茯苓四物湯對(duì)造影劑誘導(dǎo)的急性腎損傷模型大鼠腎功能及腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響

郭 寧，張勝高，楊文忠，嚴(yán)士海

（1.蘇州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 蘇州 215100；2.江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210029）

造影劑腎?。╟ontrast induced nephropathy，CIN），是由造影劑引起的急性腎損傷（contrast induced acute kidney injury，CI-AKI），即應(yīng)用造影劑后新發(fā)生的腎功能障礙或者原有腎功能障礙加重，目前機(jī)制尚不清楚。CIN一般在使用造影劑后24～48 h發(fā)生，目前無(wú)特效治療藥物。茯苓四物湯出自清代景日昣的《嵩崖尊生全書(shū)》，原方由蒼術(shù)、茯苓、豬苓、澤瀉、官桂、當(dāng)歸、川芎、白芍、生地黃等組成，具有健脾利水、活血養(yǎng)血、祛瘀生新之功效，為治療尿血經(jīng)驗(yàn)方。臨床報(bào)道發(fā)現(xiàn)該方在減少蛋白尿、鏡下紅細(xì)胞等方面療效確切，提示該方可能具有腎保護(hù)作用［1-3］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，茯苓四物湯可降低造影劑相關(guān)腎病發(fā)生率［4］，為進(jìn)一步探討該方在治療造影劑相關(guān)腎病的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立造影劑誘導(dǎo)的急性腎損傷大鼠模型，觀察茯苓四物湯對(duì)模型大鼠的腎保護(hù)作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 選擇清潔級(jí)雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量（220±20）g。實(shí)驗(yàn)大鼠購(gòu)買(mǎi)于南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（蘇）2014-0001。予無(wú)雞卵清蛋白飼料喂養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～25℃，濕度40%～60%，飼養(yǎng)于江蘇省中醫(yī)院藥理實(shí)驗(yàn)室。

1.2 藥品 吲哚美辛（北京百奧萊博科技有限公司）；左旋硝基精氨酸甲酯（L-NAME，上海萌椏生物科技有限公司）；碘海醇注射液（揚(yáng)子江藥業(yè)有限公司，批號(hào)19072561，規(guī)格350 mg/ml）；茯苓四物湯（組成：蒼術(shù)9 g、茯苓9 g、豬苓9 g、澤瀉9 g、肉桂6 g、當(dāng)歸9 g、川芎9 g、白芍9 g、生地黃9 g，由蘇州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房統(tǒng)一煎熬成濃縮湯劑，含生藥3.0 g/ml）。

2 方 法

2.1 動(dòng)物分組 取SD大鼠40只，實(shí)驗(yàn)前稱(chēng)重標(biāo)記后隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組、造影劑腎損傷模型組（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“模型組”）、茯苓四物湯高劑量治療組（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“高劑量組”）及茯苓四物湯低劑量治療組（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“低劑量組”），每組10只。

2.2 動(dòng)物模型建立［5-8］及給藥 高、低劑量組及模型組大鼠禁食禁水12 h后，尾靜脈注射預(yù)先配制的吲哚美辛10 mg/kg，15 min后尾靜脈注射左旋硝基精氨酸甲酯10 mg/kg，再15 min后尾靜脈注射碘海醇（3 gI/kg體重）。注射碘海醇后血肌酐（Scr）較注射前升高大于25%，提示造模成功。茯苓四物湯低、高劑量組根據(jù)藥理實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物與人體間的等效劑量換算計(jì)算出實(shí)際應(yīng)用的給藥劑量，灌胃量分別為成人標(biāo)準(zhǔn)體重（60 kg）臨床等效劑量的20倍與40倍。低、高劑量組分別于注射碘海醇前3 d、注射碘海醇后2 d每日給予茯苓四物湯（16.95 g/kg、33.9 g/kg）灌胃，灌胃容量為20 ml/kg；正常對(duì)照組、模型組予以等量的生理鹽水灌胃。各組大鼠均灌胃5 d。

