白芨不同制品的多糖含量及止血作用研究

李雪營(yíng)，林先燕，許義紅，魏學(xué)軍，張彬潤(rùn)

(黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，貴州都勻558013)

白芨(BletillastriataReichb)是多年生草本植物白芨的干燥塊莖，主要分布在貴州、廣西、四川等地，具有消腫止血、斂瘡生肌的功效，臨床上常用于咳血、外傷出血、瘡瘍腫毒等癥候治療[1]。白芨作為傳統(tǒng)止血藥，現(xiàn)有研究表明，白芨多糖是白芨止血作用的活性成分[2]。中藥炮制是控制藥材品質(zhì)、抑制偏性、增強(qiáng)藥效和保障臨床用藥安全的技術(shù)手段，而目前有關(guān)炮制對(duì)白芨藥效影響的研究報(bào)道較少。本研究旨在考察炮制對(duì)其止血作用和活性成分白芨多糖含量的影響，選擇炒黃、炒焦和炒炭等炮制方法來(lái)開展研究，以探討白芨止血的適宜炮制方法及與活性成分白芨多糖含量的相關(guān)性。

1 儀器與器材

1.1 儀器 Agilent1260Infinity 型高效液相色譜儀(北京安捷倫公司)；MU5100DUVF型反滲透超純水機(jī)(北京眾力)；FS-1200N型超聲波處理器(杭州匯爾公司)；奧豪斯DV215型分析天平(上海精科天美)；RV10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)IKA艾卡)。

1.2 材料 炮制所需白芨鮮品采自校內(nèi)植物園試驗(yàn)地，經(jīng)本校中藥教研室李香教授鑒定為蘭科植物BletillastriataReichb的干燥塊莖。D-無(wú)水葡萄糖購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院(批號(hào)：110833-201806)，SPF級(jí)昆明種小鼠購(gòu)于長(zhǎng)沙市天勤生物科技有限公司[許可證SCXK(湘)2014-0011]，水為純化水，其他試劑均為AR級(jí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的制備 將新鮮白芨塊莖洗凈，加工制成片狀。取100 g生品，按《中國(guó)藥典》2015年版中附錄炮制通則單炒項(xiàng)下的要求，用文火(鍋底溫度約100℃)炒至原色加深，取出，放涼即得炒黃品。取100 g生品，按《中國(guó)藥典》2015年版中附錄炮制通則單炒項(xiàng)下的要求，用中火(鍋底溫度約為150℃)炒至表面焦褐色，取出，放涼即得炒焦品。取100 g生品，按《中國(guó)藥典》2015年版中附錄炮制通則炒炭項(xiàng)下要求，用武火(鍋底溫度約200℃)炒至白面焦黑色，取出，放涼即得炒炭品。

2.2 白芨多糖的測(cè)定

2.2.1 供試品溶液的制備[3]分別精密稱取不同制品白芨藥材粉末2 g，至具塞錐形瓶中，采用超聲提取法咋料液比1∶30、溫度0℃、時(shí)間30 min的條件下提取，提取液經(jīng)真空抽濾，離心，濃縮后用水稀釋定容至50 ml，搖勻，備用。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品20.0 mg置于50 ml容量瓶中，加適量純化水溶解并定容至刻度，配置成100 mg/L的溶液。分別精密量取上述溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 ml至于10 ml容量瓶中，用純化水稀釋至刻度，配制成0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密量取上述標(biāo)準(zhǔn)葡糖糖溶液2.0 ml置于不同的20 ml具塞刻度試管，分別加入新制5%苯酚溶液1.0 ml，濃硫酸5.0 ml，加純化水至總體積為10 ml，振勻，靜置5 min后，水浴加熱15 min，補(bǔ)充減失的水分至刻度后混勻，再置于冷水浴中靜置10 min。以純化水為空白對(duì)照，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以葡糖糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X，以吸光度為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=1.02X+0.022 2(R2=0.999 6)。試驗(yàn)結(jié)果表明在10～50 μg/ml范圍內(nèi)對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度具有良好線性。

2.2.4 精密度考察 分別精密量取對(duì)照品溶液6份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法連續(xù)測(cè)定6次吸光度，吸光度RSD值為1.19%。

2.2.5 穩(wěn)定性考察 分別精密量取對(duì)照品溶液6份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法，分別在1、2、4、6、8、12、24 h連續(xù)測(cè)定6次吸光度，RSD值為1.72%。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取炒黃品5份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，RSD值為1.65%.

