NGF、TrkA及c-Met表達(dá)對(duì)原發(fā)性上皮性卵巢癌病情評(píng)估及預(yù)后預(yù)測(cè)的作用*

劉海龍 李娟 董小鑫 黃翠蘭

(1.西安交通大學(xué)， 陜西 西安 710000；2.岳池縣人民醫(yī)院， 四川 廣安 638300；3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬西安市第九醫(yī)院， 陜西 西安 710000)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其中原發(fā)性上皮性卵巢癌較為多見，占所有卵巢癌的90%左右[1]。早期卵巢癌患者無(wú)明顯癥狀，多數(shù)患者就診時(shí)已處于晚期，易錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)期，影響患者預(yù)后[2]。所以早期診斷卵巢癌，進(jìn)一步評(píng)估病情進(jìn)展，進(jìn)而采取相應(yīng)治療措施是提高診療成功率的關(guān)鍵[3]。c-Met(c-metprotoncogene)是原癌基因，具有酪氨酸激酶活性，參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)控細(xì)胞骨架重建，已證實(shí)其表達(dá)水平與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4]。神經(jīng)生長(zhǎng)因子(Nerve growth factor，NGF)作為一種多效性肽類激素，可通過(guò)與靶細(xì)胞中親和力較高的TrkA受體及低親和力P75受體結(jié)合調(diào)控細(xì)胞正常生理活動(dòng)，且NGF在多種惡性腫瘤中呈異常表達(dá)狀態(tài)，與腫瘤進(jìn)展、預(yù)后密切相關(guān)[5]。研究顯示，c-Met和Trk受體除了在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中各自的作用外，在促進(jìn)腫瘤進(jìn)展方面也有關(guān)系[6]?；罨腸-Met增強(qiáng)TrkA信號(hào)傳導(dǎo)和神經(jīng)生長(zhǎng)因子的生物活性[7]，TrkB上調(diào)腫瘤細(xì)胞中c-Met的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲力[8]。TrkA和c-Met的高表達(dá)和c-Met拷貝數(shù)增加/擴(kuò)增是涎腺導(dǎo)管癌(Salivary duct carcinoma，SDC)中的常見事件，并且TrkA和c-Met的高表達(dá)揭示了在HER2陰性的SDC中與不良預(yù)后相關(guān)的趨勢(shì)[9]。最近的分子研究表明，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的c-Met和Trk通路相互反式激活[10]。本研究用NGF、TrkA、c-Met的表達(dá)情況對(duì)原發(fā)性上皮性卵巢癌患者進(jìn)行病情評(píng)估，并分析其在該病患者預(yù)后預(yù)測(cè)中的作用，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析岳池縣人民醫(yī)院2016年6月～2018年6月收治的115例原發(fā)性上皮卵巢癌患者，年齡36～75歲，平均(50.31±6.65)歲。將卵巢癌患者作為癌組織組，將對(duì)側(cè)正常卵巢組織作為正常組織組，每組各115例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均經(jīng)病理檢查證實(shí)。②未接受化療、放療、免疫等輔助治療。③本研究患者臨床資料均完整。④無(wú)其它惡性疾病。⑤受試者簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并肝、腎、心臟臟器嚴(yán)重疾病者。②合并嚴(yán)重神經(jīng)功能、認(rèn)知功能障礙者。③依從性差者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究方法 收集所有患者臨床資料，比較NGF、TrkA及c-Met在癌組織組及正常組織組的表達(dá)情況；分析NGF、TrkA及c-Met與原發(fā)性上皮性卵巢癌患者各病理參數(shù)的相關(guān)性，記錄所有患者在隨訪時(shí)間內(nèi)存活及死亡情況，采用多元Logistic回歸分析影響原發(fā)性上皮卵巢癌患者預(yù)后生存的危險(xiǎn)因素；采用ROC曲線分析NGF、TrkA及c-Met對(duì)原發(fā)性上皮卵巢癌患者生存預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1.3 標(biāo)本采集及檢測(cè)方法 NGF、TrkA及c-Met：采用免疫組化法進(jìn)行檢測(cè)，NGF、TrkA單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)ABCAM公司，c-Met購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。免疫組化采用鏈霉素抗生物素蛋白一過(guò)氧化酶連接法(Streptavidin-perosidase，SP)法，SP試劑盒購(gòu)自北京中山生物科技有限公司。各步驟均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作[11]。染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)[12]：以細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為NGF、TrkA及c-Met陽(yáng)性染色細(xì)胞。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，按照陽(yáng)性細(xì)胞的染色數(shù)量和顯色強(qiáng)度分級(jí)評(píng)分，取其平均值。細(xì)胞染色數(shù)量的評(píng)分按照陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)占同類細(xì)胞的百分比，計(jì)算該病例的細(xì)胞陽(yáng)性率。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%計(jì)0分；6%～25%計(jì)1分；26%～50%計(jì)2分；51%～75%計(jì)3分；>76%計(jì)4分。根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度加以評(píng)分，無(wú)著色計(jì)0分，淺黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分。染色強(qiáng)度和陽(yáng)性范圍得分相加，≥2分為陽(yáng)性，其余為陰性。

