水解度對山藥可溶性蛋白酶解物功能特性的影響

王艷紅，李貝貝，李 欣，趙 勇，王風(fēng)琴，謝朝暉

(1.河南城建學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，河南 平頂山 467036;2.平頂山健康食品協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 平頂山 467036)

山藥(Dioscoreaopposita)為一年或多年生蔓生草本植物，是薯蕷科薯蕷屬植物，具有藥食兼用的特點(diǎn)[1]。山藥作為一種食用和保健價值很高的天然食品資源，在亞洲、非洲和南非均有種植，在我國陜西、河南等省份種植比較廣泛。近年來，在科技強(qiáng)農(nóng)和脫貧致富政策的帶動下，我國其他地區(qū)也開始了大面積種植[2]。通常山藥(干重)中淀粉含量為75%～84%，粗蛋白含量為6%～8%，粗纖維含量為1.2%～1.8%；山藥塊莖中含有薯蕷皂苷元、尿囊素、膽堿和蛋白質(zhì)等功能成分[3]。薯蕷皂苷元是薯蕷的主要貯藏蛋白，占薯蕷可溶性蛋白總量的80%～85%。近二十年來，許多研究表明，薯蕷皂苷在體內(nèi)外均具有酶活性、抗氧化活性、抗高血壓活性、免疫調(diào)節(jié)活性、凝集素活性和氣道上皮細(xì)胞保護(hù)活性[4]。因此，對山藥營養(yǎng)成分的研究在實際應(yīng)用中具有重要的參考價值。

隨著人們對食品和保健品需求的增加，對蛋白質(zhì)的需求也進(jìn)一步增加。植物蛋白來源廣泛，成本低廉，并且擁有與動物蛋白相類似的營養(yǎng)組成，所以開發(fā)和利用植物蛋白資源顯得尤為重要，這也成為今后研究開發(fā)植物蛋白的熱點(diǎn)[5]。山藥可溶性蛋白質(zhì)(Yam soluble protein,YSP)中含有人體生命活動所必需的氨基酸，其中谷氨酸和天冬氨酸居多，其他8種必需氨基酸約占YSP的33.7%，且YSP中某些必需氨基酸或氨基酸對的含量高于FAO與WHO所描述的“理想蛋白質(zhì)”的標(biāo)準(zhǔn)[6]。亞洲山藥資源豐富，種植及食用人群較多，加快對山藥可溶性蛋白的研究顯得尤為重要。

研究顯示，山藥可溶性蛋白(YSP)可參與多種生理活動，如清除自由基、免疫活化和抗高血壓等[7]。另外，蛋白質(zhì)作為食品中重要的營養(yǎng)成分，其功能特性是其他食品成分不能替代的，對食品的品質(zhì)具有決定性作用[8]。而一定程度的酶解可以改變蛋白分子的大小、構(gòu)象及分子間/內(nèi)相互作用力，從而增強(qiáng)其功能特性，但過度的酶解可能造成其功能特性的部分喪失，因此控制蛋白酶解程度對于獲得具有良好功能特性的蛋白制品是必不可少的[9]。然而，關(guān)于YSP功能特性的信息很少被報道，這可能影響其在食品系統(tǒng)中的效用。本文采用堿溶酸沉法提取山藥可溶性蛋白，探討不同水解度下YSP功能特性，如持水性和持油性、乳化性及乳化穩(wěn)定性、起泡性及起泡穩(wěn)定性的變化趨勢，研究結(jié)果可為山藥可溶性蛋白在食品或保健品及其他行業(yè)的應(yīng)用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山藥可溶性蛋白：實驗室制得；堿性蛋白酶(酶活200 u/mg)購于合肥博美生物有限公司；氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、亞硝酸鈉等均為國產(chǎn)分析純。

JJ100超微量電子天平；SW-CJ-2F恒溫水浴鍋；721系列紫外分光光度計；GENIUS 16K低速離心機(jī)；Scientz-12N冷凍干燥機(jī)；MYP11-2磁力攪拌器；FW100高速萬能粉碎機(jī)；FR-1210干燥箱；VORTEX-GENIE2渦旋振蕩器。

1.2 實驗方法

1.2.1 山藥可溶性蛋白的提取

1.2.2 蛋白質(zhì)含量測定

(1)繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線：以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)樣品，采用考馬斯亮藍(lán)法測定其含量，以吸光度(A)為橫坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度(μg/mL)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[10]。

(2)蛋白質(zhì)含量測定：取1 mL的提取液于試管中，加5.0 mL考馬斯亮藍(lán)溶液后搖勻，在595 nm的波長下測定吸光度。與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，計算蛋白質(zhì)含量[11]。

1.2.3 不同水解度山藥蛋白酶解液的制備[12]

