TRIM31通過抑制NLRP3炎性小體通路改善蛛網膜下腔出血大鼠早期腦損傷

田密 曾進 聶偉 李擁軍 劉曉君

(湖南中醫(yī)藥高等?？茖W校附屬第一醫(yī)院神經內科，湖南 株洲 412000)

蛛網膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage，SAH)是世界上致死率和致殘率均較高的一種中樞神經系統(tǒng)疾病，雖然顯微外科技術發(fā)展迅速，但SAH患者的預后仍不令人滿意。發(fā)生在SAH后72 h內的早期腦損傷(Early brain injury，EBI)是導致SAH患者死亡或不良預后的主要原因[1-2]，而神經炎癥被認為是SAH后EBI的重要病理過程[3]。因此，抑制炎癥反應是減輕SAH后腦損傷的潛在治療方法。作為機體先天免疫系統(tǒng)核心成分，含NLR家族Pyrin域蛋白3(NLR family pyrin domain containing 3，NLRP3)炎性小體介導的神經炎癥對中樞神經系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展具有重要調控作用[4]。大量研究顯示[5-6]，抑制NLRP3炎性小體的激活可明顯改善SAH后EBI。三結構域蛋白31(Tripartite motif containing 31，TRIM31)是一種具有E3泛素連接酶活性的蛋白，能夠通過泛素-蛋白酶體途徑促進底物降解，參與細胞凋亡、增殖、代謝等多種細胞生物學過程[7]。有研究表明[8]，TRIM31是NLRP3炎性小體的抑制因子，能夠與NLRP3直接結合并促進其泛素化降解。據此推測，TRIM31有可能通過抑制NLRP3炎性小體活化改善SAH后EBI，且目前相關研究鮮有報道。因此，本研究通過構建SAH大鼠模型，觀察側腦室注射TRIM31過表達慢病毒對大鼠SAH后EBI的影響，并探討其對NLRP3炎性小體活化的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康清潔級雄性SD大鼠60只，體質量280～320 g，鼠齡7～8周，由湖南昭泰生物醫(yī)藥有限公司提供，實驗動物許可證號：SYXK(湘)2017-0004。實驗前所有大鼠均進行1周環(huán)境適應，飼養(yǎng)于溫度20～22℃，相對濕度50%～60%，12 h/12 h明暗交替的環(huán)境，自由飲水進食。本研究經過醫(yī)院動物倫理委員會審核批準。

1.2 主要試劑及儀器 TRIM31過表達慢病毒及其陰性對照慢病毒質粒構建及慢病毒包裝、濃縮和純化均由漢恒生物工程(上海)有限公司完成；PrimeScriptTMRT reagent kit和SYBR?Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；大鼠白介素1β(IL-1β)ELISA檢測試劑盒和大鼠白介素18(IL-18)ELISA檢測試劑盒均購自南京森貝伽生物科技有限公司；兔抗人NLRP3多克隆抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司；兔抗人半胱天冬酶-1(Caspase-1)單克隆抗體購自英國Abcam公司；兔抗人TRIM31多克隆抗體購自美國Novus Biologicals公司；小鼠抗人凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)單克隆抗體、兔抗人GAPDH抗體多克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；腦立體定位儀購自美國Stoelting公司；Mk3酶標儀購自芬蘭雷達公司。

