分子標記結合表型鑒定選育兼抗赤霉病、白粉病和條銹病弱筋小麥新品種揚麥38

趙仁慧，陳甜甜，王 玲，朱冬梅，汪尊杰，張 勇，張伯橋，高德榮，吳宏亞，別同德

(農(nóng)業(yè)部長江中下游小麥生物學與遺傳育種重點實驗室/江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所，江蘇揚州 225007)

小麥赤霉病、白粉病和條銹病是長江中下游麥區(qū)主要病害。由于氣候變暖、雨水增多、播期推遲等影響，小麥赤霉病和白粉病重發(fā)年份增加，條銹病在長江中游地區(qū)常年較重，而化學防治易帶來農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染等問題。隨著中國對農(nóng)作物生產(chǎn)減肥減藥的要求，生產(chǎn)上對綠色抗病小麥品種的需求日益迫切，選育多抗小麥品種是防治赤霉病、白粉病和條銹病最經(jīng)濟、環(huán)保的途徑。

農(nóng)業(yè)部2003年發(fā)布的《優(yōu)質(zhì)專用小麥優(yōu)勢區(qū)域發(fā)展規(guī)劃》明確了長江中下游麥區(qū)為中國唯一的弱筋小麥優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)帶。弱筋小麥是餅干、糕點和釀酒等的重要原料。當前，以揚麥13、揚麥15、寧麥13等為代表的弱筋小麥品種仍存在綜合抗病性較弱，難以滿足弱筋小麥產(chǎn)業(yè)綠色有機化的發(fā)展趨勢。

小麥-簇毛麥T6VS/6AL易位系92R137是中國重要的抗白粉病、條銹病資源，其簇毛麥6VS染色體上攜帶抗白粉病基因，是目前報道的抗性最強、抗譜最廣的抗白粉病基因。據(jù)不完全統(tǒng)計，利用該易位系育成的抗白粉病小麥品種約有40個，主要集中在西南麥區(qū)和長江中下游麥區(qū)。由于、等早期利用的抗白粉病基因在長江中下游麥區(qū)不同程度地喪失抗性，已成為當前該麥區(qū)白粉病抗性育種的重要基因資源。易位系92R137的1B染色體上攜帶高抗條銹病基因(=)，該基因在西北春麥區(qū)、西南麥區(qū)應用極為廣泛，但由于毒性菌株V26的出現(xiàn)，導致已基本喪失抗性。幸運的是，V26不是當前長江中下游麥區(qū)條銹菌的優(yōu)勢菌株，育成品種仍能滿足該麥區(qū)生產(chǎn)上對條銹病抗性的需求。

籽粒硬度是弱筋小麥最重要的指標之一，在遺傳上主要由和基因控制，任一基因突變都導致胚乳質(zhì)地變硬。一般而言，中筋和強筋小麥均為硬質(zhì)麥，而弱筋小麥為軟質(zhì)麥。王化敦等研究發(fā)現(xiàn)，揚麥系列品種均為野生型，軟質(zhì)麥與硬質(zhì)麥的差異主要由基因變異造成，硬質(zhì)麥如揚麥158、揚麥16等均為突變型，弱筋小麥如揚麥13、揚麥15等均為野生型。

揚麥16是江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所育成的高產(chǎn)中筋小麥品種，繼承了揚麥158高產(chǎn)、適應性廣(廣適)和赤霉病抗性好(中抗)的優(yōu)點，是過去10年間長江中下游麥區(qū)種植面積最大的中筋小麥品種，曾連續(xù)8年被列入農(nóng)業(yè)部主導品種。為發(fā)揮揚麥16高產(chǎn)、廣適的優(yōu)勢，同時利用易位系92R137的軟質(zhì)小麥特性及優(yōu)異抗病性，本研究2007年以揚麥16為輪回親本，92R137為供體親本，構建了BC群體，低世代借助分子標記對抗白粉病基因、抗條銹病基因和硬度基因進行輔助選擇，高世代結合赤霉病圃抗性評價及弱筋品質(zhì)進行篩選，最終育成兼抗赤霉病、白粉病和條銹病的弱筋小麥新品種揚麥38。本文對其選育過程進行了總結，以期為小麥高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)多抗新品種選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

揚麥16是由江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所育成的高產(chǎn)、廣適中筋小麥新品種，中抗赤霉病，中感白粉病和條銹病。

92R137是由南京農(nóng)業(yè)大學陳佩度教授育成的小麥-簇毛麥T6VS/6AL易位系，其簇毛麥6VS染色體上攜帶抗白粉病基因，小麥1B染色體上攜帶抗條銹病基因，高抗白粉病和條銹病，高感赤霉病。