將一定量YSP，按底物質(zhì)量濃度為1 mg/ml添加蒸餾水，攪拌至底物均勻分散于水中，調(diào)節(jié)pH至9±0.5，50 ℃水浴加熱，按201的質(zhì)量比添加堿性蛋白酶，反應(yīng)過程中及時加入0.1 mol/L的NaOH，使系統(tǒng)保持在pH為9，分別酶解30、60、90、120、150、180、210、240、270、300、330、360 min，酶解結(jié)束后把酶解液放入100 ℃的沸水中滅酶5 min，待溶液冷卻后調(diào)pH至中性，離心(4500 r/min，5 min)后去上清液即為山藥蛋白酶解液。

1.2.4 山藥蛋白水解度的測定

YSP水解度的測定方法采用pH-Stat法[13]，此方法的依據(jù)是測定整個水解過程中維持體系pH到9所消耗的0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液的總體積，代入水解度測定公式，計算可得到Y(jié)SP的水解度。水解度的計算公式為：

DH/%=(B×Nb)/(a×Mp×htot)×100%

(1)

式中：B為整個水解過程 NaOH 溶液的消耗量(mL)；Nb為滴定的NaOH溶液濃度(mol/L)；Mp為酶解的山藥蛋白質(zhì)量(g)；htot為山藥蛋白中肽鍵的總數(shù)，取值8.2 mmol/g；α為蛋白氨基的平均解離度α=(10pH-pK)/(1+10pH-pK)，pk為7.0，得α為0.99。

1.2.5 山藥可溶性蛋白持水性和持油性的測定[14]

量取20 mL酶解液置于燒杯，加入10 mL水或花生油，充分震蕩后，將溶液磁力攪拌30 min后離心(4 500 r/min,30 min)，棄去水或花生油，稱量離心后沉淀的質(zhì)量，按式(2)計算持水性(WHC)或持油性(OHC)。

WHC/OHC=(M2-M1)/M

(2)

式中：M為樣品質(zhì)量(g)；M1為離心管和沉淀物的總質(zhì)量(g)；M2為離心管和樣品的總質(zhì)量(g)。

1.2.6 山藥可溶性蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的測定[15]

YSP乳化性的測定：取5 mL酶解液至燒杯中，加入10 mL蒸餾水和10 mL花生油，放入離心管中，在渦旋振蕩器下振蕩勻質(zhì)5 min后，以1 500 r/min離心15 min，離心后測量出離心管中乳化層的高度記為N1，液體層的高度記為K，按式(3)計算乳化性(EAI)。

EAI=N1/K×100%

(3)

YSP乳化穩(wěn)定性的測定：把離心管放入90 ℃恒溫水浴鍋，靜置30 min，待冷卻后離心(1 500 r/min,15 min),測量出離心管中乳化層的高度記為N2。按公式(4)計算乳化穩(wěn)定性(ESI)。

ESI=N2/N1×100%

(4)

1.2.7 山藥可溶性蛋白起泡性和起泡穩(wěn)定性的測定[16]

用量筒量20 ml酶解液，再倒入100 mL蒸餾水，用渦旋振蕩器振蕩勻質(zhì)5 min，記錄均質(zhì)停止時泡沫的體積，按式(5)計算起泡性。

(5)

式中：V0為均質(zhì)停止后的泡沫體積(ml)。

將均質(zhì)的樣品靜止放置20 min后，觀察記錄泡沫體積，反復(fù)重復(fù)3次，取平均值。按公式(6)計算起泡穩(wěn)定性。

(6)

式中：V0為初始泡沫體積(ml),V20為靜置20 min后泡沫體積(ml)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

采用Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 山藥可溶性蛋白濃度的測定

蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=0.005 6X+0.130 5(R2=0.998 2)，由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程測得的YSP的含量為353.27 mg/g。

2.2 水解度的測定

山藥可溶性蛋白水解度與水解時間的關(guān)系如圖2所示(圖中誤差線均表示標(biāo)準(zhǔn)誤差)。

圖1 考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 YSP水解度曲線

由圖2可知，運(yùn)用 pH-STAT 法測定山藥可溶性蛋白的水解度，在1～6 h時間段內(nèi)YSP的水解度隨水解時間的增加呈先上升后平緩趨勢，在30～60 min水解度增加較為明顯，隨時間延長，水解度增長速度變緩，這可能與堿性蛋白酶為專一性較強(qiáng)的酶有關(guān)，隨著水解時間的延長，底物蛋白中作用的肽鍵位點(diǎn)會越來越少，導(dǎo)致水解速度越來越慢[17]。當(dāng)水解時間為300 min時，水解度達(dá)到最高為28.12%，隨著水解時間的繼續(xù)延長，蛋白水解度變化不明顯。根據(jù)此結(jié)果，選取6個梯度60、120、180、240、300、360 min進(jìn)行功能性質(zhì)的測定。

