基于生物信息學(xué)分析CDH6基因在胃癌組織中的表達及臨床意義

孟靜靜 崔 敏 周而樂 李 紅 曹 璋＊

（1.濱州醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，山東 濱州 256603；2.濱州市人民醫(yī)院小兒科，山東 濱州 256600）

0 引言

鈣粘附素(Cadherin，CDH)是一種跨膜糖蛋白，負責(zé)細胞間的粘附和維持正常的組織結(jié)構(gòu)。經(jīng)典的鈣粘附素是一類通過細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域與連環(huán)蛋白相互作用的粘附分子，包括上皮鈣粘附素、神經(jīng)鈣粘附素和胎盤鈣粘附素等。研究證實，CDH的異常表達與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如CDH1的表達缺失在上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和增加腫瘤細胞的遷移和侵襲行為中起著重要的作用；CDH3的過度表達與乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌和胃癌預(yù)后不良之間存在顯著相關(guān)性。

K-鈣粘附素（K-Cadherin，CDH6）是鈣粘附素家族的成員之一。最近的研究表明，CDH6在多種癌癥中被異常激活。例如，CDH6在骨肉瘤患者中表達上調(diào)，并與骨肉瘤患者的整體生存和不良預(yù)后密切相關(guān)；CDH6是甲狀腺腫瘤侵襲性的潛在調(diào)節(jié)因子，在具有間充質(zhì)特征和侵襲性表型的甲狀腺腫瘤細胞中高表達。CDH6的表達與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，然而其與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系卻未見報道。本研究擬采用多種生物信息學(xué)分析技術(shù)，對CDH6在胃癌中的表達情況及功能進行分析和預(yù)測。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載與整理

本研究分析的所用數(shù)據(jù)均來自公共數(shù)據(jù)庫，通過TCGA數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）檢索并下載TCGA-STAD項目下的包含30例正常組織和343例胃癌組織的RNA轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)，及406例胃癌患者的臨床數(shù)據(jù)，依據(jù)樣本ID標識符，鑒定出25對胃癌組織及與之匹配的癌旁組織樣本。使用R軟件中的“l(fā)imma”函數(shù)包對所有RNA轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)進行處理。根據(jù)樣本ID將臨床數(shù)據(jù)與RNA轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)合并。

1.2 不同組間CDH6表達水平對比分析

根據(jù)不同臨床參數(shù)（如正常組織與腫瘤組織、年齡、性別、組織學(xué)分級、臨床分期、TNM分期）進行分組，使用SPSS軟件分析不同組間CDH6的表達水平。

1.3 臨床數(shù)據(jù)及CDH6表達與預(yù)后關(guān)系分析

使用R軟件中的“survival”與“survminer”函數(shù)包進行單因素和多因素Cox歸分析，評價CDH6及其他臨床參數(shù)對胃癌預(yù)后的影響，同時進行Kaplan-Meier生存曲線的繪制，分析CDH6高低表達組樣本間總生存期的差異。

1.4 CDH6共表達基因的功能分析

使用cBioPortal平臺（http://www.cbioportal.org/）分析Stomach Adenocarcinoma（TCGA，PanCancer Atlas）數(shù)據(jù)集中CDH6與其他基因的共表達情況，將|R|≥0.6和P＜0.05作為篩選標準，篩選與CDH6存在共表達關(guān)系的基因。使用Metascape（https://metascape.org/）對CDH6及CDH6共表達的基因進行GO和KEGG富集分析，將Min Overlap設(shè)置為3，P Value Cutoff設(shè)置為0.01，Min Enrichment設(shè)置為1.5，推測CDH6在胃癌中的相關(guān)功能和途徑。

1.5 CDH6高和低表達組的基因集富集分析(GSEA)

以分子簽名數(shù)據(jù)庫（MSigDB）中的h（h.all.v7.2.symbols.gmt）作為參考基因集，使用GSEA4.1.0分析CDH6高低表達組樣本間生物功能的差異。FDR＜0.25且P＜0.05作為篩選標準，用于篩選顯著富集的標志基因集。