2.3 動(dòng)物處理 每組于注射造影劑后第48 h麻醉，腹主動(dòng)脈采血3 ml，以3 000 r/min、4℃離心20 min，采集上清液備檢測(cè)。采血后在冰上取兩側(cè)腎臟，置于冰的磷酸鹽緩沖液中，快速去除腎包膜，一側(cè)腎迅速置于10%中性福爾馬林中固定，另一側(cè)腎迅速用濾紙吸干水分，置于-80℃冰箱中冰凍保存。

2.4 病理切片及腎小管損傷程度評(píng)估 取出的腎臟經(jīng)10%中性福爾馬林固定24 h后，常規(guī)石蠟包埋、切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精進(jìn)水，蘇木素染色，鹽酸酒精分化，碳酸鋰蘭化，伊紅染色；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片。光學(xué)顯微鏡下雙盲觀察，每張切片于200倍顯微鏡下隨機(jī)取10個(gè)腎小管間質(zhì)視野，進(jìn)行腎小管損傷評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［9］：無(wú)損傷（-或0分）；輕度（±或1分，單細(xì)胞的，片狀孤立損傷）；中度（+或2分，損傷≤25%）；重度（++或3分，25%＜損傷≤50%）；極重度（+++或4分，損傷＞50%）。每張切片10個(gè)視野評(píng)分總和的均值為腎小管損傷評(píng)分。

2.5 血肌酐（serum creatinine，Scr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）的檢測(cè) 在OLYMPUS AU2700自動(dòng)生化儀上檢測(cè)血清Scr、BUN值。

2.6 TUNEL法檢測(cè)腎臟細(xì)胞凋亡情況 按Dead EndTMColorimetric TUNEL System試劑盒（羅氏公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。每只大鼠隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野，光學(xué)顯微鏡400倍鏡下觀察，每張切片分別從上、下、左、右、中5個(gè)不同視野區(qū)分析，計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）=腎小管上皮細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)/每個(gè)視野腎小管上皮細(xì)胞數(shù)×100%。

2.7 免疫組化檢測(cè)Caspase-3（半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3）的水平 腎臟組織標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋，切片厚3μm，二甲苯脫蠟3次，每次5 min；經(jīng)下行乙醇水化6次，每次5 min；將切片浸沒(méi)在枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液中，用微波爐加熱至沸騰，并保持在95～98℃狀態(tài)下低沸10 min。將切片靜置至室溫（25℃），磷酸鹽緩沖鹽液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗3次，每次10 min；每片加入臨用前稀釋成0.3%的H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶100μl，孵育15 min；PBS沖洗3次，每次10 min。倒掉液體，每片加入一抗（Abcam，ab2302，USA）100μl（濃度1∶100），陰性對(duì)照用PBS代替一抗，濕盒內(nèi)留少量PBS，蓋上濕盒蓋；將濕盒放入4℃冰箱過(guò)夜（16～24 h），次日晨取出，室溫復(fù)溫30 min；PBS沖洗3次，每次10 min；倒掉液體，每片滴加100μl二抗，將濕盒放入37℃恒溫水浴箱內(nèi)恒溫孵育30 min，PBS沖洗3次，每次10 min。將一滴（30μl）DAB色素濃縮液（Signal Stain DAB chromogen concentrate）加入1 ml的DAB稀釋劑中（Signal Stain DAB diluent），混勻，每片加入100～400μl的DAB工作液，顯色10 min。乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。顯微鏡下觀察，拍照。運(yùn)用CIAS-1000型細(xì)胞圖像分析儀進(jìn)行圖像分析，400倍視野下觀察，每組選取3張切片，每張切片從5個(gè)視野分析灰度值，并在空白區(qū)分析灰度值，采用光密度做統(tǒng)計(jì)分析，光密度（OD）=lg（空白灰度/平均灰度）。

2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 采用SPSS 20.0軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為有顯著性差異，P＜0.01為有非常顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)模型大鼠腎臟病理?yè)p傷的影響 見(jiàn)表1及圖1。模型組大鼠腎小管損傷評(píng)分顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01）；低劑量組、高劑量組評(píng)分均顯著低于模型組（P＜0.05），且高劑量組較低劑量組評(píng)分更低（P＜0.05）。圖1顯示：正常對(duì)照組腎小管正常，上皮細(xì)胞完整；模型組病理?yè)p傷顯著增加，腎小管擴(kuò)張，管腔內(nèi)可見(jiàn)大量管型，甚至閉塞；低劑量、高劑量組損傷明顯減輕。

