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    circ0000781通過(guò)吸附miR-21-5p調(diào)控BTG2表達(dá)抑制骨肉瘤增殖和侵襲的機(jī)制*

    2022-05-23 02:08:02徐斌付玲鈺張波吳輝張旭乾
    西部醫(yī)學(xué) 2022年5期
    關(guān)鍵詞:明顯降低證實(shí)熒光素酶

    徐斌 付玲鈺 張波 吳輝 張旭乾

    (南充市中心醫(yī)院·川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院 1.骨科;2.健康管理中心;3.病理科,四川 南充 637000)

    骨肉瘤是兒童和青少年最常見(jiàn)的惡性骨腫瘤之一,每年全球新發(fā)病例約為400萬(wàn)[1-4]。骨肉瘤早期診斷較困難,目前新輔助化療聯(lián)合腫瘤切除術(shù)是骨肉瘤的主要治療方法,但預(yù)后較差[5-7]。盡管骨肉瘤的治療手段不斷更新,但是轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的骨肉瘤患者死亡率仍然很高,總生存率低于20%[8-10]。骨肉瘤患者預(yù)后差的原因是其發(fā)病機(jī)制尚不清楚且存在爭(zhēng)議,因此進(jìn)一步研究骨肉瘤增殖和轉(zhuǎn)移的機(jī)制,尋找新的腫瘤標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)就顯得非常重要。BTG2是BTG/TOB家族中的關(guān)鍵基因,與包括腫瘤在內(nèi)的多種生物學(xué)現(xiàn)象有關(guān)[11]。既往研究發(fā)現(xiàn)BTG2在多種腫瘤組織中低表達(dá)[12-14],也有研究證實(shí)BTG2在骨肉瘤組織中的表達(dá)水平明顯降低[15],提示BTG2可能作為抑癌基因發(fā)揮作用,然而B(niǎo)TG2對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響及其上游調(diào)控機(jī)制尚不明確。本研究深入探討了BTG2在骨肉瘤發(fā)病中的作用及其上游調(diào)控機(jī)制,以期為骨肉瘤的早期診斷和治療提供新的生物標(biāo)志物和作用靶點(diǎn)。

    1 材料與方法

    1.1 材料 人骨肉瘤細(xì)胞株,正常人成骨細(xì)胞hFOB1.19細(xì)胞株和3種人骨肉瘤細(xì)胞株(HOS、MG63和Saos-2)購(gòu)自美國(guó)種質(zhì)保藏中心。用含有10%胎牛血清的DMEM-F12(Gibco,Carlsbad,USA)培養(yǎng)hFOB1.19細(xì)胞。三種骨肉瘤細(xì)胞在含有100 U/mL青霉素,100 mg/mL鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM(Gibco)中培養(yǎng),培養(yǎng)箱內(nèi)溫度為37℃,并含有5% CO2。

    1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miR-21-5p mimic、miR-21-5p inhibitor及BTG2 siRNA(5′-GCUCCAUCUGCGUCUUGUA-3′)購(gòu)自RiboBio公司 (Guangzhou,China),circ0000781過(guò)表達(dá)載體PcDNA3.1- circ0000781質(zhì)粒和BTG2過(guò)表達(dá)載體PcDNA3.1- BTG2質(zhì)粒購(gòu)自GeneChem公司 (Shanghai,China)。根據(jù)制造商的說(shuō)明,使用Lipofectamine 2000試劑(Life Technologies,Carlsbad,USA)進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.3 qRT-PCR 根據(jù)制造商說(shuō)明書(shū)使用TRIzol(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)從細(xì)胞中提取總RNA,再應(yīng)用Primescript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara,Otsu,Shiga,Japan)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后用PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix(Applied Biosystems,美國(guó))對(duì)cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。BTG2引物序列如下:5′-GCGTGAGCGAGCAGAGGCTT-3′(forward),5′-GGCTGGCCACCCTGCTGATG-3′(reverse)。miR-21-5p引物序列如下:5′-CTTACTTCTCTGTGTGATTTCTGTG-3′(forward),5′-ACAACCTTTCCAAAATCCATGAGGC-3′(reverse)。采用2-△△Ct法記錄mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

    1.4 CCK-8 CCK-8用于檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。將處理過(guò)的細(xì)胞用胰蛋白酶消化后接種到96孔板(每孔約2000個(gè)細(xì)胞),每組5個(gè)重復(fù)。用CCK8分析不同時(shí)間點(diǎn)(接種后24、48和72 h)的細(xì)胞增殖活性。