1.6 CDH6與腫瘤免疫相關(guān)性的分析

CIBERSORT是一種使用基因表達數(shù)據(jù)來估計混合細胞群中免疫細胞組成的分析工具。使用R軟件的“CIBERSORT”函數(shù)包評估所有樣本中22種免疫細胞的組分；“reshape2”與“ggpubr”函數(shù)包分析正常組織與腫瘤組織間22種免疫細胞組分的差異。利用TIMER在線數(shù)據(jù)庫（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）分析CDH6與胃癌中多種免疫細胞之間的關(guān)系。根據(jù)之前相關(guān)文獻的研究，利用TIMER在線數(shù)據(jù)庫分析CDH6與20種潛在靶向免疫檢查點基因之間的關(guān)系。

1.7 統(tǒng)計分析

使用R 4.0.2軟件、IBM SPSS Statistics 25.0軟件、GraphPad Prism 8.3.0軟件和Adobe Photoshop CC軟件進行圖表繪制及統(tǒng)計分析。隨訪＜30天且臨床資料未知或不完整的患者被排除在采納數(shù)據(jù)的標準之外。根據(jù)CDH6表達量的中位數(shù)將所有樣本分為CDH6高表達組與CDH6低表達組，組間差異采用Student’s t檢驗和Wilcoxon檢驗。單因素分析確定的變量P＜0.05作為多因素Cox分析的候選變量。

丁主任頓了半響，扶起甲洛洛：張大爺，雖然你拿了營業(yè)部的東西，但你也是為了救人，將功贖罪，應(yīng)該不會被判刑。嘎絨有些疑惑地看著丁主任：主任，我們私了不行嗎？報案對誰都沒什么好處。西西一下坐直了身子，看看嘎絨，又看看丁主任：如果可以，營業(yè)部丟失的東西我們一起賠。梨花趕緊擦干眼淚：我所有的工資都可以抵賬。

2 結(jié)果

2.1 CDH6在胃癌中高表達

通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫下載的樣本數(shù)據(jù)，與正常組織相比，胃癌組織中CDH6的表達明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），分析比較CDH6的表達與胃癌不同臨床參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果顯示，CDH6的表達水平與胃癌的T分期顯著相關(guān)（P＜0.05），而與其他臨床病理參數(shù)無顯著相關(guān)性（P＞0.05）。

2.2 CDH6高表達與胃癌的不良預(yù)后相關(guān)

通過進行單因素和多因素的Cox回歸分析，單因素Cox回歸結(jié)果顯示，CDH6高表達與較差的預(yù)后相關(guān)（HR=1.362，95%CI:1.110-1.671，P=0.003），調(diào)整其他因素后，進行的多因素Cox回歸結(jié)果顯示，CDH6的高表達是胃癌不良預(yù)后的獨立危險因素（HR=1.405，95%CI:1.126-1.753，P=0.003）。對CDH6高低表達組進行的Kaplan-Meier生存分析顯示，CDH6高表達組胃癌患者的預(yù)后較差（P＜0.001）。

2.3 CDH6及共表達基因的富集分析

Metascape對CDH6及與CDH6存在共表達關(guān)系的基因進行GO富集分析和KEGG富集分析，主要富集的GO生物過程是血管發(fā)育、細胞—基質(zhì)粘附、與分化有關(guān)的細胞形態(tài)發(fā)生、細胞外基質(zhì)組織、循環(huán)系統(tǒng)過程等；主要富集的GO分子功能是鈣離子結(jié)合、細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、生長因子結(jié)合、肌醇-1，4，5-三磷酸結(jié)合、血小板源性生長因子受體結(jié)合等；主要富集的GO細胞成分是細胞外基質(zhì)、細胞間連接、細胞皮層、參與細胞粘附的蛋白質(zhì)復(fù)合物、膜筏等。主要富集的KEGG通路基因集是焦點粘連、cGMP-PKG信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、Rap1信號通路、鈣信號通路等。