1.2 研究方法

1.2.1 雜交選育

于2007年秋季，在溫室內(nèi)以揚麥16為受體親本、92R137為供體親本進行雜交，2008年2月收獲F代種子并種植于溫室大棚，開花后與揚麥16回交，5月底收獲BCF種子，當年6月在云南昆明種植BCF群體進行加代，10月底分單株收獲BCF種子，當年11月按株行種植BCF群體于揚州灣頭試驗基地選種圃，2009年春季選擇農(nóng)藝性狀表現(xiàn)優(yōu)異的株行并結合分子標記鑒定篩選、和均純合的陽性單株，于當年秋季種植在株行圃。2010-2013連續(xù)四年在優(yōu)異株行選株并結合標記進行鑒定，直至農(nóng)藝性狀純合，2013年夏收獲BCF部分優(yōu)異株系，經(jīng)品質(zhì)評價后，推薦其中弱筋株系進入產(chǎn)量鑒定圃，次年篩選弱筋品質(zhì)優(yōu)異且保持白粉病和條銹病抗性的小區(qū)系，同時根據(jù)赤霉病、白粉病病圃鑒定和條銹病異地鑒定等結果，篩選出兼抗赤霉病、白粉病和條銹病的弱筋小麥新品系。

1.2.2 分子標記鑒定

采用基于啟動子序列開發(fā)的共顯性功能標記MBH1檢測抗白粉病基因；采用Wang等開發(fā)的共顯性標記WE173檢測抗條銹病基因；采用與籽粒高硬度相關的突變基因的STS標記檢測硬度基因。標記引物序列見表1，由上海捷瑞生物有限公司合成。

小麥葉片基因組DNA的提取采用Sharp等的方法。PCR反應體系為10 μL，包括10 ng模板DNA，上、下游引物(10 μmol·L)各0.2 μL，200 μmol·L的dNTPs溶液0.8 μL，1 mmol·L的MgCl溶液0.8 μL，Taq DNA聚合酶(5 U·μL，TaKaRa公司，日本)1 U， 10×聚合酶專用Buffer 1 μL，用ddHO補足至10 μL。PCR程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性 30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)； 72 ℃延伸10 min。采用8%(w/v)的聚丙烯酰胺凝膠分離，AgNO溶液顯色檢測PCR產(chǎn)物。

表1 目標抗病基因檢測標記引物序列Table 1 Primer sequences of molecular markers associated with target resistance genes

1.2.3 抗病性鑒定

赤霉病抗性鑒定采用單花滴注法，于2019-2020和2020-2021兩年度在江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所試驗基地赤霉病抗性鑒定圃進行。病原菌采用強致病力的赤霉菌混合菌株(F0301、F0609和F0980)，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院陳懷谷研究員提供。每個品系各取20個同日開花的麥穗，在頂部第5小穗注入10 μL分生孢子懸浮液(5×10個·mL)，日間彌霧保濕(每半小時彌霧5 min)，接種后21 d調(diào)查發(fā)病小穗數(shù)，計算病小穗率。病小穗率=(病小穗數(shù)/總小穗數(shù))×100%。以高抗品種蘇麥3號、高感品種安農(nóng)8455和輪回親本揚麥16作為對照。

白粉病抗性鑒定于2016-2017年度在江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所試驗基地玻璃溫室內(nèi)進行，采用江蘇里下河地區(qū)流行的白粉菌混合菌種進行人工接種。分別以含有的育成品種揚麥18和高感白粉病品種揚麥9號為抗、感白粉病對照品種。待揚麥9號充分發(fā)病時，調(diào)查群體發(fā)病情況，葉片出現(xiàn)分生孢子堆的材料表現(xiàn)為感病(S)，無分生孢子堆的材料表現(xiàn)為抗病(R)。

條銹病鑒定采用自然發(fā)病鑒定法，于2016-2017年度在湖北荊州適應性試驗點進行，于2017年5月上、中旬條銹病充分發(fā)病時調(diào)查病級。根據(jù)國家行業(yè)標準(NY/T 1443.1-2007)中抗條銹病評價技術規(guī)范將反應型分為0～4級：“0”為免疫(IM)，不表現(xiàn)癥狀；“0；”為近免疫(NIM)，產(chǎn)生枯死斑點或失綠反應，但不產(chǎn)生夏孢子堆；“1”為抗病(R)，夏孢子堆很小且很少，周圍有枯死反應；“2”為中抗(MR)，夏孢子堆小到中等，周圍有枯死和失綠反應；“3”為中感(MS)，夏孢子堆大而多，周圍組織無枯死反應，但有輕微失綠現(xiàn)象；“4”為感病(S)，夏孢子堆大而多，周圍組織無枯死反應，失綠現(xiàn)象不明顯。

