàn)槲锓N的豐富程度由曲線的橫軸長度來反映,4個(gè)樣本曲線寬,說明它們的物種組成豐富;但大蠟螟腸道中的細(xì)菌均勻度不高,因?yàn)槲锓N的均勻度由曲線形狀來反映,4個(gè)樣本曲線不平坦,說明它們的均勻度不高,即存在一些豐度占比較高的細(xì)菌種類。

    3 結(jié)論與討論

    以往關(guān)于腸道微生物的研究主要采用離體平板培養(yǎng)和克隆文庫法,且集中于細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性分析方面[9]。近年來,高通量測序技術(shù)為全面掌握腸道菌群結(jié)構(gòu)提供了強(qiáng)有力的分析手段。通過Illumina Miseq測序技術(shù)檢測細(xì)菌16S rDNA序列,可系統(tǒng)分析大蠟螟幼蟲腸道內(nèi)細(xì)菌的種類多樣性和群落結(jié)構(gòu)組成。

    根據(jù)Alpha多樣性指數(shù)評估樣本內(nèi)菌群的多樣性,與對照組相比經(jīng)昆蟲病原線蟲共生菌NK胞內(nèi)蛋白飼喂的實(shí)驗(yàn)組,大蠟螟中腸細(xì)菌的物種總數(shù)減少,但實(shí)驗(yàn)組大蠟螟中腸微生物的群落多樣性增加,與對照組的優(yōu)勢菌群腸球菌屬等相比,實(shí)驗(yàn)組的優(yōu)勢菌群則為腸球菌屬、腸桿菌屬和變形桿菌屬等。基于OTU的樣本聚類樹圖和Rank-abundance 曲線可知:對照組和實(shí)驗(yàn)組,大蠟螟中腸微生物群落之間的相似性相差較大;大蠟螟腸道中的細(xì)菌組成豐富,但均勻度不高,即存在一些豐度占比較高的細(xì)菌種類。

    與對照組相比,實(shí)驗(yàn)組腸球菌屬所占比重明顯下降,說明腸球菌屬在大蠟螟幼蟲受到NK殺蟲蛋白的影響后導(dǎo)致該菌比重降低。通過用抗生素和不用抗生素處理的無菌昆蟲驗(yàn)證了煙草天蛾 Manduca sexta 和小菜蛾的腸道內(nèi)的腸球菌能部分降低 Cry1Ac 的殺蟲活性[10]。舞毒蛾幼蟲腸道內(nèi)共生的腸球菌也能降低蘇云金芽孢桿菌的殺蟲活性[11]。由此推測NK殺蟲蛋白能抑制腸球菌生存,同時(shí)腸球菌也能抑制NK殺蟲蛋白活性,腸球菌屬作為大蠟螟中腸微生物的絕對優(yōu)勢菌群(比重占94.85%)對昆蟲生理可能起到有益的作用,只有通過降低腸球菌比重,NK殺蟲蛋白才能最終發(fā)揮殺蟲功能,從而影響大蠟螟幼蟲的生理活動(dòng)。

    與對照組相比,實(shí)驗(yàn)組腸桿菌屬比重明顯增加,說明大蠟螟幼蟲腸道內(nèi)可能通過腸桿菌屬比重的增加,來適應(yīng)NK 殺蟲蛋白的處理,也有可能這類菌更能耐受有NK殺蟲蛋白的腸道環(huán)境。同時(shí)腸桿菌屬中包含大量的沙門氏菌、志賀氏菌等條件致病菌,這些腸桿菌屬中的一些細(xì)菌對大蠟螟可能起著有害的作用,它們和NK殺蟲蛋白共同影響大蠟螟幼蟲的生理活動(dòng)。

    與對照組相比,實(shí)驗(yàn)組新增了不動(dòng)桿菌屬、克呂沃爾氏菌屬這兩種新的菌屬。不動(dòng)桿菌屬是導(dǎo)致腸道感染的重要病原菌之一[12],克呂沃爾氏菌屬是典型的條件致病菌屬,可見這兩種菌屬也會(huì)對大蠟螟幼蟲造成危害,它們也和NK殺蟲蛋白共同影響大蠟螟幼蟲的生理活動(dòng)。

    大蠟螟腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的變化可能與昆蟲病原線蟲共生菌NK胞內(nèi)殺蟲蛋白的介入有關(guān),從而為闡明它的殺蟲機(jī)制提供一定的借鑒和參考。但是大蠟螟中腸優(yōu)勢細(xì)菌群落變化是助推還是抑制殺蟲蛋白引起大蠟螟幼蟲的死亡?還需要進(jìn)一步的探索。

    猜你喜歡
    蠟螟殺蟲昆蟲
    RFID昆蟲閱讀放大鏡
    玩具世界(2022年3期)2022-09-20 01:48:20
    借昆蟲上課
    甘肅教育(2020年2期)2020-09-11 08:01:48
    大蠟螟的非凡聽力
    知識(shí)窗(2019年9期)2019-10-09 03:28:34
    以“肥”殺蟲 藥肥兩用 一舉多得
    巧用寄生蜂防控中蜂巢蟲
    蜜蜂雜志(2019年12期)2019-06-16 06:17:00
    我最喜歡的昆蟲——知了
    昆蟲的冬天
    常用殺蟲中藥殺蟲效果比較及其配伍的初步研究
    大蠟螟營養(yǎng)成分分析與評價(jià)
    冬青油對蠕形螨體外殺蟲的作用研究
    久久香蕉国产精品| 精品久久久久久久久久免费视频 | 国产精品一区二区在线不卡| 无限看片的www在线观看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产淫语在线视频| 亚洲av熟女| 精品久久久久久电影网| 亚洲成人手机| 午夜视频精品福利| 国产精品免费一区二区三区在线 | 精品国产国语对白av| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 久久这里只有精品19| 免费在线观看日本一区| 亚洲熟女毛片儿| 久久久精品免费免费高清| 国产男女超爽视频在线观看| 久久亚洲真实| 精品福利永久在线观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 99精品欧美一区二区三区四区| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 18禁观看日本| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 精品亚洲成a人片在线观看| 