1.3 方法

1.3.1 分組及SAH模型構建 將60只大鼠按照隨機數(shù)字表法分為假手術組(sham組)、SAH模型組(SAH組)、陰性對照慢病毒干預組(Lv-NC組)和TRIM31過表達慢病毒干預組(Lv-TRIM31組)，每組15只。采用血管內穿刺法[9]制備SAH大鼠模型：3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，取俯臥位，備皮消毒，沿頸部中線切開，依次暴露右頸總動脈、頸外和頸內動脈。采用動脈夾阻斷頸外動脈和頸內動脈之間的吻合支，同時結扎并離斷頸外動脈，3-0尼龍線由頸外動脈置入頸內動脈，緩慢進入顱內，有阻力感后繼續(xù)前進3 mm，有空落感表示血管刺破成功，造成SAH，迅速拔出尼龍線，結扎頸外動脈殘端，恢復血流，縫合并消毒傷口。其中sham組大鼠不刺破血管，其他各組均刺破血管。穿刺手術中以穿刺后無實質性腦損害的SAH或血凝塊作為模型制備成功標準。術前24 h，采用腦立體定位裝置經側腦室注射慢病毒進行干預，Lv-TRIM31組大鼠經側腦室注射10 μL TRIM31過表達慢病毒(1×108TU/mL)，Lv-NC組大鼠經側腦室注射10 μL 陰性對照慢病毒(1×108TU/mL)，sham組和SAH組大鼠分別注射等量生理鹽水。

1.3.6 ELISA檢測 SAH造模后24 h，取部分海馬組織，制備組織勻漿，4℃條件下12000×g離心10 min，收集上清，按照試劑盒說明書進行檢測，采用酶標儀檢測450 nm處吸光度值(OD值)，根據標準曲線計算海馬組織勻漿中IL-1β和IL-18水平。

1.3.3 腦組織含水量檢測 SAH造模后24 h，從各組中隨機取出5只大鼠，斷頸處死并完整取出腦組織，去除腦膜并用濾紙清理表面血漬和積組織液體，稱量整個腦組織質量為濕重，隨后將其置于100℃烘箱內烘烤至恒重，再稱量為干重。腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.3.2 神經功能評估 SAH造模后24 h，采用改良Garcia評分表[10]評估各組大鼠神經功能，該評分表包含6項內容：自發(fā)活動(0～3分)、四肢對稱運動(0～3分)、前爪伸展活動(0～3分)、攀爬活動(1～3分)、身體本體感覺(1～3分)和觸須反應(1～3分)，總分3～18分，分數(shù)越低神經功能損傷越嚴重。

1.3.5 TUNEL染色 SAH造模后24 h，取部分海馬組織，4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋后切片、脫蠟，0.3% H2O2封閉30 min，滴加不含DNase的蛋白酶K(20 μg/ml)于37℃孵育15 min，PBS洗滌3次，滴加50 μL 生物素標記液置于37℃避光孵育60 min，PBS洗滌3次，滴加0.3 mL標記反應終止液，室溫孵育10 min，PBS洗滌3次，滴加50 μL Streptavidin-HRP工作液，室溫避光孵育30 min，PBS洗滌3次，滴加DAB顯色液，室溫避光孵育10 min，PBS洗滌3次，蘇木素復染，梯度酒精復水，二甲苯透明，中性樹脂封片，光學顯微鏡下觀察，TUNEL染色陽性凋亡細胞核呈棕色。每張切片隨機選取5個高倍鏡視野計數(shù)500個細胞，以陽性細胞百分比表示細胞凋亡率。

1.3.4 qRT-PCR檢測 SAH造模后24 h，取部分各組大鼠腦組織，并分離海馬組織。取部分海馬組織，采用Trizol法提取總RNA，測定總RNA濃度。采用PrimeScriptTMRT reagent kit將總RNA逆轉錄成cDNA，以cDNA為模板采用SYBR?PremixExTaqⅡ試劑盒進行PCR擴增反應。TRIM31，上游引物：5′-CCAG AGTCAAACCGTGAGC G-3′，下游引物：5′-GGCAACTTGGAGCCCGAA-3′；NLRP3，上游引物：5′-TGGG TTCTGGTCAGACACGAG-3′，下游引物：5′-GGCGG GTAATCTTCCAAATGC-3′；caspase-1，上游引物：5′-TGCCGTGGAGAGAAACA AGG-3′，下游引物：5′-CCCCTGACAGGATGTCTCCA-3′；GAPDH，上游引物：5′-GGTGGACCTCATGGCCTACAT-3′，下游引物：5′-GCCTCTCTC TTGCTCTCA GTATCCT-3′；ASC，上游引物：5′-GCCGAGCTCACCGCTAACG-3′，下游引物： 5′-CATCCAGCAGCC ACTCAACG-3′。PCR反應條件：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內參，采用2-△△Ct法計算TRIM31、NLRP3、ASC和Caspase-1 mRNA相對表達水平。

