埃洛石納米管負(fù)載香芹酚及其性能的研究

梅 軍，王江麗，白 越，陳 龍，李富明，鄭華明

（武漢工程大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，武漢 430205）

0 引言

近年來，活性包裝系統(tǒng)因其能夠有效防止微生物對(duì)新鮮食品的破壞，極大地延長(zhǎng)食品的貨架壽命，而成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)［1-3］。目前在食品工業(yè)中常見的抗菌包裝技術(shù)是將非揮發(fā)性的抗菌劑如：納米Ag、多肽、TiO2、季銨鹽等加入到包裝材料中［4-7］，或者直接在食品中添加D-異抗壞血酸鈉、山梨酸鉀等，以此達(dá)到抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)或消滅細(xì)菌的目的［8-10］。此過程中只有當(dāng)抗菌劑從包裝材料的芯層遷移至表面，并且與食品充分接觸時(shí)才能起到一定的抗菌效果。對(duì)于一些具有揮發(fā)性的抗菌劑，可以在容器的頂空彌漫在食品的周圍，并與微生物充分接觸，起到更加高效的殺菌效果［11］。植物精油因其具有超強(qiáng)的抗菌性、抗氧化性、安全性和揮發(fā)性，已在食品工業(yè)中得到越來越多的應(yīng)用［12-13］。

植物精油的水溶性比較差，將其通過乳化的方式均勻地分散在水相中，可制備成抗菌乳液或者抗菌納米乳。ROBLEDO等［14］首先制備了油包水型的百里香酚納米乳，當(dāng)百里香酚含量為110 ppm時(shí)，乳液對(duì)葡萄孢菌有很好的抑制效果。CRISTINA［15］等將植物精油直接加入到熱塑性木薯淀粉/殼聚糖混合物中，以熱壓成型的方式成膜，研究發(fā)現(xiàn)在熱處理過程中精油因受熱流失，所制備薄膜的抗菌效果非常有限。LAURA等［16］把香檸檬油、葡萄柚和香芹酚（CA）混合精油（質(zhì)量比3：1：1）包封在β-環(huán)糊精里，再混入到碎冰中，發(fā)現(xiàn)50（mg混合精油/kg碎冰）對(duì)海鯉魚起到很好的保鮮作用，2 ℃的冷鏈貯存條件下，其保質(zhì)期由以前的13 d延長(zhǎng)到17 d。由此可見，CA被廣泛用作抗菌劑用于食品保鮮中，但關(guān)于CA在制備薄膜過程中熱穩(wěn)定性的相關(guān)研究較少。

埃洛石納米管（HNTs）是一種天然硅鋁酸鹽粘土礦物質(zhì)，具有獨(dú)特的中空管狀結(jié)構(gòu)，非常適合作為納米容器，負(fù)載藥物、抗菌劑等以達(dá)到藥物傳遞和控制釋放等目的［17-18］。本文以CA為抗菌劑，采用便捷、高效的循環(huán)負(fù)壓法［19］制備香芹酚-埃洛石納米管包合物（CA-HNTs），分別通過FTIR、TEM、TG、UV光譜儀和DSC系統(tǒng)分析包合物的成份、微觀結(jié)構(gòu)、載藥率及熱穩(wěn)定性，并對(duì)其在不同溫度下的儲(chǔ)存穩(wěn)定性及抗菌性進(jìn)行研究。

1 試驗(yàn)部分

1.1 材料與設(shè)備

埃洛石納米管（純度90%，湖北省丹江口）；香芹酚（純度99%，上海麥克林生化科技有限公司）；蛋白質(zhì)含量為95%（w/w）的玉米醇溶蛋白（北京索萊寶科技有限公司）；大腸桿菌ATCC25922菌株，金黃色葡萄球菌ATCC25923菌株（江西省人民醫(yī)院）；Lambda35型紫外分光光度計(jì)（Perkin Elmer）；Nicolet 6700型傅里葉紅外光譜（Thermo Fisher）；DSC-60型差示掃描熱量?jī)x（日本島津）；STA 409 PC型綜合熱分析儀（NETZSCH）；JEM-2100型透射電鏡（日本電子株式會(huì)社）；ZWY-2102C型恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）。