2.4 CDH6高表達與上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)

通過對CDH6高低表達組進行標志基因集的GSEA分析，結(jié)果顯示，主要富集的前五位基因集為上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、凝血、血管生成、Hedgehog信號、肌細胞發(fā)生。

2.5 CDH6與胃癌免疫細胞浸潤正相關(guān)

使用“CIBERSORT”對所有樣本進行免疫細胞浸潤的分析。分析結(jié)果顯示，與正常組織相比，胃癌組織中M0型巨噬細胞、M1型巨噬細胞、M2型巨噬細胞、幼稚B細胞、活化CD4+記憶T細胞和濾泡輔助T細胞的比例明顯上調(diào)（P＜0.05）。TIMER數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果顯示，CDH6的高表達與胃癌中巨噬細胞、CD4+T細胞等多種免疫細胞的上調(diào)正相關(guān)（P＜0.05）。

3 討論

經(jīng)典的鈣粘附素是一類通過細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域與連環(huán)蛋白相互作用的黏附分子，包括了很多亞群，經(jīng)典的鈣粘附素有上皮鈣粘附素、胎盤鈣粘附素和神經(jīng)鈣粘附素。這些鈣粘附素與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，E-鈣粘附素通過限制活性氧介導(dǎo)的凋亡，在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌侵襲、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用，E-鈣粘附素表達缺失會導(dǎo)致EMT過程的發(fā)生。N-鈣粘附素的異常表達與血管生成、黏附和侵襲等多種腫瘤轉(zhuǎn)移過程相關(guān)。此外，癌癥患者血清中可溶性N-鈣粘附素的表達與預(yù)后不良密切相關(guān)。

CDH6是一種II型鈣粘附素，是鈣粘附素家族的成員之一。CDH6首先在間充質(zhì)聚集體和腎囊泡中被檢測到，并發(fā)現(xiàn)其可能誘導(dǎo)間充質(zhì)細胞的早期聚集隨后上皮細胞的轉(zhuǎn)化，還有研究證實，CDH6在限制性菱形體以及神經(jīng)板和神經(jīng)管的其他亞區(qū)存在瞬時表達，提示可能在中樞系統(tǒng)的早期發(fā)育中發(fā)揮作用。近年來，越來越多的研究表明，CDH6的表達與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在甲狀腺癌中，轉(zhuǎn)化生長因子β（Transforming Growth Factor Beta 1，TGF-β）可以靶向調(diào)控CDH6，使CDH6在具有間充質(zhì)特征和侵襲性表型的甲狀腺腫瘤中高表達。EBV病毒的感染可以導(dǎo)致CDH6激活，進而誘導(dǎo)鼻咽癌的EMT過程并促進鼻咽癌的侵襲和轉(zhuǎn)移；CDH6在卵巢癌和腎癌中也存在明顯高表達，CDH6在胃癌中的表達情況及功能尚未報道。