鏡頭動作是微視頻創(chuàng)作中的一種重要剪輯因素。它指因攝像機位置有目的的移動而帶來和構成的鏡頭的運動變化。它是視頻特有的藝術元素，剪輯時要盡可能的充分發(fā)揮其獨特的功用[1]。專業(yè)拍攝中運動性鏡頭有推、拉、搖、移、跟等多種方式，各有特色和藝術感染力。比如推鏡頭，指對象位置不動，鏡頭與畫面逐漸靠近，畫面外框逐漸縮小，畫面內的景物逐漸放大，使觀眾的視線從整體看到某一布局，引導觀眾更深刻地感受角色的內心活動，加強情緒氣氛的烘托。再比如移鏡頭，指攝像機橫向移動拍攝，可以把行動著的人物和景物交織在一起，形成一種富有流動感的拍攝方式，產生強烈的動感和節(jié)奏。

1.3.7 Western blot檢測 SAH造模后24 h，取部分海馬組織，加入適量RIPA細胞裂解液，冰上碾磨，4℃條件下12000×g離心20 min，收集上清，采用BCA法測定蛋白濃度。取30 μg蛋白樣品沸水浴變性后上樣，用10%的SDS-PAGE分離蛋白質并轉移到PVDF膜，并用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。分別加入TRIM31抗體(1:1000)、NLRP3抗體(1:1000)、ASC抗體(1:500)、Caspase-1抗體(1:1000)和GAPDH抗體(1:1000)，置于4℃條件下孵育過夜。TBST洗膜3次，加入HRP標記的二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，滴加化學發(fā)光液，顯影。采用Image-Pro Plus6.0軟件進行定量分析。

實驗中將兩組電池組分別置于高溫和低溫的情況下進行實驗?？紤]到兩組電池組可能存在性能上的差異,所以在實驗中將同組電池組進行了高溫和低溫的兩組情況進行實驗。表1為電池組不同溫度下放電50%后的的剩余容量情況。

2.4 各組大鼠海馬組織炎癥因子IL-1β和IL-18含量 與sham組比較，SAH組細胞海馬組織中IL-1β和IL-18含量升高(P<0.001)；與SAH組比較，Lv-TRIM31組大鼠海馬組織中IL-1β和IL-18含量降低(P<0.05)，而Lv-NC組無顯著性變化(P>0.05)，見圖4。

2 結果

2.3 各組大鼠海馬神經元凋亡水平 與sham組比較，SAH組大鼠海馬神經元凋亡水平升高(P<0.001)；與SAH組比較，Lv-TRIM31組大鼠海馬神經元凋亡水平降低(P<0.001)，而Lv-NC組無顯著性變化(P>0.05)。見圖3。

式中,σ是隨機力的標準差(或稱為噪聲振幅),γ是黏滯系數(shù),也被稱作摩擦因子,kB為Boltzmann因子,T為體系的絕對溫度.

2.2 各組大鼠神經功能評分及腦組織含水量 與sham組比較，SAH組大鼠神經功能評分降低(P<0.001)；腦組織含水量升高(P<0.01)。與SAH組比較，Lv-TRIM31組大鼠神經功能評分升高(P<0.001)，腦組織含水量降低(P<0.05)，而Lv-NC組無顯著性變化(P>0.05)。見圖2。

圖2 各組大鼠神經功能評分及腦組織含水量比較Figure 2 Comparison of neurological score and brain water content in rats of various groups注：A. 神經功能評分；B. 腦組織含水量；與sham組比較，①P<0.01，②P<0.001；與SAH組比較，③P<0.05，④P<0.001