1.2 埃洛石納米管的提純和酸化處理

HNTs的提純：參照文獻(xiàn)［20］的方法，將HNTs緩慢加入到去離子水中配制成10%（w/w）懸浮液，再加入0.05 %（w/w）六偏磷酸鈉，60 ℃加熱攪拌30 min，4 000 rad/min離心作用10 min，分離得到HNTs，再用去離子水洗滌3次，80 ℃干燥5 h后，研磨過篩備用。

HNTs的酸化處理：參照文獻(xiàn)［21］的方法，將2.0 g提純后的HNTs分散到100 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%（w/w）的硫酸溶液中，70 ℃下攪拌32 h。反應(yīng)結(jié)束后8000 rad/min離心作用10 min，收集沉淀并用去離子水洗滌至中性，50 ℃真空干燥12 h，研缽后過80目篩保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 香芹酚-埃洛石納米管包合物的制備

采用負(fù)壓法負(fù)載CA［22］：將HNTs按照0.1 g/mL比例與CA混合，冰浴環(huán)境下160 W功率超聲處理20 min后，置于真空干燥箱中，在0.1 MPa的真空條件下保壓30 min，然后打開真空閥門，使CA進(jìn)入到HNTs管腔內(nèi)。整個(gè)負(fù)載過程重復(fù)3次，負(fù)載結(jié)束后，6 000 rad/min離心作用10 min，并用無水乙醇洗滌掉HNTs表面的CA，再將負(fù)載CA的HNTs粒子在室溫下風(fēng)干15 h。

1.4 香芹酚標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

用無水乙醇配制1.0 mg/mL的CA溶液，再分別稀釋至 0.01，0.02，0.03，0.04，0.05 mg/mL。用紫外分光光度計(jì)測(cè)量276 nm處的吸光度值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 香芹酚-埃洛石納米管包合物的表征

1.5.1 香芹酚-埃洛石納米管包合物載藥率的測(cè)定

采用超聲破碎法測(cè)定CA-HNTs的載藥率［23］：稱取0.1 g CA-HNTs，用10 mL無水乙醇室溫浸泡30 min；設(shè)置超聲破碎儀功率為90 W，破碎30 min；5 000 rad/min離心作用10 min。取一定量上清液定容至25 mL，測(cè)定276 nm處的吸光度，根據(jù)CA標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算包合物中的CA含量。載藥率計(jì)算公式：

式中 m1——包合物中CA質(zhì)量，g；

m2——包合物總質(zhì)量，g。

1.5.2 香芹酚-埃洛石納米管包合物的FTIR分析

采用溴化鉀壓片法測(cè)定樣品的紅外光譜。將風(fēng)干的包合物與溴化鉀以1：100比例進(jìn)行混合，然后用瑪瑙研缽研成均勻粉末。掃描條件設(shè)置為光譜范圍4 000～400 cm-1，掃描次數(shù)64次，分辨率為4 cm-1。用溴化鉀壓片作為空白對(duì)照。每個(gè)樣品的光譜采集在相同條件下重復(fù)3次。

1.5.3 香芹酚-埃洛石納米管包合物的TEM分析

取0.1 g包合物加入到10 mL去離子水中，超聲處理20 min后靜置，取上清液滴到銅網(wǎng)上，在紅外燈下干燥，測(cè)試電壓為300 kV。

1.5.4 香芹酚-埃洛石納米管包合物的TG分析

利用TG分析研究CA的載藥量，稱取3～5 mg樣品于氧化鋁坩堝中，在氮?dú)夥諊?，設(shè)定溫度區(qū)間為30～800 ℃，升溫速度為20 ℃/min。