2.3 持水性和持油性的測定

不同水解度山藥可溶性蛋白的持水性和持油性如圖3、圖4所示。

圖3 水解時間對YSP持水性的影響

圖4 水解時間對YSP持油性的影響

持水性和持油性對食品的質(zhì)地特性影響比較大，如多汁性、口感和嫩度，一般可作為肉類蛋白的替代品[18]。由圖3可知，酶解時間60～300 min時，YSP的持水性呈現(xiàn)增加趨勢，當(dāng)水解時間為300 min時，YSP持水性最佳。這是由于存在高濃度的極性基團(tuán)，導(dǎo)致樣品中極性基團(tuán)的蛋白質(zhì)-水相互作用和疏水性的產(chǎn)生[18]。水解時間超過300 min，持水性反而會下降。這可能是因為樣品中疏水性基團(tuán)較高引起的。

持油性是指蛋白質(zhì)通過與油的疏水作用結(jié)合而保留的油量。由圖4可知，YSP的持油性隨著酶解時間的增加而呈現(xiàn)整體增強(qiáng)趨勢。持油性的提高可能是酶解后蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)打開，暴露了疏水基團(tuán)，因此截留更多的油[19]。

2.4 乳化性及乳化穩(wěn)定性的測定

不同水解度山藥可溶性蛋白的乳化性及乳化穩(wěn)定性如圖5所示。

蛋白質(zhì)作為一種表面活性劑，可降低水或油的表面張力，從而產(chǎn)生乳化現(xiàn)象；同時，蛋白質(zhì)可分散在連續(xù)相和非連續(xù)相之間的界面上，阻止非連續(xù)相的聚集，達(dá)到乳化穩(wěn)定性的結(jié)果[20]。由圖5可知，水解60～360 min，隨著時間的增加，乳化性先上升后趨于穩(wěn)定但并沒有明顯下降。分析可能原因是，經(jīng)堿性蛋白酶酶解后，YSP的分子水解變小，多肽鏈上暴露的部分疏水基團(tuán)吸收油脂的能力增加，使得溶液中的多肽小分子迅速移動到油層和水層的分界面上，形成了乳濁體使得蛋白酶解液的乳化性增強(qiáng)[18]。隨著水解時間的延長及水解度的增強(qiáng)，乳化性沒有明顯變化，可能此時多肽結(jié)合油脂的能力與其溶解性的增加有關(guān)，因為蛋白質(zhì)溶解度的增加降低了多肽分子向油水界面轉(zhuǎn)移的速度，從而影響了蛋白酶解物的乳化活性[21]。但具體原因還有待進(jìn)一步分析。

乳化穩(wěn)定性結(jié)果顯示，隨著水解時間的增加，乳化穩(wěn)定性也呈增加趨勢。在水解60～300 min時間段內(nèi)乳化穩(wěn)定性的增加較為明顯，可能因為這段時間油脂分子形成的屏障使得乳化穩(wěn)定性上升較快，另外，多肽中疏水基團(tuán)對油脂具有保護(hù)作用，此時乳化穩(wěn)定性會隨著蛋白水解度的升高而升高。

2.5 起泡性及起泡穩(wěn)定性的測定

不同水解度山藥可溶性蛋白的起泡性及起泡穩(wěn)定性如圖6所示。

圖5 不同水解度對YSP乳化性及乳化穩(wěn)定的影響

圖6 不同水解度對YSP起泡性及起泡穩(wěn)定性的影響

具有良好起泡性的蛋白質(zhì)可以幫助食品形成穩(wěn)定的氣泡，即形成疏松多孔的結(jié)構(gòu)，一般可用于烘烤食品中。由圖6可知，起泡性隨著水解時間的增加而增加，在水解時間為360 min時YSP酶解液的起泡性最大達(dá)50%左右。原因可能是由于蛋白質(zhì)上的凈電荷增加，從而減弱了疏水相互作用，增加了蛋白質(zhì)的靈活性[22]。

YSP酶解液的起泡穩(wěn)定性隨著酶解時間的增加而呈現(xiàn)整體下降趨勢，起泡穩(wěn)定性下降的原因可能是酶解液里的多肽黏度下降，使其形成的液膜強(qiáng)度降低，從而形成的泡沫穩(wěn)定性較差，容易消散[22]。起泡穩(wěn)定性在酶解時間60 min時達(dá)到最大值63%，較為穩(wěn)定。

3 結(jié)論

將YSP用堿性蛋白酶水解，通過控制酶解時間得到不同水解度的YSP。研究YSP在不同水解度下功能特性的變化趨勢發(fā)現(xiàn)，水解度可增強(qiáng)也可以削弱某些功能特性。在酶解60～ 360 min內(nèi)，YSP酶解物的持水性隨酶解時間的增加先上升后下降，持油性和起泡性隨酶解時間的增加而增強(qiáng)，山藥蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性隨著酶解時間的增加先上升后趨于穩(wěn)定，而起泡穩(wěn)定性隨著酶解時間的增加呈下降趨勢。在實際應(yīng)用中應(yīng)根據(jù)具體情況合理選擇適度水解條件下的山藥多肽。該研究結(jié)果可為山藥可溶性蛋白的深加工應(yīng)用提供一定的理論參考依據(jù)。