国产一区有黄有色的免费视频| 成年动漫av网址| 久久天堂一区二区三区四区| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产亚洲精品久久久久5区| 免费人成视频x8x8入口观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 午夜久久久在线观看| 国产99久久九九免费精品| 成人精品一区二区免费| 99国产极品粉嫩在线观看| 90打野战视频偷拍视频| 欧美黄色淫秽网站| 欧美日韩av久久| 精品国产一区二区三区四区第35| 99国产精品一区二区蜜桃av | 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲人成电影观看| 一级毛片女人18水好多| 乱人伦中国视频| 成人亚洲精品一区在线观看| 十分钟在线观看高清视频www| 一本综合久久免费| 丝瓜视频免费看黄片| 人妻 亚洲 视频| 啦啦啦免费观看视频1| 亚洲少妇的诱惑av| 国产真人三级小视频在线观看| 性色av乱码一区二区三区2| 国产单亲对白刺激| 欧美日韩av久久| av欧美777| 男女下面插进去视频免费观看| 女人精品久久久久毛片| 亚洲欧美一区二区三区久久| 精品一区二区三卡| 高清毛片免费观看视频网站 | 中文字幕av电影在线播放| 三上悠亚av全集在线观看| 日本黄色日本黄色录像| 很黄的视频免费| 午夜日韩欧美国产| 精品一区二区三卡| 青草久久国产| 美女福利国产在线| 国产一区有黄有色的免费视频| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 久久久久久人人人人人| 国产有黄有色有爽视频| 热99re8久久精品国产| 色综合欧美亚洲国产小说| 在线av久久热| 美女扒开内裤让男人捅视频| 亚洲精品国产色婷婷电影| 99精品在免费线老司机午夜| 热99国产精品久久久久久7| 麻豆成人av在线观看| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 搡老岳熟女国产| 亚洲第一青青草原| 亚洲性夜色夜夜综合| 1024视频免费在线观看| 一进一出抽搐动态| svipshipincom国产片| 成人精品一区二区免费| 老司机在亚洲福利影院| 宅男免费午夜| 女警被强在线播放| 手机成人av网站| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 欧美日韩亚洲高清精品| 久久中文字幕一级| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲精品国产区一区二| 大陆偷拍与自拍| 女人被狂操c到高潮| 757午夜福利合集在线观看| 国产主播在线观看一区二区| 高清毛片免费观看视频网站 | 超碰成人久久| 人妻 亚洲 视频| 大香蕉久久成人网| 久久精品国产综合久久久| 日韩成人在线观看一区二区三区| 久久亚洲真实| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 久久国产乱子伦精品免费另类| 18禁美女被吸乳视频| 欧美中文综合在线视频| 亚洲三区欧美一区| 99国产综合亚洲精品| 久久久久视频综合| 一区二区三区激情视频| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 韩国av一区二区三区四区| 在线观看一区二区三区激情| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 精品久久久久久久久久免费视频 | 亚洲片人在线观看| 欧美日韩成人在线一区二区| 在线观看免费高清a一片| 日本五十路高清| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲性夜色夜夜综合| 人妻久久中文字幕网| 少妇 在线观看| 高清视频免费观看一区二区| 女人精品久久久久毛片| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产免费现黄频在线看| √禁漫天堂资源中文www| 动漫黄色视频在线观看| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 精品午夜福利视频在线观看一区| 不卡一级毛片| 亚洲性夜色夜夜综合| 国产激情久久老熟女| 激情视频va一区二区三区| 99精品欧美一区二区三区四区| 亚洲五月天丁香| 久久精品国产亚洲av高清一级| 人人妻人人澡人人看| 正在播放国产对白刺激| 亚洲国产欧美网| ponron亚洲| 国产一区二区激情短视频| 欧美黄色淫秽网站| 身体一侧抽搐| 久久精品国产亚洲av高清一级| 中文字幕最新亚洲高清| 国产男靠女视频免费网站| 18禁美女被吸乳视频| 制服人妻中文乱码| 日韩欧美国产一区二区入口| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 极品教师在线免费播放| 中文字幕最新亚洲高清| videos熟女内射| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 亚洲国产欧美网| 成年动漫av网址| 免费观看a级毛片全部| 又黄又粗又硬又大视频| 国产91精品成人一区二区三区| 一级作爱视频免费观看| 国产精品一区二区精品视频观看| 天天添夜夜摸| 欧美中文综合在线视频| 欧美 日韩 精品 国产| 99精国产麻豆久久婷婷| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 12—13女人毛片做爰片一| 久久人妻熟女aⅴ| 最近最新中文字幕大全电影3 | 欧美精品一区二区免费开放| 亚洲一区中文字幕在线| 