1.5.5 香芹酚-埃洛石納米管包合物的DSC分析

利用DSC分析研究CA-HNTs的熱穩(wěn)定性。稱取5 mg左右的樣品放置在鋁制樣品盒中密封，鋁盒中央扎孔，以密封空鋁盤作為空白對(duì)照。升溫速率為10 ℃/min，氮?dú)獾牧鲃?dòng)速度為20 mL/min。HNTs和CA-HNTs的溫度范圍為25～450 ℃，CA的溫度范圍為25～150 ℃。

1.5.6 香芹酚-埃洛石納米管包合物抗菌性能的研究

將2 g玉米醇溶蛋白加入到80%（v/v）的乙醇-水溶液中，常溫?cái)嚢? h，取一定量的CAHNTs加入到玉米醇溶蛋白溶液中，再加入0.8 g的油酸，0.02 g的戊二醛，40 ℃攪拌2 h后，真空脫泡，流延成膜。參照文獻(xiàn)［24］的方法，用平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)CA-HNTs包合物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果。首先，將接種后的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在液體培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)24 h，并將菌液稀釋至105～106 CFU/mL；然后，把經(jīng)過徹底滅菌后的6 mm的薄膜圓片放入稀釋好的菌液中，搖床培養(yǎng)24 h后，稀釋至合適的濃度，涂平板，計(jì)數(shù)菌落數(shù)并計(jì)算抑菌率。抗菌薄膜中CA-HNTs包合物的添加量分別為0%、2%、4%、6%、8%，以不加抗菌薄膜（純菌液）的樣品為空白對(duì)照。抑菌率計(jì)算公式：

式中 Y ——抑菌率；

A ——純菌液的菌落數(shù)；

B ——抗菌薄膜樣品的菌落數(shù)。

1.5.7 香芹酚-埃洛石納米管包合物在不同溫度條件下的緩釋性能

稱取3份質(zhì)量為1 g的CA-HNTs，分別置于50 mL離心管中。將離心管分別放在5，25，40 ℃控溫環(huán)境中，每12 h開蓋換氣1次，利用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)量第 0，5，10，15，20，25 d 包合物中CA的保留率。

2 結(jié)果與討論

2.1 香芹酚標(biāo)準(zhǔn)曲線

在276 nm處測(cè)一定濃度梯度的香芹酚-乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值，繪制CA標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 CA紫外標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 UV standard curve of CA

得香芹酚-乙醇溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=14.39x+0.006 1，R2=0.999 62。式中x為CA的濃度，y為CA在276 nm處的吸光度值。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得CA-HNTs中CA的載藥率為20%。

2.2 FTIR分析

圖2是CA、CA-HNTs和HNTs的紅外譜圖。可以看出，HNTs在高頻區(qū)3 694 cm-1處出現(xiàn)較強(qiáng)的分裂吸收峰，是HNTs的Al-OH基團(tuán)羥基伸縮振動(dòng)和鋁氧八面體與硅氧四面體之間的Si-OH基團(tuán)羥基伸縮振動(dòng)［25-26］，3 620 cm-1處是 HNTs的羥基的特征吸收峰。在3 448 cm-1處出現(xiàn)的寬峰是酸腐蝕HNTs產(chǎn)生的大量-Si-OH-彎曲振動(dòng)引起［27］。在中頻區(qū)，1 633 cm-1處是水分子的彎曲振動(dòng)峰［28］。在低頻區(qū)，1 093 cm-1和1 029 cm-1處的峰是-Si-O-鍵的伸縮振動(dòng)譜帶［29］。CA在高頻區(qū)3 383 cm-1處的寬峰和2 960 cm-1處的窄峰分別是-OH和C-H的伸縮振動(dòng)峰。在中頻區(qū)，1 620～1 420 cm-1處的連續(xù)窄峰為芳香環(huán)C-C的伸縮振動(dòng)，1 252 cm-1處為芳香環(huán)C-O伸縮振動(dòng)峰［30-34］。