1.2.4 產(chǎn)量及品質(zhì)鑒定

于2016-2017和2017-2018兩年度，參加長江中下游國家品種比較試驗；于2018-2019和2019-2020兩年度，參加國家區(qū)域試驗，并調(diào)查有效穗數(shù)、穗粒數(shù)和千粒重；于2019-2020年度，同時參加國家生產(chǎn)試驗。

小麥籽粒硬度、粗蛋白含量、濕面筋含量、面團穩(wěn)定時間、SDS沉淀值、吸水率、拉伸阻力、拉伸面積等關鍵品質(zhì)指標由農(nóng)業(yè)部谷物及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(哈爾濱)和國家小麥改良中心揚州分中心共同完成，檢測參考張 曉等的研究方法。

2 結果與分析

2.1 抗白粉病基因 Pm21、抗條銹病基因 Yr26和軟質(zhì)基因 Pinb-D1a的分子標記檢測結果

利用基因共顯性功能標記MBH1對其親本及BCF群體進行分子標記檢測，篩選目標基因純合單株。結果顯示，基因純合單株表現(xiàn)出與供體親本92R137大小一致的條帶，陰性單株具有與輪回親本揚麥16大小一致的條帶，基因雜合單株表現(xiàn)出雙親的組合條帶(圖1A)。

利用與基因緊密連鎖的共顯性標記WE173對BCF群體進行分子標記檢測。結果顯示，基因純合單株具有與供體親本92R137大小一致的條帶，陰性單株具有與輪回親本揚麥16大小一致的條帶，基因雜合單株表現(xiàn)出雙親的組合條帶(圖1B)。

利用硬度突變基因顯性功能標記Pinb-D1b對BCF群體進行基因鑒定，凡是出現(xiàn)基因特征條帶的均為硬質(zhì)麥，不具有該條帶的說明含有基因，為軟質(zhì)麥(圖1C)。

綜合、和基因的標記檢測結果，篩選攜帶、純合(陽性)且軟質(zhì)基因型純合(陰性)的聚合單株，剔除株高過高、穗子過小、分蘗過少等農(nóng)藝性狀較差的單株。將聚合單株播種成株行，逐代篩選優(yōu)異株行并結合分子標記驗證，直至農(nóng)藝性狀純合，育成新品種14-214，于2022年通過國家農(nóng)作物品種審定委員會審定，命名為揚麥38。

M：DL2000；A：利用標記MBH1的檢測結果；B：利用標記WE173的檢測結果；C：利用標記Pinb-D1b的檢測結果。M：DL2000；1：揚麥16；2：92R137；3～20：部分BC1F2單株。

2.2 抗病性鑒定結果

對育成品種揚麥38分別進行白粉病、條銹病和赤霉病的抗性鑒定。白粉病抗性鑒定結果表明，揚麥38對白粉病表現(xiàn)為抗病，而輪回親本揚麥16表現(xiàn)為感病(圖2A)。條銹病抗性鑒定結果表明，揚麥38對條銹病表現(xiàn)為近免疫(反應型“0；”)，而輪回親本揚麥16表現(xiàn)為感病(反應型“4”)(圖2B)。抗性鑒定結果與分子標記檢測結果一致(圖2C和2D)。兩年度赤霉病抗性鑒定結果表明，揚麥38對赤霉病的抗性顯著高于輪回親本揚麥16(圖2E和表2)，接近于抗病對照品種蘇麥3號(表2)。

A：揚麥38和揚麥16的白粉菌接種鑒定表現(xiàn)；B：揚麥38和揚麥16的條銹病自然發(fā)病情況；C:標記MBH1的PCR擴增產(chǎn)物電泳結果；D：標記WE173的PCR擴增產(chǎn)物電泳結果；E:揚麥38和揚麥16的赤霉菌單花滴注接種表現(xiàn)。C圖和D圖中1～5為揚麥38，6～10為揚麥16。

表2 赤霉病抗性鑒定結果Table 2 Evaluation of Fusarium head blight resistance

2.3 產(chǎn)量鑒定結果

揚麥38在長江中下游國家品種比較試驗中，2016-2017年度比揚麥20(對照品種)增產(chǎn) 6.90%；2017-2018年度比揚麥20增產(chǎn)8.17%，兩年度綜合排名第1位。揚麥38在國家區(qū)域試驗中，2018-2019年度比揚麥20增產(chǎn)5.72%，2019-2020年度比揚麥20增產(chǎn)4.89%，兩年度平均產(chǎn)量 6 584.48 kg·hm，比揚麥20增產(chǎn) 5.31%；2019-2020年度在生產(chǎn)試驗中，揚麥38比揚麥20增產(chǎn)7.66%(表3)。該品種穩(wěn)產(chǎn)性好，在5個試驗中比對照揚麥20均增產(chǎn)≥2%，≥2%點次率介于78.9%～100%之間；抗倒伏性較好，株高85 cm左右，倒伏不嚴重點次率在4個試驗中均為100%，1個為89.5%(表3)。產(chǎn)量結構合理，兩年度區(qū)域試驗的平均有效穗數(shù)為445.5×10·hm，穗粒數(shù)為40.9粒，千粒重為41.3 g。