2.1 各組大鼠海馬組織中TRIM31 mRNA和蛋白表達水平 與sham組比較，SAH組大鼠海馬組織中TRIM31 mRNA和蛋白表達水平降低(P<0.05)；與SAH組比較，Lv-TRIM31組大鼠海馬組織中TRIM31 mRNA和蛋白表達水平升高(P<0.001)，而Lv-NC組無顯著性變化(P>0.05)。見圖1。

1.利益困境。如前所述，現(xiàn)實主義國際合作觀下阻礙國際合作有效開展的重要因素為國家利益趨向，在網絡反恐中尤為突出。20世紀50年代至今，網絡核心技術被發(fā)達國家壟斷，發(fā)達國家在網絡空間中擁有絕對話語權。發(fā)展中國家由于技術有限，被迫受制于發(fā)達國家，很難發(fā)揮自己對網絡空間的主導權。發(fā)達國家甚至利用自身技術優(yōu)勢，在政治、經濟、文化等各領域對發(fā)展中國家進行干預，威脅發(fā)展中國家利益，這種利益歸屬不同，導致在網絡反恐中很難有實質性的合作。

圖3 TUNEL染色(200×)Figure 3 TUNEL staining

第一，依據是“改寫世界歷史”。馬克思主義唯物史觀認為，一切社會的歷史都是階級斗爭的歷史。階級斗爭既創(chuàng)造了歷史，又改寫了歷史?！豆伯a黨宣言》宣告了超越資本主義文明的一個基本前提，就是全面、徹底地反省資本主義對于人類歷史所具有的“超出之前全部歷史總和”的偉大革命作用。馬克思恩格斯也肯定了資產階級革命作用。這個作用就是改寫世界歷史。[6]P106

圖4 各組大鼠海馬組織中IL-1β和IL-18水平比較Figure 4 Comparison of the levels of IL-1βand IL-18 in hippocampus tissues of rats in various groups

2.5 各組大鼠海馬組織中NLRP3、ASC和Caspase-1表達水平 與sham組比較，SAH組細胞海馬組織中NLRP3、ASC和Caspase-1等蛋白表達水平升高(P<0.001)。與SAH組比較，Lv-TRIM31組大鼠海馬組織中NLRP3、ASC和Caspase-1等蛋白表達水平降低(P<0.05)，而Lv-NC組無顯著性變化(P>0.05)，見圖5。

圖5 各組大鼠海馬組織中NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白表達水平比較Figure 5 Comparison of the protein expression levels of NLRP3，ASC and Caspase-1 in hippocampus tissues of rats in various groups

3 討論

TRIM31是TRIM蛋白家族新成員，屬于環(huán)狀E3泛素連接酶，含有三個典型的結構域即鋅指結構域、B-Box結構域和卷曲螺旋結構域，可通過介導底物蛋白泛素化降解而發(fā)揮作用[11]。目前，有關TRIM31的研究主要集中在腫瘤領域，Xiao等[12]研究顯示，TRIM31通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進急性髓性白血病的發(fā)展及其柔紅霉素的耐藥性；Shi等[13]研究稱，TRIM31通過激活Akt信號通路促進神經膠質瘤細胞增殖、侵襲與轉移。此外，也有研究表明[14]，TRIM31表達下調與小鼠葡萄糖代謝受損和腸道微生物群紊亂有關。然而，TRIM31與神經炎癥介導的中樞神經系統(tǒng)疾病之間的研究鮮有報道，且目前也未有研究探討TRIM31對SAH后早期腦損傷的影響。本研究結果發(fā)現(xiàn)，經側腦室注射TRIM31過表達慢病毒可通過抑制NLRP3炎性小體通路介導的炎癥反應減輕SAH大鼠早期腦損傷。