圖2 CA、CA-HNTs和HNTs的紅外光譜圖Fig.2 FTIR spectra of CA，CA-HNTs and HNTs

HNTs負(fù)載CA后具有原始HNTs的特征峰，并且與原始HNTs相比，在1 456，2 961，1 420 cm-1處可以觀察到3個(gè)新峰，分別是C-H和C-C伸縮振動(dòng)。CA-HNTs在1 295～1 095 cm-1處沒有吸收峰，可能是CA在此區(qū)間吸收峰被HNTs所屏蔽，HNTs成功負(fù)載了CA。

2.3 TEM分析

圖3為CA、HNTs和CA-HNTs的透射電鏡圖。

圖 3 HNTs（a，b，c），酸處理后的 HNTs（d，e，f）和CA-HNTs（g，h，i）的 TEM 圖Fig.3 TEM images of HNTs（a，b，c），acid-treated HNTs（d，e，f） and CA-HNTs（g，h，i）

從圖3（a）可以看出HNTs為中空管狀結(jié)構(gòu)，尺寸大小比較均一。管長(zhǎng)1 000～1 500 nm，管外徑50～70 nm，其尺寸大小與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［21］。圖3（b）顯示納米管的管端為開口結(jié)構(gòu)，這為液體狀的CA能夠被負(fù)載進(jìn)納米管提供了可能性。從圖3（c）可以看出納米管的表面存在凹坑結(jié)構(gòu)。經(jīng)酸處理后的HNTs在尺寸上并未發(fā)生明顯的變化，從圖 3（e）和圖 3（f）可見，納米管的內(nèi)部沿軸心方向出現(xiàn)明顯的虛影，這可能是硫酸與HNTs內(nèi)部的鋁酸鹽產(chǎn)生了化學(xué)反應(yīng)，使其內(nèi)部孔道擴(kuò)大。另外，HNTs的表面出現(xiàn)了微微隆起，結(jié)構(gòu)變得更為蓬松，可見硫酸對(duì)HNTs外部的硅酸鹽也產(chǎn)生了部分侵蝕作用。如圖3（h）和圖3（i），經(jīng)負(fù)載CA后，HNTs內(nèi)部的虛影及表面的隆起結(jié)構(gòu)消失，CA在循環(huán)負(fù)壓的作用下已填滿HNTs內(nèi)部管道及表面的微孔。

2.4 TG分析

圖4表示的是HNTs、CA-HNTs和CA的TG曲線。從圖中可以看出HNTs主要失重溫度區(qū)間是400～600 ℃，主要是HNTs中羥基的脫水所產(chǎn)生的質(zhì)量損失［35］。然而，HNTs負(fù)載CA后，包合物表現(xiàn)出2個(gè)失重階段：第一階段失重溫度區(qū)間為100～211 ℃，主要是包合物中CA的揮發(fā)［36］；第二階段為HNTs結(jié)構(gòu)羥基的脫水，失重溫度范圍為400～600 ℃。結(jié)合圖3（c）可以看出，HNTs成功負(fù)載了CA，在211 ℃時(shí)包合物的質(zhì)量損失約為16%，這與紫外分光光度計(jì)所檢測(cè)的CA-HNTs中CA的載藥率為20%基本一致。

圖4 HNTs，CA-HNTs和CA的TG曲線Fig.4 TG curves of pure HNTs，CA-HNTs and CA

2.5 DSC分析

圖5分別是CA、HNTs和CA-HNTs的DSC曲線。從圖5（a）可以看出CA在110 ℃有較寬的吸熱峰，這對(duì)應(yīng)于CA的熱揮發(fā)過程［37］。從圖5（b）可以看出HNTs和CA-HNTs在80 ℃附近都有較小的吸熱峰，這可能是由于粒子表面少量吸附水的蒸發(fā)。CA-HNTs在172 ℃有明顯的吸熱峰，這可能是HNTs管腔內(nèi)CA的揮發(fā)及沸騰共同所致。CA在常壓下沸點(diǎn)為237 ℃，在負(fù)載CA的過程中，由于超聲和負(fù)壓的作用，使HNTs局部堵塞，管腔內(nèi)部存在一定的真空度，使CA的沸點(diǎn)降低。在280 ℃左右，包合物的曲線上出現(xiàn)了放熱峰，其原因可能是密閉的HNTs中的CA分解產(chǎn)生。由此可見HNTs的包覆，給CA提供熱保護(hù)屏障，提高了CA的熱穩(wěn)定性［38］。