表1 各組腎小管損傷評(píng)分 （分，±s）

表1 各組腎小管損傷評(píng)分 （分，±s）

注：與正常對(duì)照組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.05；與低劑量組比較，③P＜0.05

組 別正常對(duì)照組模型組低劑量組高劑量組n 10 10 10 10腎小管損傷評(píng)分0.45±0.13 3.17±0.69①2.45±0.53②1.91±0.62②③

圖1 各組大鼠腎臟損傷病理圖（HE×200）

3.2 對(duì)模型大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響 見(jiàn)表2及圖2。與正常對(duì)照組比較，模型組腎小管上皮細(xì)胞凋亡率明顯增加（P＜0.01）；低劑量組、高劑量組大鼠腎上皮細(xì)胞凋亡率均明顯低于模型組（P＜0.01），且高劑量組較低劑量組腎上皮細(xì)胞凋亡率更低（P＜0.01）。圖2顯示：細(xì)胞核呈棕黃色者為陽(yáng)性細(xì)胞，正常對(duì)照組腎小管正常，上皮細(xì)胞完整；模型組腎小管上皮細(xì)胞凋亡顯著增加；低劑量、高劑量組腎小管上皮細(xì)胞凋亡明顯減少。

表2 各組腎小管上皮細(xì)胞凋亡率 （±s）

表2 各組腎小管上皮細(xì)胞凋亡率 （±s）

注：與正常對(duì)照組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.01；與低劑量組比較，③P＜0.01

組 別正常對(duì)照組模型組低劑量組高劑量組n 10 10 10 10凋亡率（%）4.22±1.35 44.01±5.60①21.85±4.02②10.80±2.60②③

圖2 各組腎小管上皮細(xì)胞凋亡典型圖（TUNEL×400）

3.3 對(duì)模型大鼠腎臟Caspase-3表達(dá)的影響 見(jiàn)表3及圖3。結(jié)果顯示：模型組Caspase-3光密度值明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.01）；低劑量組、高劑量組光密度值明顯低于模型組（P＜0.01），且高劑量組較低劑量組光密度值更低（P＜0.05）。圖3顯示：Caspase-3主要在腎小管上皮細(xì)胞胞漿中表達(dá)，部分在胞核中表達(dá)，棕黃色顆?；揪鶆蚍植肌Ｕ?duì)照組Caspase-3表達(dá)很少，模型組Caspase-3表達(dá)顯著增加，特別是腎小管上皮區(qū)域，低劑量、高劑量組Caspase-3表達(dá)顯著減少。

表3 各組Caspase-3光密度值比較 （±s）

注：與正常對(duì)照組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.01；與低劑量組比較，③P＜0.05

組 別正常對(duì)照組模型組低劑量組高劑量組n 10 10 10 10光密度值0.55±0.12 2.27±0.27①1.47±0.12②1.05±0.17②③

3.4 對(duì)模型大鼠血清Scr、BUN的影響 見(jiàn)表4。與正常對(duì)照組比較，模型組Scr、BUN顯著增加（P＜0.01）；低劑量、高劑量組Scr、BUN均較模型組顯著下降（P＜0.05），且高劑量組下降更顯著（P＜0.05）。

表4 各組血清Scr、BUN水平比較 （μmol/L，±s）

表4 各組血清Scr、BUN水平比較 （μmol/L，±s）

注：與正常對(duì)照組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.05；與低劑量組比較，③P＜0.05

組 別正常對(duì)照組模型組低劑量組高劑量組n 10 10 10 10 Scr 24.24±3.47 49.34±6.31①32.94±2.98②27.14±4.71②③BUN 8.54±2.19 24.15±4.79①16.01±3.03②12.61±2.38②③

