澤瀉對MSG大鼠肝損傷及抗氧化作用的影響

黃春麗，馮光維，汪 巍，余躍生

(黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，貴州都勻558013)

糖尿病( diabetesmellitus，DM)是一種胰島素分泌不足或胰島功能受損引發(fā)的以高血糖為特征并伴有多種并發(fā)癥的的代謝性疾病[1]。近年來隨著人們生活結(jié)構(gòu)的改變以及人口老齡化的影響，糖尿病的發(fā)病率迅速增長，預(yù)計2040年全球糖尿病患者將達到6.42億[2]，嚴重威脅到人類身體健康。肝臟作為機體糖代謝的主要場所，也是胰島素的主要靶器官，臨床研究發(fā)現(xiàn)約有70%糖尿病患者伴有不同程度的肝臟病變，如肝纖維化、肝硬化甚至肝衰竭等[3]。近年來對由2型糖尿病引起的肝損傷研究逐漸增多，糖尿病肝損傷越來越受到人們的重視[4]。澤瀉為澤瀉科澤瀉屬植物澤瀉Alismaorientalis( Samuel.) JuzeP. 的干燥塊莖，具有利尿、降血糖、降血脂、抗氧化及保肝等作用[5-7]。澤瀉對糖尿病的研究多停留在調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂方面，關(guān)于澤瀉治療糖尿病引起的肝損傷方面的研究較少。本研究利用谷氨酸鈉(monosodiumglutamate，MSG)聯(lián)合高脂飼料誘導(dǎo)的MSG肥胖大鼠模型，模擬糖尿病早期糖脂代謝紊亂的癥狀，通過觀察澤瀉對MSG肥胖大鼠肝臟的保護作用并探討可能的作用機制，為澤瀉的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 動物 SD孕鼠，體重(300～400) g，由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，動物合格證編號：SCXK(湘 )2014-0011。實驗前 1周飼養(yǎng)于黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校實驗動物中心，自由飲食，溫度 18～22℃。

1.2 藥品 澤瀉藥材(產(chǎn)自中國廣西，符合2015年藥典標準)，非諾貝特(江蘇瑞年前進制藥有限公司，批號：1803241)，羅格列酮(成都瑞恒有限公司，批號：190512)。

1.3 試劑與儀器 超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20200309)，丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20200304)，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20200306)，ME203E/02電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)，RE-2000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀( 上海亞榮生化儀器廠) ，KZ-II高速組織研磨儀(Servicebio公司)，D3024R臺式高速冷凍離心機(大龍公司)，EPoch酶標檢測儀(BioTeK公司)，BMJ-1生物組織包埋機(天津航空機電公司)，ASP300S全自動封閉脫水機 (LEICA公司)，RM2135病理切片機(LEICA公司)，CX顯微鏡(OLYMPuS公司)。

2 方法

2.1 藥物制備 先將澤瀉藥材粉粹成粗粉，取粗粉1 kg加80%乙醇回流提取3次，每次2 h，減壓回收溶劑既得澤瀉醇提取物，灌胃時用5%阿拉伯膠水溶液配制成所需濃度。高脂飼料配方：2%膽固醇，0.2%豬膽鹽，15%蛋黃粉，22%豬油，10%蔗糖另加高營養(yǎng)飼料攪拌混勻，經(jīng)過高壓、熟化滅菌制得。

2.2 模型建立 SD大鼠新生乳鼠從第2天開始皮下注射L-谷氨酸鈉，劑量為4 g/(kg·d)連續(xù)注射7 d，正常對照組給予等量生理鹽水。21 d后離乳飼養(yǎng)，MSG組給予高脂飼料喂養(yǎng)，正常對照組普通飼料，每周記錄體重觀察體型變化，8周后眼眶采血檢測空腹血糖及血脂變化，以空腹血糖及血脂水平顯著高于正常組為造模成功標準。

2.3 分組及給藥 篩選符合模型標準的大鼠48只大鼠，雌雄各半，按隨機數(shù)字表法分為6組，分別為模型組、羅格列酮組、非洛貝特組、澤瀉高、中、低劑量組，每組8只，另取8只空白大鼠作為正常對照組。羅格列酮組按5 mg/kg灌胃，非諾貝特組100 mg/kg，澤瀉醇提取物高、中、低劑量組分別為(生藥4、2、1 g/kg)，各組每日灌胃1次，連續(xù) 8周，用藥體積按每100 g體重灌胃1 ml，模型組及正常組灌胃同體積5%的阿拉伯膠水溶液。每周稱重1次，根據(jù)體重調(diào)整給藥量。

2.4 標本采集 給藥8周后，腹主動脈采血，剖取肝臟組織，摘取1片液氮速凍后，迅速轉(zhuǎn)入-80℃冰箱冷貯備用。另取1片浸泡于10%福爾馬林溶液，用于肝臟組織形態(tài)變化的觀察。