圖5 CA、HNTs和CA-HNTs的DSC曲線Fig.5 DSC curves of CA，HNTs and CA-HNTs

2.6 香芹酚-埃洛石納米管包合物抗菌性能研究

圖6和圖7為含CA-HNTs的抗菌薄膜對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果。從左至右，分別為純大腸桿菌菌液以及膜中CA-HNTs添加量依次為0%，2%，4%，6%，8%。從圖中可以看出隨著薄膜中CA-HNTs添加量的增大，菌落數(shù)逐步減少，表明抗菌薄膜對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑菌效果；當(dāng)不添加CA-HNTs時(shí)，純薄膜對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌也有一定的抑菌效果，其抑菌率分別為14%和7%，這主要是因?yàn)橛衩状既艿鞍妆∧ぶ械慕宦?lián)劑戊二醛有一定的抗菌效果。當(dāng)包合物添加量從2%增加到8%時(shí)，抗菌薄膜對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用顯著提高。包合物添加量為8%時(shí)，對(duì)大腸桿菌的最大抑菌率為85%，對(duì)金黃色葡萄球菌最大抑菌率為59%，這主要是因?yàn)镃A對(duì)大腸桿菌抑菌效果強(qiáng)于金黃色葡萄球菌［39］。

圖6 抗菌薄膜對(duì)大腸桿菌的抑菌效果Fig.6 The antibacterial efficacy on Escherichia coli

圖7 抗菌薄膜對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果Fig.7 The antibacterial efficacy on Staphylococcus aureus

2.7 香芹酚-埃洛石納米管包合物在不同溫度中的釋放

CA作為一種小分子，在空氣中極易揮發(fā)，其活性成分易喪失。從圖8中可以看出，在較低的溫度條件下（≤25 ℃），隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，包合物中CA的保留率下降很少，25 d后的保留率約為80%。當(dāng)溫度升高到40 ℃，存儲(chǔ)25 d后，包合物中CA的保留率為66.2%，這主要是因?yàn)闇囟仍礁?，HNTs中CA氣體所產(chǎn)生的氣壓越大，CA的布朗運(yùn)動(dòng)加劇，對(duì)HNTs管壁的破壞增大，導(dǎo)致管壁產(chǎn)生微小裂縫，從而加速CA的逸出［40］。包合物中CA在剛開始的0～5 d內(nèi)釋放速率較快，可能是釋放初期存在突釋過程。存儲(chǔ)20 d后，CA釋放速率有所放緩。相較于純CA常溫下置于空氣中極易揮發(fā)的特點(diǎn)，通過HNTs將其包覆，可以明顯起到一定的緩釋作用。

圖8 CA-HNTs在不同溫度下的保留率Fig.8 Retention property of CA-HNTs at different temperatures

3 結(jié)語

通過循環(huán)負(fù)壓法，HNTs可以負(fù)載CA，其載藥率約為20%；當(dāng)CA-HNTs的添加量為8%（w/w）時(shí)，所制備的玉米醇溶蛋白薄膜具有良好的抗菌性能，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌最高抑菌率分別為85%和59%；升高溫度加快了CA從HNTs管腔內(nèi)逸出速度，常溫下儲(chǔ)存25 d后包合物中CA的保留率最大為85.3%。CA-HNTs具有一定緩釋抗菌效果，可應(yīng)用于活性包裝系統(tǒng)，提高食品的貨架期。