    1.5 Transwell 按照制造商的說(shuō)明(BD Biosciences,Bedford,MA,USA),將預(yù)涂有Matrigel的Transwell小室用于細(xì)胞侵襲分析。1×105處理過(guò)的OS細(xì)胞添加到上室,600 ul培養(yǎng)基添加到下室,細(xì)胞培養(yǎng)24 h。在倒置光學(xué)顯微鏡下(Zeiss,Primovert)隨機(jī)取三個(gè)視野計(jì)算侵襲細(xì)胞數(shù)。

    1.6 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)使用 通過(guò)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)Targetscan(http://www. targetscan. org/vert_71/)篩選可與BTG2靶向結(jié)合的miRNA,再通過(guò)Circular RNA Interactome(https://circinteractome. nia. nih. gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)可與miR-21-5p靶向結(jié)合的circRNA。

    1.7 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 設(shè)計(jì)含有circ0000781野生型序列和突變型序列及BTG2野生型序列和突變型序列的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(Shanghai GeneChem Co)。將骨肉瘤細(xì)胞與報(bào)告質(zhì)粒和miR-21-5p mimic或陰性對(duì)照模擬物(NC)共轉(zhuǎn)染并培養(yǎng)24 h,然后用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)(Promega)測(cè)定熒光素酶活性。

    2 結(jié)果

    2.1 BTG2在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá) PCR結(jié)果顯示,與正常人成骨細(xì)胞hFOB1.19細(xì)胞株(0.99±0.07)相比,骨肉瘤HOS(0.65±0.05)、MG63(0.42±0.04)和Saos-2(0.71±0.06)細(xì)胞中BTG2表達(dá)水平明顯降低,在MG63細(xì)胞中的表達(dá)水平最低,故選擇MG63細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),見(jiàn)圖1。

    圖1 BTG2在細(xì)胞株中表達(dá)水平Figure 1 BTG2 expression level in cell lines

    2.2 BTG2對(duì)細(xì)胞增殖的影響 通過(guò)PcDNA3.1- BTG2質(zhì)粒在MG63細(xì)胞中過(guò)表達(dá)BTG2,與空載組和空白對(duì)照組相比,BTG2過(guò)表達(dá)組細(xì)胞增殖能力明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表1。

    表1 過(guò)表達(dá)BTG2對(duì)細(xì)胞增殖的影響Table 1 Effects of overexpression of BTG2 on cell proliferation

    2.3 BTG2對(duì)細(xì)胞侵襲的影響 通過(guò)Transwell法發(fā)現(xiàn),與空載組(92.67±5.15)和空白對(duì)照組(94.33±4.04)相比,BTG2過(guò)表達(dá)組細(xì)胞侵襲能力明顯降低(36.33±2.52),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖2。

    圖2 BTG2對(duì)細(xì)胞侵襲的影響Figure 2 Effect of BTG2 on invasion

    2.4 BTG2可與miR-21-5p靶向結(jié)合 通過(guò)Targetscan發(fā)現(xiàn)miR-21-5p含有BTG2的結(jié)合位點(diǎn),進(jìn)一步通過(guò)熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)BTG2可與miR-21-5p靶向結(jié)合,見(jiàn)圖3、圖4。

    圖3 miR-21-5p與BTG2結(jié)合位點(diǎn)Figure 3 Binding site of miR-21-5p and BTG2

    圖4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果Figure 4 Luciferase reporter gene assay

    2.5 miR-21-5p負(fù)調(diào)控BTG2 在MG63細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-21-5p mimic過(guò)表達(dá)miR-21-5p,發(fā)現(xiàn)與陰性對(duì)照組(miR-21-5p mimic NC)和空白對(duì)照組(Blank)相比(分別為1.00±0.08,0.97±0.06)相比,miR-21-5p過(guò)表達(dá)組中BTG2表達(dá)水平明顯降低(0.59±0.04),說(shuō)明miR-21-5p負(fù)調(diào)控BTG2的表達(dá),見(jiàn)圖5。

    圖5 miR-21-5p負(fù)調(diào)控BTG2表達(dá)Figure 5 miR-21-5p negatively regulates BTG2 expression

    2.6 miR-21-5p通過(guò)負(fù)調(diào)控BTG2促進(jìn)細(xì)胞增殖 為證實(shí)miR-21-5p通過(guò)負(fù)調(diào)控BTG2促進(jìn)細(xì)胞增殖,本研究設(shè)立對(duì)照組,miR-21-5p mimic,miR-21-5p mimic NC及miR-21-5p mimic+ BTG2過(guò)表達(dá)組,檢測(cè)細(xì)胞增殖能力,結(jié)果顯示與對(duì)照組和miR-21-5p mimic NC組相比,miR-21-5p mimic組細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng),但是與miR-21-5p mimic組相比,miR-21-5p mimic+BTG2過(guò)表達(dá)組細(xì)胞增殖能力則有所降低,說(shuō)明BTG2可逆轉(zhuǎn)miR-21-5p對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用,見(jiàn)表2。