2.2.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知白芨多糖含量的炒黃品5份，加入適量D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，葡糖糖平均回收率為97.75%，RSD值為1.87%。

2.2.8 含量測(cè)定 精密量取各不同炮制品提取所得供試品溶液2.0 ml，按“2.2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度并計(jì)算多糖含量，測(cè)得值為3批次的均值。結(jié)果見表1。

表1 不同制品中白芨多糖含量比較

2.3 小鼠出、凝血時(shí)間測(cè)定[4]用生理鹽水作為空白溶液，取1.3 g云南白藥粉末，加入100 ml純化水即得陽(yáng)性藥物溶液。稱取不同制品白芨粉末各20 g，用超聲提取法提取，料液比1∶20，溫度80℃，時(shí)間10 min。過(guò)濾、離心后減壓回首乙醇至近干，加純化水定容至20 ml容量瓶中，即得含原藥材為1 g/ml的個(gè)樣品溶液。取60只小鼠，隨機(jī)分成6組，分別ig給予各樣品溶液、云南白藥和生理鹽水，給藥體積為20 g/ml，1次/d，連續(xù)ig 5 d。末次給藥1 h后用手術(shù)剪距小鼠尾尖0.5 cm處剪斷，待血液自行溢出時(shí)開始計(jì)時(shí)，每隔30 s用吸水紙蘸血滴1次，直至截面無(wú)血液滲出(用吸水紙蘸時(shí)無(wú)血跡)計(jì)時(shí)停止，耗時(shí)記為出血時(shí)間(BT)。另取60只小鼠，分組與給藥劑量同上。末次給藥1 h后，用毛細(xì)管于小鼠眼球后靜脈叢取血，待血液充滿玻璃管時(shí)開始計(jì)時(shí)，每隔30 s折斷玻璃管約0.5 cm，并向兩側(cè)緩慢拉開，觀察這段出有無(wú)血凝絲出現(xiàn)，至血凝絲出現(xiàn)為止，耗時(shí)記為小鼠凝血時(shí)間(CT)。結(jié)果見表2。

表2 白芨不同制品出、凝血時(shí)間比較

3 討論

研究結(jié)果表明，不同炮制加工方法對(duì)白芨多糖含量的影響顯著。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，與生品比較，采用炒黃炮制加工方法制備的炒黃品能顯著提升多糖含量(P<0.05)，而炒焦品和炒碳品多糖含量顯著降低(P<0.05)，尤以炒炭品最低。究其原因，可能與炒黃品炮制溫度適宜，增加了組織的疏松性有利于多糖的煎出[5]；而隨著炮制溫度的升高，多糖部分分解為還原糖[6]或部分碳化，導(dǎo)致炒焦品和炒碳品中多糖下降明顯。

在止血作用的動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果中，白芨炒黃品、炒焦品和炒炭品均較生品的止血作用強(qiáng)(P<0.05)，尤以炒炭品最顯著。該結(jié)果提示，采用適宜的炮制加工方法能顯著增強(qiáng)白芨的止血作用。結(jié)合制品多糖含量的測(cè)定結(jié)果來(lái)看，白芨炒炭品能增強(qiáng)止血作用與白芨多糖含量無(wú)相關(guān)性，其止血作用增強(qiáng)的原因可能與非白芨多糖成分或炒碳過(guò)程中其他物質(zhì)的產(chǎn)生有關(guān)，如炭素和Ca2+的形成等[7]。因此，需對(duì)白芨炒碳制品增強(qiáng)止血作用的物質(zhì)基礎(chǔ)作進(jìn)一步研究。