苗藥喔嘎良小極性部位化學(xué)成分研究

辛來香，吳銨洋，孫航宇，葛薇薇，唐 毅

(黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第二附屬醫(yī)院，貴州都勻558000))

本課題組在黔東南雷公山地區(qū)進(jìn)行民族醫(yī)藥調(diào)研時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)孛缱宕迕駛兂Ｓ冒训S香茶菜稱為(喔嘎良)；并用其嫩葉來治療腳氣病，具有良好的治療效果，淡黃香茶菜Isodonflavidus(Hand.-Mazz.)Hara為唇形科(Labiatae)香茶菜屬(Isodon)多年生草本植物[1-2]。并且本課題組從該植物的干燥枝葉中分離得到Fladin A和線紋香茶菜酸，兩種化學(xué)成分都具有很好的抗口腔病菌作用和抑制腳氣真菌紅色毛癬菌的作用[3]。包括多種化學(xué)成分如二萜Flavidusin A.三萜類2α-羥基烏蘇酸、甾醇類β-谷甾醇、苷類胡蘿卜苷、倍半萜類脫氫木香內(nèi)酯等[4-5]。而對(duì)于苗藥喔嘎良揮發(fā)性成分研究就比較少，因此本實(shí)驗(yàn)采用水蒸氣蒸餾法提取喔嘎良中揮發(fā)性成分，對(duì)其揮發(fā)性成分進(jìn)行GC-MS分析。

1 HP材料、儀器與試劑

1.1 HP材料 HP苗藥喔嘎良采自貴州雷山，由黔南民族醫(yī)專王傳明副教授鑒定為唇形科香茶菜屬植物淡黃香茶菜Isodonflavidus(Hand.-Mazz.)Hara.植物地上部分。

1.2 HP儀器與試劑 HP揮發(fā)油提取器；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀聯(lián)Agilent7890A/5975C；正己烷(批號(hào)：20190510)；娃哈哈純凈水；KQ5200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；棕色容量瓶；錐形瓶；無水硫酸鈉。

2 HP方法

2.1 HP樣品制備 HP淡黃香茶菜中主要含甾醇類，二萜，苷類，三萜，木脂素類等化合物。針對(duì)這些化合物用了硅膠柱層析、MCI、半制備型HPLC、C18反相柱色譜、凝膠柱色譜、重結(jié)晶等方法對(duì)淡黃香茶菜植物進(jìn)行了進(jìn)一步的分離純化。

溶解石油醚和二氯甲烷部分，適量硅膠拌樣，采用濕法裝柱；石油醚/二氯甲烷系統(tǒng)(100/1，8/2，6/4，1/1)進(jìn)行梯度洗脫，并回收濃縮的洗脫液，經(jīng)薄層檢測(cè)，合并相同流分。從A部分共得到5個(gè)部分(A-1，A-2，A-3，A-4，A-5)。將A-1部分再次進(jìn)行柱層析，系統(tǒng)為石油醚/二氯甲烷(100/1，10/1，9/1，8/2)進(jìn)行梯度洗脫，經(jīng)凝膠柱色譜純化，根據(jù)TLC檢測(cè)得到化合物ID-8(5.3 g)。A-2和A-3部分的樣品采用同A-1相同的分離純化方法，得到化合物ID-9(12.5 g)。A-4和A-5部分的樣品采用同A-1相同的分離純化方法，然后經(jīng)甲醇反復(fù)重結(jié)晶，得到化合物ID-7(15.7 g)，ID-10(7.3 g)。相似方法得到其他化合物，流程見圖1。

圖1 分離流程圖

3 結(jié)果

通過對(duì)淡黃香茶菜化學(xué)成分的分離純化，共得到了25個(gè)化合物；借助IR、UV、MS、13C-NMR、1h-NMR、2D-NMR等現(xiàn)代波譜數(shù)據(jù)以及X-ray技術(shù)，對(duì)其中(ID-1)小極性化合物進(jìn)行了詳細(xì)的分析。

化合物ID-1：無色塊狀晶體(氯仿)；從HREIMS中可看出其分子量為302.451 0,得出該化合物的分子式為C20H30O2，不飽和度為6。紅外光譜(IR)顯示該化合物中含有羰基信號(hào)，信號(hào)峰為1 714 cm-1。從13C-NMR和DEPt譜(見表1)中可看出：該化合物中含有4個(gè)甲基，7個(gè)亞甲基，4個(gè)次甲基和5個(gè)季碳。根據(jù)13C-NMR、1h-NMR及2D-NMR知其中4個(gè)甲基的信號(hào)分別為δC：21.21/0.89(C-17), 24.95/0.94(C-18),18.98/0.96(C-19), 19.02/1.01 (C-20)；羰基的信號(hào)為δC：170.82；環(huán)外雙鍵信號(hào)為δC：149.20, 110.15；環(huán)內(nèi)雙鍵信號(hào)為δC：127.56, 132.79；一個(gè)連有一個(gè)氧的碳的信號(hào)為δC：87.44. 通過對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行推導(dǎo)發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)雙鍵和一個(gè)羧基用去了3個(gè)不飽和度，而化合物總的不飽和度為6，且沒有光譜信號(hào)證明該化合物還含有其他不飽和基團(tuán)，因此推測(cè)該化合物具有三個(gè)環(huán)。

表1 化合物ID-1的13C-NMR數(shù)據(jù)(100 Mz，CDCl3)