通過對公共數(shù)據(jù)庫的樣本進行生物信息學(xué)分析，可以發(fā)現(xiàn)CDH6在胃癌中高表達，其表達的差異影響著胃癌腫瘤的大小及浸潤深度，是胃癌不良預(yù)后的獨立危險因素。CDH6及其共表達基因的GO富集分析結(jié)果提示，CDH6可能通過影響肌醇-1，4，5-三磷酸結(jié)合、細胞-基質(zhì)粘附等進而促進腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移。CDH6及其共表達基因的KEGG通路富集分析結(jié)果提示，CDH6可能通過影響焦點粘連、cGMP-PKG信號通路、Rap1信號通路、鈣通道活動、細胞粘附分子功能直接或間接地控制腫瘤細胞的粘附、遷移等活動。雖然GO富集分析顯示CDH6的高表達可能影響細胞遷移的正向調(diào)節(jié)過程，但CDH6表達與臨床病理參數(shù)的分析顯示，CDH6的高表達未顯示出促進胃癌的淋巴轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移，腫瘤轉(zhuǎn)移是受多種基因和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控的，相關(guān)機制還有待進一步研究。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程伴隨著長期的、無法消除的炎癥反應(yīng)，這種反應(yīng)由局部細胞因子風(fēng)暴推動。EMT可以使分化的上皮細胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細胞，在腫瘤的這場局部細胞因子風(fēng)暴中發(fā)揮著重要的作用，影響腫瘤的進展、侵襲和轉(zhuǎn)移，腫瘤部位的炎性細胞會不斷產(chǎn)生EMT誘導(dǎo)因子，誘發(fā)腫瘤細胞的EMT過程。有研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞在實驗中可以通過IL-8依賴的方式誘導(dǎo)肝細胞癌細胞的EMT過程。巨噬細胞還可以通過表皮生長因子誘導(dǎo)非小細胞肺癌細胞EMT過程的發(fā)生。此外，大量CD33陽性髓系細胞浸潤的三陰性乳腺癌更容易出現(xiàn)EMT征象。在本研究中，筆者試圖探究胃癌中CDH6與EMT和免疫細胞之間的關(guān)系。GSEA富集分析的結(jié)果顯示，CDH6高表達組主要富集的標志基因集有EMT和Hedgehog信號等。有研究證實，Hedgehog信號參與調(diào)控EMT過程，促進胃癌細胞的侵襲和遷移能力。CDH6可能通過促進胃癌的EMT過程來影響胃癌的進展與預(yù)后。本研究觀察到CDH6的高表達與胃癌中巨噬細胞、CD4+T細胞、樹突狀細胞等多種免疫細胞的上調(diào)存在相關(guān)性，其中相關(guān)系數(shù)最高的是巨噬細胞。結(jié)合CDH6與CD68、CD163共表達關(guān)系的結(jié)果與免疫細胞浸潤分析的結(jié)果，巨噬細胞在胃癌中上調(diào)，并且以M2型巨噬細胞上調(diào)為主。之前的研究證明，腫瘤浸潤巨噬細胞（TAMs）中M2型巨噬細胞會促進細胞外基質(zhì)重構(gòu)、血管生成、免疫抑制，并通過分泌各種可溶性因子促進癌細胞獲得侵襲特性。在許多獨立研究中，TAMs被描述為有效的EMT誘導(dǎo)劑，TAM相應(yīng)地產(chǎn)生多種生長因子，進而誘導(dǎo)腫瘤細胞EMT過程的發(fā)生，而M2型巨噬細胞與腫瘤細胞共培養(yǎng)實驗證實其促進腫瘤細胞獲得EMT的能力。由此推測，在胃癌中CDH6可能被TAMs產(chǎn)生的TGF-β等因子靶向上調(diào)，進而促進了胃癌細胞的EMT過程，最終影響胃癌的進展與預(yù)后。

本研究中，胃癌中CDH6的高表達與PDL2、TGFβ、HAVCR2和TNFSF4等多個常見免疫檢查點和免疫相關(guān)用藥靶點的高表達存在正相關(guān)關(guān)系。在多種腫瘤中，EMT評分與免疫檢查點基因的表達呈高度正相關(guān)。因此，CDH6可能成為預(yù)測胃癌免疫治療應(yīng)答率的潛在靶標基因，為胃癌患者從免疫治療中更好地獲益。

在本研究中CDH6在胃癌中呈高表達狀態(tài)，增加了胃癌細胞的侵襲性，筆者推測CDH6可能被TGF-β等因子調(diào)控進而通過EMT過程來影響胃癌的進展與預(yù)后，CDH6的表達還與多個免疫相關(guān)靶點相關(guān)。以上結(jié)果是根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果推測的結(jié)論，還需通過體內(nèi)體外實驗來對結(jié)論進行驗證。綜合本研究結(jié)果，針對CDH6表達情況對胃癌患者選擇個性化的免疫治療或研發(fā)靶向沉默CDH6的藥物，都可能為胃癌的治療提供新思路。