1.4 隨訪方法 本研究隨訪從患者治療開始，直至本研究結(jié)束，為期2年，截止于2020年6月；平均隨訪時(shí)間為(15.71±5.93)個(gè)月。對(duì)患者隨訪的方式主要采用電話隨訪、微信隨訪及患者來(lái)院復(fù)查為主。

2 結(jié)果

2.1 兩組NGF、TrkA及c-Met的表達(dá)情況比較 癌組織組NGF、TrkA及c-Met陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于正常組織組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1、圖1。

圖1 NGF、TrkA及c-Met在原發(fā)性上皮卵巢癌的表達(dá)(500×)Figure 1 Expression of NGF，TrkA and c-Met in primary epithelial ovarian cancer注：A. NGF在原發(fā)性上皮卵巢癌組織表達(dá)；B. NGF在正常卵巢癌組織表達(dá)；C. TrkA在原發(fā)性上皮卵巢癌組織表達(dá)；D. TrkA在正常卵巢癌組織表達(dá)；E. c-Met在原發(fā)性上皮卵巢癌組織表達(dá)；F. c-Met在正常卵巢癌組織表達(dá)

2.2 NGF、TrkA及c-Met在原發(fā)性上皮卵巢癌患者的表達(dá)與臨床病理特征 原發(fā)性上皮卵巢癌患者NGF、TrkA及c-Met表達(dá)與年齡、組織分化類型、腹腔積液無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、分化程度有相關(guān)性(P<0.05)。見表2。

表2 NGF、TrkA及c-Met在原發(fā)性上皮卵巢癌患者的表達(dá)與臨床病理特征[n，n(×10-2)]Table 2 Expression of NGF，TrkA and c-Met in patients with primary epithelial ovarian cancer and their relationship with clinicopathological features

2.3 原發(fā)性上皮卵巢癌患者預(yù)后情況 經(jīng)兩年隨訪后顯示，患者兩年生存率為35.65%(41/115)。NGF表達(dá)陰性及表達(dá)陽(yáng)性中位生存時(shí)間分別為(32.75±1.82)個(gè)月、(20.35±1.01)個(gè)月；TrkA表達(dá)陰性及表達(dá)陽(yáng)性中位生存時(shí)間分別為(30.09±1.08)個(gè)月、(21.46±2.15)個(gè)月；c-Met表達(dá)陰性及表達(dá)陽(yáng)性中位生存時(shí)間分別為(32.27±2.08)個(gè)月、(18.93±1.04)個(gè)月。生存分析顯示NGF、TrkA及c-Met表達(dá)陰性者生存期較長(zhǎng)(P<0.05)。見圖2～4。