99re6热这里在线精品视频| 国产麻豆69| 亚洲专区国产一区二区| 国产欧美亚洲国产| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 多毛熟女@视频| 露出奶头的视频| 国产熟女午夜一区二区三区| 精品卡一卡二卡四卡免费| 老熟女久久久| 黄频高清免费视频| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 精品高清国产在线一区| 动漫黄色视频在线观看| 黄片小视频在线播放| 亚洲一区二区三区欧美精品| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 成人三级做爰电影| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产亚洲精品第一综合不卡| 亚洲av电影在线进入| 午夜精品在线福利| xxxhd国产人妻xxx| 中文字幕制服av| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲一区二区三区欧美精品| 夫妻午夜视频| 十八禁高潮呻吟视频| 又大又爽又粗| 757午夜福利合集在线观看| 99在线人妻在线中文字幕 | www.999成人在线观看| 久久久久国产一级毛片高清牌| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 亚洲第一av免费看| 老司机午夜十八禁免费视频| 午夜两性在线视频| av超薄肉色丝袜交足视频| 亚洲中文日韩欧美视频| 久久天堂一区二区三区四区| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 韩国精品一区二区三区| 欧美日韩视频精品一区| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 久久中文字幕人妻熟女| 美女福利国产在线| 久久久久精品人妻al黑| 夫妻午夜视频| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 午夜久久久在线观看| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 国产熟女午夜一区二区三区| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 久久人妻熟女aⅴ| 窝窝影院91人妻| 成年动漫av网址| 亚洲欧美激情综合另类| 国产一区二区三区视频了| 国产成人精品无人区| 美女福利国产在线| 在线天堂中文资源库| 黑人猛操日本美女一级片| 国产男靠女视频免费网站| tocl精华| 亚洲熟女毛片儿| 男女之事视频高清在线观看| 黑人操中国人逼视频| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 老司机福利观看| 久久精品国产a三级三级三级| 亚洲五月婷婷丁香| av免费在线观看网站| 久久国产精品大桥未久av| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 日韩欧美三级三区| √禁漫天堂资源中文www| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产麻豆69| 亚洲精品中文字幕在线视频| 免费看十八禁软件| 国产精品一区二区精品视频观看| www.999成人在线观看| 国产精品偷伦视频观看了| 国产野战对白在线观看| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 香蕉国产在线看| 91麻豆av在线| 一级黄色大片毛片| 日本精品一区二区三区蜜桃| 久久久国产成人免费| 久久青草综合色| 欧美 日韩 精品 国产| 免费高清在线观看日韩| 两人在一起打扑克的视频| 无限看片的www在线观看| 亚洲片人在线观看| 桃红色精品国产亚洲av| 成人国语在线视频| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 亚洲精品在线美女| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 欧美国产精品一级二级三级| 一区二区三区激情视频| 久久中文字幕人妻熟女| 亚洲国产中文字幕在线视频| 婷婷精品国产亚洲av在线 | 村上凉子中文字幕在线| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 久久香蕉激情| 一区二区三区激情视频| 久久精品亚洲av国产电影网| 亚洲专区国产一区二区| 亚洲一区二区三区欧美精品| 久久久久国产精品人妻aⅴ院 | 欧美成人午夜精品| 中国美女看黄片| 激情在线观看视频在线高清 | 激情视频va一区二区三区| 久久久久久久久久久久大奶| 下体分泌物呈黄色| av网站免费在线观看视频| 一本综合久久免费| 免费观看人在逋| 丝袜美足系列| 五月开心婷婷网| 黄色怎么调成土黄色| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 久久人妻av系列| av欧美777| 大码成人一级视频| 午夜福利视频在线观看免费| 国产单亲对白刺激| 亚洲美女黄片视频| 国产97色在线日韩免费| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 99久久综合精品五月天人人| 波多野结衣av一区二区av| 99热网站在线观看| 日韩中文字幕欧美一区二区| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 