SAH后血腦屏障中斷導致腦水腫，隨后出現(xiàn)腦腫脹、顱內壓升高、神經元死亡和神經功能缺損。既往研究表明[2]，SAH后神經元凋亡和腦組織水腫是EBI的兩個主要病理過程。本研究通過側腦室注射TRIM31過表達慢病毒對SAH大鼠進行干預，結果發(fā)現(xiàn)SAH大鼠海馬組織中TRIM31 mRNA和蛋白表達水平較sham組降低，說明TRIM31異常表達可能對SAH發(fā)展有影響。TRIM31過表達慢病毒干預后，SAH大鼠海馬組織中TRIM31 mRNA和蛋白表達水平升高，說明成功介導SAH大鼠海馬組織中TRIM31基因過表達。隨后，本研究對大鼠神經行為學及病理學進行研究，結果顯示，SAH大鼠神經功能評分降低，腦組織含水量和海馬神經元凋亡水平升高，說明本研究構建的SAH大鼠模型出現(xiàn)了比較明顯的EBI，與他人研究結果一致[15-16]。TRIM31過表達慢病毒干預后，SAH大鼠神經功能評分升高，腦組織含水量和海馬神經元凋亡水平降低，說明TRIM31過表達可改善大鼠SAH后EBI。

神經炎癥是決定許多神經系統(tǒng)疾病進展的重要因素，其所致腦損傷是SAH后EBI的重要病理機制[3，17]。NLRP3炎性小體是機體先天免疫系統(tǒng)核心成分，在神經炎癥反應中發(fā)揮重要調節(jié)作用。NLRP3炎性小體是細胞內重要的多蛋白復合物，由NLRP3、ASC和caspase-1構成，可引導對致病性刺激的先天免疫應答，對caspase-1進行自身活化，促進IL-1和IL-18的成熟及分泌，以及誘導細胞死亡[18-19]。大量研究顯示[5，6，20]，NLRP3炎性小體在SAH后EBI過程中被激活，抑制NLRP3炎性小體活化可改善SAH后EBI。而有研究顯示[8，21]，TRIM31能夠促進NLRP3蛋白泛素化降解，抑制NLRP3炎性小體的活化及IL-1和IL-18的分泌。王濤等[22]研究證實，TRIM31過表達可通過抑制NLRP3炎癥小體活化，改善脂多糖誘導的神經細胞PC12的炎性損傷。因此，TRIM31過表達對大鼠SAH后EBI的改善作用機制可能與抑制NLRP3炎性小體活化有關。為進一步證實，本研究對大鼠海馬組織中NLRP3炎性小體復合物蛋白NLRP3、ASC和caspase-1以及相關炎癥因子IL-1和IL-18的表達水平進行了檢測，結果顯示SAH大鼠海馬組織中NLRP3、ASC和caspase-1 mRNA和蛋白表達水平以及海馬組織勻漿中IL-1和IL-18水平較sham組升高，說明SAH后EBI過程中NLRP3炎性小體確實被激活。而TRIM31過表達慢病毒干預后，SAH大鼠海馬組織中NLRP3、ASC和caspase-1 mRNA和蛋白表達水平以及海馬組織勻漿中IL-1和IL-18水平均降低，表明TRIM31過表達可抑制NLRP3炎性小體相關蛋白的表達及活化。

在此次研究中,實驗組的治療依從性評分為(19.56±1.28)分,參照組的治療依從性評分為(14.15±1.40)分,實驗組患者平均住院(5.55±0.49)天,參照組患者平均住院(9.57±0.94),結果存在統(tǒng)計學差異性,實驗組患者的服務態(tài)度評分平均是(4.26±0.45)分、健康宣教評分平均是(4.90±0.30)分;參照組患者為(3.09±0.44)分、(2.90±0.30),兩組結果對比存在統(tǒng)計學差異性(P<0.05)。說明使用優(yōu)質護理能夠讓腎小球腎炎患者的臨床病情得到改善,提升患者的滿意度。

4 結論

本研究初步闡明TRIM31過表達可改善SAH后EBI，其機制可能與NLRP3炎性小體活化被抑制有關。鑒于TRIM31能夠促進NLRP3蛋白泛素化降解已被其他學者證實，故本研究中未在動物水平再次進行證實，今后本課題組將繼續(xù)深入研究TRIM31在SAH進程中的作用與功能，以期為SAH臨床治療提供更全面的理論依據。