圖2 NGF表達(dá)與原發(fā)性上皮卵巢癌患者生存時(shí)間曲線圖Figure 2 NGF expression and survival time curve of patients with primary epithelial ovarian cancer

圖3 TrkA表達(dá)與原發(fā)性上皮卵巢癌患者生存時(shí)間曲線圖Figure 3 The relationship between TrkA expression and survival time of patients with primary epithelial ovarian cancer

圖4 c-Met表達(dá)與原發(fā)性上皮卵巢癌患者生存時(shí)間曲線圖Figure 4 4 c-met expression and survival time curve of patients with primary epithelial ovarian cancer

2.4 影響原發(fā)性上皮卵巢癌患者預(yù)后生存的單因素和多因素分析 分化程度、臨床分期、淋巴轉(zhuǎn)移、NGF、TrkA及c-Met陽(yáng)性是影響原發(fā)性上皮卵巢癌患者預(yù)后生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見表3。

表3 影響原發(fā)性上皮卵巢癌患者預(yù)后生存的單因素和多因素分析Table 3 Univariate and multivariate analysis of prognostic factors in patients with primary epithelial ovarian cancer

2.5 NGF、TrkA及c-Met對(duì)原發(fā)性上皮卵巢癌患者預(yù)后生存的預(yù)測(cè)價(jià)值 采用ROC曲線分析 NGF、TrkA、c-Met及三者聯(lián)合對(duì)原發(fā)性上皮卵巢癌患者預(yù)后生存的預(yù)測(cè)價(jià)值，NGF、TrkA、c-Met及三者聯(lián)合曲線下面積分別為0.780、0.851、0.808、0.946，各指標(biāo)曲線下面積以聯(lián)合檢測(cè)最大，故聯(lián)合檢測(cè)的預(yù)測(cè)價(jià)值最佳，見表4、圖5。

表4 NGF、TrkA及c-Met對(duì)原發(fā)性上皮卵巢癌患者預(yù)后生存的預(yù)測(cè)價(jià)值Table 4 Prognostic value of NGF，TrkA and c-Met in patients with primary epithelial ovarian cancer

圖5 NGF、TrkA及c-Met對(duì)原發(fā)性上皮卵巢癌患者預(yù)后生存的預(yù)測(cè)價(jià)值Figure 5 Prognostic value of NGF，TrkA and c-Met in patients with primary epithelial ovarian cancer

3 討論

近年來(lái)，由于原發(fā)性上皮卵巢癌早期缺乏特異性癥狀，臨床病死率較高，患者生存預(yù)后總體較差，因此，如何提高早期原發(fā)性上皮卵巢癌篩查準(zhǔn)確率越來(lái)越受重視[13-14]。

c-Met位于染色體7q21-31，由α及β鏈構(gòu)成異二聚體，與HGF特異性結(jié)合誘導(dǎo)c-Met蛋白構(gòu)想改變，催化底物蛋白，將信號(hào)向細(xì)胞核內(nèi)傳導(dǎo)，參與細(xì)胞新型轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)控細(xì)胞骨架，使細(xì)胞黏附作用減弱，誘導(dǎo)新生血管生成，增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)、金屬蛋白酶表達(dá)水平，刺激惡性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移[15-16]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，c-Met可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞基因型，使高表達(dá)水平腫瘤細(xì)胞與HGF結(jié)合，使腫瘤細(xì)胞敏感性及侵襲性增加[17-18]。目前，已有研究證實(shí)c-Met的過(guò)表達(dá)和基因擴(kuò)增與肝癌、非小細(xì)胞癌、乳腺癌、食管癌等惡性腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[19-20]。相關(guān)學(xué)者采用定量PCR和免疫組織方法檢測(cè)結(jié)腸癌組織及正常結(jié)腸組織c-Met表達(dá)的研究顯示，c-Met在腸癌中的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常結(jié)腸粘膜[21]。本研究結(jié)果顯示，在原發(fā)性上皮卵巢癌中c-Met陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于正常組織，且隨著臨床分期增高、組織分化程度的增加及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，c-Met陽(yáng)性的高表達(dá)率也顯著上升，與既往研究一致。考慮c-Met參與信號(hào)通路，可激活酪氨酸激酶，級(jí)聯(lián)激活 P13K/Akt、Wnt/β-catenin以及MAPK信號(hào)多條信號(hào)通路，調(diào)節(jié)卵巢癌組織細(xì)胞的增殖、分化和侵襲[22-23]。