    表2 miR-21-5p通過(guò)負(fù)調(diào)控BTG2促進(jìn)細(xì)胞增殖Table 2 miR-21-5p promoted cell proliferation by negatively regulate BTG2

    2.7 miR-21-5p通過(guò)負(fù)調(diào)控BTG2促進(jìn)細(xì)胞侵襲 為證實(shí)miR-21-5p通過(guò)負(fù)調(diào)控BTG2促進(jìn)細(xì)胞侵襲,本研究設(shè)立對(duì)照組,miR-21-5p mimic,miR-21-5p mimic NC及miR-21-5p mimic+ BTG2過(guò)表達(dá)組,檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力,結(jié)果顯示與對(duì)照組(39.00±2.00)和miR-21-5p mimic NC組(37.67±4.51)相比,miR-21-5p mimic組(84.00±3.00)細(xì)胞侵襲能力明顯增強(qiáng),但是與miR-21-5p mimic組相比,miR-21-5pmimic+ BTG2過(guò)表達(dá)組(64.67±4.04)細(xì)胞侵襲能力則有所降低,說(shuō)明miR-21-5p對(duì)細(xì)胞侵襲的促進(jìn)作用可被BTG2逆轉(zhuǎn),見(jiàn)圖6。

    圖6 miR-21-5p通過(guò)負(fù)調(diào)控BTG2促進(jìn)細(xì)胞侵襲Figure 6 miR-21-5p promoted cell invasion by negatively regulate BTG2

    2.8 circ0000781可與miR-21-5p靶向結(jié)合 通過(guò)Circular RNA Interactome發(fā)現(xiàn),circ0000781含有miR-21-5p結(jié)合位點(diǎn),進(jìn)一步通過(guò)通過(guò)熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)circ0000781可與miR-21-5p靶向結(jié)合,見(jiàn)圖7、圖8。

    圖7 circ0000781與miR-21-5p可能結(jié)合位點(diǎn)Figure 7 Binding site of circ0000781 and miR-21-5p

    圖8 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果Figure 8 Luciferase reporter gene assay

    2.9 circ0000781負(fù)調(diào)控miR-21-5p表達(dá) 通過(guò)PcDNA3.1-circ0000781質(zhì)粒在MG63細(xì)胞中過(guò)表達(dá)circ0000781,發(fā)現(xiàn)與空載組(Vector)和空白對(duì)照組(Blank)相比(分別為1.03±0.04,0.97±0.06),circ0000781過(guò)表達(dá)組miR-21-5p表達(dá)水平明顯降低(0.60±0.07),證實(shí)circ0000781可下調(diào)miR-21-5p表達(dá),見(jiàn)圖9。

    圖9 circ0000781負(fù)調(diào)控miR-21-5p表達(dá)Figure 9 circ0000781 negatively regulates miR-21-5p expression

    2.10 circ0000781通過(guò)負(fù)調(diào)控miR-21-5p上調(diào)BTG2表達(dá) 本研究設(shè)立對(duì)照組,circ0000781過(guò)表達(dá)組,PcDNA3.1-circ0000781 NC(空載組)組及circ0000781過(guò)表達(dá)+miR-21-5p mimic組,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組(0.70±0.07)和空載組(0.72±0.06)相比,circ0000781過(guò)表達(dá)組中BTG2表達(dá)水平明顯增高(0.90±0.06),但是與circ0000781過(guò)表達(dá)組相比,circ0000781過(guò)表達(dá)+miR-21-5p mimic組中BTG2表達(dá)水平則有所降低(0.79±0.04),說(shuō)明miR-21-5p可逆轉(zhuǎn)circ0000781對(duì)BTG2表達(dá)的促進(jìn)作用,見(jiàn)圖10。

    圖10 circ0000781通過(guò)負(fù)調(diào)控miR-21-5p上調(diào)BTG2表達(dá)Figure10 circ0000781 upregulated BTG2 expression by negatively regulate miR-21-5p