2.5 指標檢測

2.5.1 肝臟系數(shù)的計算 將剖取的所有肝臟組織，用生理鹽水沖洗，濾紙吸干水分后，稱重，計算肝臟系數(shù)。肝臟系數(shù)=肝臟重量(mg)/大鼠體重(g)×100%。

2.5.2 肝臟病理的檢測 取出福爾馬林中固定好的肝臟組織，進行常規(guī)的洗滌、改刀、脫水、石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下200倍觀察肝臟組織形態(tài)學(xué)變化并拍照。

2.5.3 肝臟SOD、MDA及GSH-Px水平檢測 稱取肝臟適量，用9倍勻漿介質(zhì)研磨，然后將研磨液3 500 r/min，離心10 min，取上清制備成10%的組織勻漿，嚴格按試劑盒的要求進行檢測。

3 結(jié)果

3.1 澤瀉對MSG大鼠肝臟重量及肝臟系數(shù)的影響 給藥8周后，與正常對照組相比，模型對照組肝臟重量及肝臟系數(shù)顯著升高(P<0.01)；與模型對照組相比，羅格利酮、非諾貝特組肝臟重量及肝臟系數(shù)顯著降低(P<0.01，P<0.05)；澤瀉高、中劑量組肝臟重量及肝臟系數(shù)顯著降低(P<0.01，P<0.05)。澤瀉低劑量組對肝臟重量及肝臟系數(shù)沒有明顯影響，見表1。

表1 澤瀉對MSG大鼠肝臟重量及肝臟系數(shù)的影響

3.2 澤瀉對MSG大鼠肝臟組織變化的影響 正常對照組大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞形態(tài)正常，細胞質(zhì)染色均勻，細胞排列整齊，圍繞中央靜脈呈放射狀，未見明顯病理變化(圖1-A)；模型對照組大鼠肝臟結(jié)構(gòu)不清晰，肝細胞腫大，脂肪變性明顯，胞漿充滿空泡脂肪，細胞核偏離正常位置，細胞排列紊亂條索狀排列基本消失(圖1-B)。與模型組相比各治療組除澤瀉低劑量組外其余各組細胞腫脹程度均有減輕，胞漿空泡脂肪減少，脂肪變性程度有所改善，肝細胞結(jié)構(gòu)基本趨于正常(圖1-C～G)。

A正常對照組(H.E×200) B 模型對照組(H.E×200) C羅格列酮組(H.E×200) D非諾貝特組(H.E×200)

3.3 澤瀉對MSG大鼠肝臟SOD、MDA及GSH-Px含量的影響 給藥8周后，與正常對照組相比，模型對照組SOD、GSH-Px含量顯著降低(P<0.01)；MDA含量顯著升高(P<0.01)；與模型對照組相比，羅格利酮、非諾貝特組SOD、GSH-Px活性顯著降低(P<0.01)，MDA含量顯著升高(P<0.01)；澤瀉高、中劑量組SOD、GSH-Px活性顯著降低(P<0.01，P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.01，P<0.05)。澤瀉低劑量組對肝臟SOD、GSH-Px活性及MDA含量沒有明顯影響，見表2。

表2 澤瀉對MSG大鼠肝臟SOD、GSH-Px及MDA的影響

4 討論

糖尿病長期高血糖導(dǎo)致機體不能很好利用的葡萄糖和脂肪酸在肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)橹?，脂肪在肝臟沉積后容易引起肝損傷[8]。反過來，肝損傷后又會影響糖原對葡萄糖的轉(zhuǎn)化，最終影響血糖[9]。因此改善糖尿病引起的肝損傷在糖尿病的治療過程中意義重大。肝臟作為糖脂代謝的主要場所，血糖血脂升高后，肝臟過氧化應(yīng)激水平升高[10]，產(chǎn)生大量氧自由基與體內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生大量丙二醛(MDA)，與蛋白結(jié)合后能使細胞功能失調(diào)甚至破壞細胞活性。而超氧化物歧化酶(SOD)能防止脂質(zhì)過氧化，但血脂上升后損傷肝臟抗氧化能力，致使SOD、GSH-Px活性降低，自由基產(chǎn)生和清除的動態(tài)平衡受到破壞。實驗結(jié)果顯示采用MSG加高脂飼料復(fù)制的MSG肥胖大鼠肝臟有一定程度的受損，并且肝臟中SOD、GSH-Px活性顯著降低，MDA含量明顯上升，經(jīng)過澤瀉治療后，各組大鼠肝臟SOD、GSH-Px活性顯著升高，MDA含量顯著降低，肝臟組織受損情況也有所改善，說明澤瀉對MSG大鼠肝臟有一定的保護作用，并且其作用機制可能與其增加肝臟抗氧化能力有關(guān)，是否是多靶點多途徑還需進行進一步深入研究。