NGF是神經(jīng)生長(zhǎng)因子家族一員，通過(guò)與靶細(xì)胞表面的神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體特異性結(jié)合介導(dǎo)發(fā)生生物學(xué)效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，NGF不僅是神經(jīng)及非神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖等所需中重要物質(zhì)；還可以通過(guò)旁分泌、自分泌作用促進(jìn)肝細(xì)胞瘤、乳腺癌、前列腺癌、胃癌等多種腫瘤細(xì)胞增殖、血管新生及浸潤(rùn)[24-26]。此外，相關(guān)國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，NGF可調(diào)節(jié)垂體卵泡刺激素的分泌及卵巢上皮表面FSH受體水平變化[27]。TrkA作為NGF受體之一，具有內(nèi)在酪氨酸激酶活性，是NGF的功能性受體。研究表示，TrkA與NGF高親和力結(jié)合，使解離速度變慢，促使TrkA結(jié)構(gòu)發(fā)生磷酸化，激活相應(yīng)生物學(xué)作用[28]。目前，相關(guān)眾多研究表明TrkA在非神經(jīng)來(lái)源的腫瘤發(fā)生過(guò)程中具有重要作用。Raychaudhuri等[29]在Hodgkin淋巴瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，TrkA表達(dá)水平明顯高于正常細(xì)胞，且使用酪氨酸阻滯劑處理后，可減少腫瘤細(xì)胞的存活率. 預(yù)示TrkA在將來(lái)可能是一種新型的腫瘤治療方法。此外，也有研究提出TrkA活化在晚期漿液性卵巢腫瘤中常見，TrkA的表達(dá)水平與晚期漿液性卵巢腫瘤細(xì)胞呈正相關(guān)。類似的，相關(guān)研究予以應(yīng)用阻斷TrkA作用的酪氨酸寂寞受體阻斷劑隔絕TrkA作用后發(fā)現(xiàn)，其對(duì)腫瘤細(xì)胞的生成可明顯減少，且可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，考慮TrkA在分子靶向治療中具有廣闊應(yīng)用前景[30-31]。而本研究顯示，NGF、TrkA陽(yáng)性與原發(fā)性上皮卵巢癌患者預(yù)后生存密切相關(guān)，說(shuō)明NGF、TrkA表達(dá)水平對(duì)臨床治療及預(yù)后預(yù)測(cè)具有重要指導(dǎo)意義。此外，本研究為深入了解NGF、TrkA及c-Met與原發(fā)性上皮卵巢癌患者預(yù)后生存的預(yù)測(cè)價(jià)值，采用ROC曲線研究顯示，NGF、TrkA及c-Met水平聯(lián)合對(duì)原發(fā)性上皮卵巢癌患者預(yù)后生存預(yù)測(cè)價(jià)值最佳，說(shuō)明檢測(cè)NGF、TrkA及c-Met水平可作為預(yù)測(cè)患者預(yù)后的有效手段。

4 結(jié)論

綜上所述，NGF、TrkA及c-Met與原發(fā)性上皮卵巢癌患者病情評(píng)估、預(yù)后預(yù)測(cè)密切相關(guān)，臨床監(jiān)測(cè)其水平對(duì)患者診斷治療及預(yù)后預(yù)測(cè)具有重要作用，臨床可根據(jù)該水平變化制定個(gè)體化治療方案，以延長(zhǎng)患者的生存期。本研究為單中心、回顧性研究，臨床資料收集不全，使得研究受到一定的限制，后期將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量或多中心合作研究予以進(jìn)一步證實(shí)。