在线观看日韩欧美| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 免费人成视频x8x8入口观看| av免费在线观看网站| 啪啪无遮挡十八禁网站| 下体分泌物呈黄色| 麻豆av在线久日| 美女国产高潮福利片在线看| av网站免费在线观看视频| 久久久久国产精品人妻aⅴ院 | 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 90打野战视频偷拍视频| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 亚洲九九香蕉| 中文字幕精品免费在线观看视频| а√天堂www在线а√下载 | 国产av又大| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 在线观看午夜福利视频| 精品国产亚洲在线| 久久久国产成人免费| 国产99白浆流出| 久久九九热精品免费| 激情视频va一区二区三区| 高清毛片免费观看视频网站 | 婷婷精品国产亚洲av在线 | 国产蜜桃级精品一区二区三区 | av有码第一页| 9191精品国产免费久久| 精品国产乱码久久久久久男人| 搡老熟女国产l中国老女人| 大陆偷拍与自拍| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 日韩视频一区二区在线观看| 午夜91福利影院| 黄色视频,在线免费观看| 欧美乱码精品一区二区三区| 亚洲七黄色美女视频| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 国产精品av久久久久免费| 日日夜夜操网爽| 成年动漫av网址| 久久久久视频综合| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 女警被强在线播放| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 满18在线观看网站| 久热爱精品视频在线9| 老鸭窝网址在线观看| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 男女下面插进去视频免费观看| 欧美不卡视频在线免费观看 | 欧美久久黑人一区二区| 捣出白浆h1v1| 99久久99久久久精品蜜桃| 99国产综合亚洲精品| 中文字幕精品免费在线观看视频| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产亚洲精品久久久久久毛片 | 极品少妇高潮喷水抽搐| 99久久综合精品五月天人人| 国产免费av片在线观看野外av| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 亚洲成人国产一区在线观看| 国精品久久久久久国模美| 欧美黄色片欧美黄色片| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 中文字幕人妻丝袜一区二区| 亚洲色图综合在线观看| 黄色视频不卡| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 欧美激情高清一区二区三区| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 男人的好看免费观看在线视频 | 色94色欧美一区二区| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 国产欧美亚洲国产| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 老司机在亚洲福利影院| 欧美精品一区二区免费开放| 亚洲专区中文字幕在线| 亚洲成国产人片在线观看| 欧美在线黄色| 久久人妻av系列| 在线天堂中文资源库| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产成人精品久久二区二区91| 黄色成人免费大全| 免费观看a级毛片全部| 飞空精品影院首页| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 水蜜桃什么品种好| 亚洲av电影在线进入| 欧美乱色亚洲激情| 亚洲精品自拍成人| 国产高清视频在线播放一区| 欧美黄色淫秽网站| 少妇被粗大的猛进出69影院| 久久国产精品人妻蜜桃| 黄色视频不卡| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲国产欧美一区二区综合| 日韩中文字幕欧美一区二区| 三级毛片av免费| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 亚洲成人手机| 18禁观看日本| 性色av乱码一区二区三区2| 满18在线观看网站| 精品久久久久久久久久免费视频 | 动漫黄色视频在线观看| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 韩国av一区二区三区四区| 五月开心婷婷网| 久久久久久久久免费视频了| 国产高清激情床上av| 国产单亲对白刺激| 纯流量卡能插随身wifi吗| 这个男人来自地球电影免费观看| 色婷婷久久久亚洲欧美| 一个人免费在线观看的高清视频| 高潮久久久久久久久久久不卡| 日韩精品免费视频一区二区三区| 精品一区二区三区四区五区乱码| 亚洲专区中文字幕在线| tocl精华| 久久久久久免费高清国产稀缺| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产极品粉嫩免费观看在线| 日本欧美视频一区| 国产人伦9x9x在线观看| 久久久国产精品麻豆| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 