    3 討論

    BTO/TOB家族是20世紀(jì)90年代發(fā)現(xiàn)的一個(gè)抗增殖蛋白家族。既往研究發(fā)現(xiàn)BTG2在多種組織中均有表達(dá),參與細(xì)胞分化、增殖、DNA損傷修復(fù)及細(xì)胞凋亡等多種生物活性。研究表明BTG2可使細(xì)胞周期阻滯在G0和G1期從而抑制細(xì)胞增殖,也有研究發(fā)現(xiàn)BTG2可通過(guò)調(diào)控p38和MAPK信號(hào)通路下調(diào)口腔鱗癌細(xì)胞增殖活性[16-17]。Gu等[15,18]的研究證實(shí)BTG2在骨肉瘤組織中低表達(dá),并且BTG2可通過(guò)PI3K-AKT信號(hào)通路抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。本研究也發(fā)現(xiàn)BTG2在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平相比于正常人成骨細(xì)胞明顯降低,并且過(guò)表達(dá)BTG2可明顯抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力,證實(shí)BTG2在骨肉瘤中扮演著抑癌基因的角色,與既往結(jié)果相符,表明BTG2是一個(gè)極具前景的骨肉瘤治療新靶點(diǎn)。

    雖然本研究表明BTG2在骨肉瘤中作為抑癌基因發(fā)揮作用,然而調(diào)控其表達(dá)的上游機(jī)制尚不明確。miRNA是一類(lèi)單鏈非編碼小RNA(18-25nt),它們廣泛存在于真核生物中并可與靶基因的3-UTR結(jié)合,通過(guò)mRNA降解或翻譯抑制負(fù)調(diào)控基因表達(dá)[19]。通過(guò)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)Targetscan我們發(fā)現(xiàn)BTG2 mRNA的3-UTR中含有miR-21-5p的結(jié)合位點(diǎn),進(jìn)一步雙熒光素酶報(bào)告基因法證實(shí)BTG2可與miR-21-5p靶向結(jié)合。miR-21-5p對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的調(diào)控作用已得到廣泛的證實(shí)。如miR-21-5p通過(guò)靶向SMAD7促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌增殖、遷移和侵襲,并且miR-21-5p在復(fù)發(fā)性胃癌中高表達(dá),可作為胃癌的潛在預(yù)后因子[20-21]。除此之外Zhang等[22]的研究發(fā)現(xiàn)miR-21-5p在骨肉瘤組織中高表達(dá),然而miR-21-5p在骨肉瘤中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)miR-21-5p可負(fù)調(diào)控BTG2的表達(dá),miR-21-5p還可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖和侵襲,然而miR-21-5p對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖和侵襲的促進(jìn)作用可被BTG2逆轉(zhuǎn),證實(shí)miR-21-5p作為癌基因通過(guò)抑制抑癌基因BTG2的表達(dá)促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖和侵襲。

    進(jìn)一步我們探討了miR-21-5p的上游調(diào)控基因。基于環(huán)狀 RNA(circularRNAs,circRNAs)在腫瘤中的重要作用及其與microRNA的密切關(guān)系,我們將目光轉(zhuǎn)向circRNAs。circRNA是一類(lèi)雙鏈閉合 RNA,其 3′和 5′末端連接形成共價(jià)閉合的環(huán)狀結(jié)構(gòu),大部分屬于非編碼RNA[23]。研究表明,circRNA 在腫瘤中可以作為“海綿”來(lái)阻斷及競(jìng)爭(zhēng)性抑制 miRNA 來(lái)發(fā)揮作用,因此circRNA可以作為內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng) RNA 參與腫瘤的發(fā)病[24]。鑒于circRNA 在腫瘤發(fā)生中的重要作用,我們通過(guò)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)Circular RNA Interactome篩選可與miR-21-5p靶向結(jié)合的circRNA,發(fā)現(xiàn)circ0000781含有miR-21-5p結(jié)合位點(diǎn),接下來(lái)的熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)circ0000781可與miR-21-5p靶向結(jié)合,并且circ0000781可負(fù)調(diào)控miR-21-5p表達(dá)。本研究還發(fā)現(xiàn)circ0000781可上調(diào)BTG2的表達(dá),但是過(guò)表達(dá)miR-21-5p后BTG2的表達(dá)水平則明顯降低,說(shuō)明miR-21-5p可逆轉(zhuǎn)circ0000781對(duì)BTG2表達(dá)的促進(jìn)作用。

    4 結(jié)論

    本研究結(jié)果顯示,BTG2在骨肉瘤細(xì)胞中低表達(dá)并可抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和侵襲。進(jìn)一步在探尋BTG2上游調(diào)控機(jī)制的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)circ0000781可作為海綿競(jìng)爭(zhēng)性抑制miR-21-5p的表達(dá),最終通過(guò)上調(diào)BTG2的表達(dá)降低骨肉瘤細(xì)胞的增殖活性和侵襲能力。這表明circ0000781/miR-21-5p/BTG2信號(hào)軸可作為骨肉瘤治療的潛在作用靶點(diǎn)。

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