4 討 論

目前認(rèn)為CIN主流的發(fā)生機(jī)制有腎髓質(zhì)缺氧、氧化應(yīng)激、腎小管上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及造影劑的毒性作用等，其危險(xiǎn)因素與糖尿病、高血壓、心血管疾病、利尿劑使用、高尿酸血癥、高齡、造影劑數(shù)量及類(lèi)型等有關(guān)［10］。充分水化是有效預(yù)防CIN有效的措施［11］，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)前列腺素E1、尼可地爾可降低CIN發(fā)生率，瑞舒伐他汀可降低慢性腎臟病或糖尿病等高危患者發(fā)生CIN的風(fēng)險(xiǎn)［12-14］，但他汀類(lèi)藥物在CIN防治中的作用仍有爭(zhēng)議［15］。

中醫(yī)認(rèn)為造影劑腎病的主要病因病機(jī)為血瘀和毒邪，“毒為先導(dǎo)、毒瘀互結(jié)”，病位在腎，標(biāo)實(shí)為主，毒瘀日久、耗傷氣血而致虛瘀兼具，且腎為水臟，腎病則水濕痰濁易生，因此泄?jié)峤舛?、活血散瘀、化濕行氣、調(diào)和氣血、扶正祛邪是造影劑腎病的主要治法［16-18］。相關(guān)研究顯示丹紅注射液、紅花黃色素氯化鈉、丹參川芎嗪、丹參多酚酸鹽等均具有防治造影劑腎病作用［19］，其可能的腎保護(hù)機(jī)制為：擴(kuò)張腎臟血管，改善腎血流灌注，減少腎小球及腎小管內(nèi)皮細(xì)胞損傷；抗氧化、清除氧自由基、抗凝、抑制血小板聚集；提高內(nèi)生肌酐清除率，促進(jìn)造影劑的排泄等［20-21］。相關(guān)文獻(xiàn)［22］報(bào)道單味中藥提取物有效成分能夠有效防治CIN，如黃芩苷能有效提高小鼠體內(nèi)環(huán)磷酸腺苷水平與蛋白激酶A活性，調(diào)控蛋白激酶A信號(hào)通路，抑制巨噬細(xì)胞中ATP誘導(dǎo)的NOD樣受體蛋白3（Nod-like receptor pyrin domain3，NLRP3）炎性小體的活化和細(xì)胞凋亡；雷公藤多苷能有效抑制ROS-NLRP3炎性通路，達(dá)到減輕CIN的效果；冬蟲(chóng)夏草能減少腎小管上皮細(xì)胞的凋亡，川芎嗪可以抑制Caspase-3，從而降低腎小管細(xì)胞凋亡速度，起到防治CIN的效果；茯苓、茯苓皮、豬苓和澤瀉的提取物主要通過(guò)利尿作用而減少CIN發(fā)生。龔學(xué)忠等［23-25］發(fā)現(xiàn)制大黃-川芎藥對(duì)能通過(guò)抑制Caspase-3抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡及抑制p38 MAPK、Nrf2/HO-1通路活化而保護(hù)CIN大鼠的腎功能。郝健等［26］研究發(fā)現(xiàn)制大黃-川芎藥對(duì)可能通過(guò)TLR4/Myd88/NF-κB信號(hào)通路減少造影劑誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-1β的分泌，進(jìn)而抑制了CIN大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡，發(fā)揮保護(hù)作用。相關(guān)研究［22］發(fā)現(xiàn)經(jīng)方五苓散、防己黃芪湯、防己茯苓湯、五皮散亦具有防治CIN作用，其機(jī)制可能與利水滲濕類(lèi)方劑在稀釋造影劑濃度、促進(jìn)造影劑排泄和減少造影劑在腎臟內(nèi)的潴留、減輕藥物對(duì)腎臟Na+-K+-ATP酶活性的抑制有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)茯苓四物湯可以顯著降低造影劑誘導(dǎo)的急性腎損傷模型大鼠的BUN、Scr水平，改善模型大鼠腎功能，提示其具有腎保護(hù)作用，這可能與茯苓四物湯減輕模型大鼠腎小管上皮細(xì)胞損傷、減少腎小管上皮細(xì)胞凋亡及抑制Caspase-3表達(dá)有關(guān)，但具體的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步探索研究。