天天操日日干夜夜撸| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| videos熟女内射| svipshipincom国产片| 捣出白浆h1v1| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 久久久久国内视频| 亚洲 国产 在线| 老司机福利观看| 人妻一区二区av| 9191精品国产免费久久| a级毛片在线看网站| 飞空精品影院首页| 大码成人一级视频| 国产精品二区激情视频| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 亚洲人成电影观看| 婷婷精品国产亚洲av在线 | 大香蕉久久网| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 一级,二级,三级黄色视频| 久久久久久人人人人人| 欧美成人免费av一区二区三区 | 免费av中文字幕在线| 欧美日本中文国产一区发布| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 桃红色精品国产亚洲av| 涩涩av久久男人的天堂| 久久午夜综合久久蜜桃| 成人亚洲精品一区在线观看| 老司机在亚洲福利影院| 国产极品粉嫩免费观看在线| avwww免费| 日日夜夜操网爽| 男女免费视频国产| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产亚洲欧美98| 人妻 亚洲 视频| 一级毛片精品| 满18在线观看网站| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 天堂动漫精品| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 青草久久国产| 国产成人系列免费观看| 淫妇啪啪啪对白视频| 91av网站免费观看| 久久久久久免费高清国产稀缺| 欧美丝袜亚洲另类 | 在线观看免费视频网站a站| 精品国内亚洲2022精品成人 | 精品国产国语对白av| 1024视频免费在线观看| 国产在线一区二区三区精| 国产精品 欧美亚洲| videosex国产| 黄色成人免费大全| 久久这里只有精品19| av视频免费观看在线观看| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产黄色免费在线视频| 男女午夜视频在线观看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 91av网站免费观看| 老汉色∧v一级毛片| 777米奇影视久久| 国产欧美日韩精品亚洲av| 757午夜福利合集在线观看| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 啦啦啦免费观看视频1| 免费观看精品视频网站| 最近最新中文字幕大全免费视频| 欧美日韩亚洲高清精品| √禁漫天堂资源中文www| 国产免费现黄频在线看| 女同久久另类99精品国产91| 亚洲欧美激情综合另类| 精品乱码久久久久久99久播| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 成人黄色视频免费在线看| 精品国产一区二区三区四区第35| 日日爽夜夜爽网站| 国产精品久久视频播放| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲在线自拍视频| 69av精品久久久久久| 久久久久久人人人人人| 午夜成年电影在线免费观看| 国产精品一区二区在线观看99| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国产成人免费观看mmmm| 天堂动漫精品| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 国产麻豆69| 精品乱码久久久久久99久播| 欧美国产精品va在线观看不卡| 在线观看日韩欧美| 国产精品久久久人人做人人爽| 韩国av一区二区三区四区| 久久九九热精品免费| 午夜福利欧美成人| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 日韩三级视频一区二区三区| 国产精品1区2区在线观看. | 纯流量卡能插随身wifi吗| 免费av中文字幕在线| 亚洲性夜色夜夜综合| 热re99久久精品国产66热6| 777米奇影视久久| 五月开心婷婷网| 久久香蕉精品热| 国产精品亚洲av一区麻豆| 99在线人妻在线中文字幕 | bbb黄色大片| 国产一卡二卡三卡精品| 热99国产精品久久久久久7| 日韩有码中文字幕| 亚洲精品一二三| av不卡在线播放| 69精品国产乱码久久久| 黄色女人牲交| 无限看片的www在线观看| 中文字幕人妻熟女乱码| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 成人亚洲精品一区在线观看| 日韩中文字幕欧美一区二区| 欧美成人免费av一区二区三区 | xxxhd国产人妻xxx| 最近最新免费中文字幕在线| 午夜影院日韩av| 日日爽夜夜爽网站| 日韩大码丰满熟妇| 日本欧美视频一区| 在线国产一区二区在线| 中文欧美无线码| 国产高清激情床上av| 国产成+人综合+亚洲专区| 精品熟女少妇八av免费久了| 午夜免费观看网址| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 国产精品亚洲一级av第二区| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产免费现黄频在线看|