在A環(huán)上，從HMBC上可看出，兩個(gè)甲基的氫譜信號(hào)δH：0.96(H3-18)和0.98(H3-19)跟C-4，C-5均相關(guān)，表明角甲基C-18和C-19是連接在C-4位上的，季碳C-3與δH：1.93(H-1α)和2.49(H-2)相關(guān)，C-2與1.93(H-1α)相關(guān)，且從中沒有找到C-2與4,5位上氫相關(guān)的任何信號(hào)，從中可看出A環(huán)為3,4為斷裂的結(jié)構(gòu)，再?gòu)摩腍：1.93(H-1α)與C-20、C-5相關(guān)，結(jié)合δH：1.01(H-20)與C-5、C-9、C-10相關(guān)，再通過δH：2.00 (H-1β)與羰基信號(hào)δC：172.6相關(guān)，得出內(nèi)酯環(huán)是出現(xiàn)在C-3與C-9位間；由以上推導(dǎo)我們可以得出A環(huán)是由C-1，C-2，C-3，C-9，C-10，組成的6元內(nèi)酯環(huán)，且C-20是連在C-10位上的。

在B環(huán)上，通過δH：1.01(H-20)與C-5、C-9、C-10相關(guān)，δH：1.93(H-4)與C-5、C-6、C-10相關(guān)，δH：5.66(H-7)與C-5、C-6、C-9相關(guān)，由以上推導(dǎo)我們可以得出B環(huán)是由C-5，C-6，C-7，C-8，C-9，C-10組成的6元環(huán)，且雙鍵出現(xiàn)在C-7與C-8之間，A環(huán)與B環(huán)通過C-9與C-10相連。在C-5上連接了一個(gè)異丙基。

在C環(huán)上，δH：4.90(H-16)與C-13、C-15相關(guān)，δH：5.81(H-15)與C-12、C-13、C-14、C-17相關(guān)，δH：0.89(H-17)與C-11、C-12、C-13、C-14、C-17相關(guān)，δH：1.93(H-11)、2.55(H-14)兼與C-8(132.79)相關(guān)，δH：0.89(H-12)與C-9、C-11、C-13、C-14、C-17相關(guān)，由此可以推斷C環(huán)是由C-8，C-9，C-11，C-12，C-13，C-14組成的6元環(huán)，且在C-13上連了甲基C-17和雙鍵C-15、C-16。

再結(jié)合1h-1h COSY譜自旋系統(tǒng)H2-1/H2-2可知C-1，C-2相連，自旋系統(tǒng)H-4/H-5可知C-4，C-5相連，自旋系統(tǒng)H-4/H3-18/H3-19可知C-4，C-18，C-19相連，自旋系統(tǒng)H-5/H2-6/H-7可知C-5，C-6，C-7相連，自旋系統(tǒng)H2-11/H2-12可知C-11，C-12相連，自旋系統(tǒng)H-15/H2-16可知C-15，C-16相連。1h-1h COSY進(jìn)一步證實(shí)了上面的推導(dǎo)，由此，整個(gè)化合物的平面結(jié)構(gòu)已經(jīng)推導(dǎo)出來。HMBC和1h-1h COSY的相關(guān)信息如圖2所示。

圖2 化合物ID-1的1 h-1 h COSY(藍(lán)色—)和HMBC(紅色→)關(guān)鍵相關(guān)信息

通過X-ray最終證實(shí)其相對(duì)構(gòu)型，再通過SciFinder Scholar數(shù)據(jù)庫檢測(cè)化合物ID-1為一新化合物，命名為3,4-seco isOPimara-7,15-dien-3,9-olide，其結(jié)構(gòu)式和晶體結(jié)構(gòu)如圖3。

續(xù)表1

圖3 化合物ID-1的結(jié)構(gòu)式及晶體結(jié)構(gòu)圖

4 討論

4.1 對(duì)喔嘎良干品的實(shí)驗(yàn)研究 本實(shí)驗(yàn)主要取雷山產(chǎn)喔嘎良干品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，并用峰面積歸一化法測(cè)定了各化學(xué)成分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，見表2。其中十六酸(27.99%)、亞油酸(18.86%)、亞麻酸甲酯(17.37%)、新植二烯(7.48%)、六氫合金歡丙酮(6.45%)、十四烷酸(3.43%)等6種成分含量最高，占鑒定化合物成分的81.58%。

表2 兩個(gè)產(chǎn)地化合物對(duì)比

4.2 對(duì)淡黃香茶菜HPLC圖的研究 通過對(duì)道真和雷山產(chǎn)淡黃香茶菜HPLC圖(圖4)的分析研究，我們從中發(fā)現(xiàn)由于地區(qū)的不同，他們區(qū)別如下：(1)雷山產(chǎn)該植物在16 min前有一個(gè)明顯的寬峰，在16 min左右有一個(gè)明顯的單峰，在24 min前出現(xiàn)了最強(qiáng)吸收峰，最強(qiáng)吸收波長(zhǎng)為254 nm。(2)道真產(chǎn)該植物在16 min前無明顯的吸收峰，在16 min才出現(xiàn)一個(gè)單峰一個(gè)寬峰，在24 min后出現(xiàn)了最強(qiáng)吸收峰，最強(qiáng)吸收波長(zhǎng)為254 nm和365 nm。(3)雷山產(chǎn)該植物在大極性部分可用365 nm的波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)。故最強(qiáng)吸收波長(zhǎng)不同，最強(qiáng)吸收峰出現(xiàn)的時(shí)間不同，所含化學(xué)成分不同。

圖4 貴州雷山產(chǎn)和道真產(chǎn)該植物中所含化學(xué)成分表