表3 揚麥38在長江中下游國家品種比較試驗、區(qū)域試驗和生產(chǎn)試驗中的產(chǎn)量表現(xiàn)Table 3 Yield of Yangmai 38 in comparative tests,regional tests and production tests in the middle and lower reaches of Yangtze River

2.4 品質(zhì)鑒定結果

國家區(qū)試品質(zhì)鑒定由農(nóng)業(yè)部谷物及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(哈爾濱)負責完成，綜合2年度區(qū)試品質(zhì)檢測結果，發(fā)現(xiàn)揚麥38屬于弱筋小麥類型(表4)。同時，國家小麥改良中心揚州分中心對揚麥38及其輪回親本揚麥16的關鍵品質(zhì)指標也進行了比較，結果顯示，揚麥38的硬度指數(shù)、粗蛋白含量、濕面筋含量、面團穩(wěn)定時間、SDS沉淀值和吸水量均顯著低于輪回親本揚麥16(表5)，是典型的弱筋小麥類型。

表4 揚麥38在長江中下游區(qū)域試驗中的品質(zhì)鑒定結果Table 4 Quality test of Yangmai 38 in the regional tests in the middle and lower reaches of Yangtze River

表5 揚麥38與輪回親本揚麥16的品質(zhì)鑒定結果Table 5 Quality test of Yangmai 38 and the recurrent parent Yangmai 16

3 討 論

3.1 關于分子標記的效率

分子標記輔助選擇已成為小麥育種的常規(guī)技術，標記選擇效率是決定該技術能否實際應用的關鍵。在揚麥38的育成過程中，由于抗白粉病基因檢測標記來自基因本身啟動子，抗條銹病基因檢測標記與其緊密連鎖，二者靶向性好，同時均為共顯性標記，可以直接在BCF分離世代直接篩選出目標基因純合的個體，省去了大量的多代標記輔助鑒定工作，標記選擇效率得到顯著提高。

在對軟質(zhì)基因的篩選中，由于前期已驗證輪回親本揚麥16為突變型的硬質(zhì)麥(硬度指數(shù)達60)，而供體92R137為野生型的軟質(zhì)麥(硬度指數(shù)30)，因此為篩選籽粒軟質(zhì)后代，直接利用硬質(zhì)基因顯性標記進行篩選，通過直接篩除BCF代標記陽性的個體，保留純合基因型。

綜合3個標記結果，可以在BCF低世代實現(xiàn)3個基因全部純合的聚合單株，這種標記輔助聚合育種方法大大提高了對目標基因型的選擇效率，從而可使育種家在后續(xù)世代育種中專注于農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量的選擇。

3.2 關于赤霉病抗性的選擇

小麥赤霉病是長江中下游麥區(qū)的最重要病害，抗赤霉病遺傳研究一直是該麥區(qū)小麥抗病育種的基礎。近年來，主效抗赤霉病基因和相繼被克隆，為標記輔助培育抗病品種提供了機會，其中利用進行抗赤霉病遺傳改良的實踐較為廣泛。但在長江中下游赤霉病重發(fā)區(qū)，單一的基因的效應有限，難以根本解決該麥區(qū)小麥赤霉病問題。其次，通過標記輔助聚合抗赤霉病QTL策略育成抗赤霉病品種的實例較少，原因之一是效應明確可靠且達到育種要求的抗赤霉病QTL太少，二是過多的微效QTL聚合易損害對產(chǎn)量、農(nóng)藝、品質(zhì)等性狀的選擇權，對現(xiàn)實育種的貢獻并不大。

江蘇淮南地處長江下游，雨水豐沛，小麥生長中后期罹患赤霉病風險極高，赤霉病抗性水平達中抗以上是該地區(qū)品種審定的基本要求。長期的赤霉病選擇壓和品種進化使該地區(qū)品種總體抗性水平較高，其中以揚麥158為代表的揚麥系列品種，自上世紀90年代以來一直以赤霉病抗性水平高而著稱，且推廣品種一般都具有較高的赤霉病本底抗性。本研究以中抗赤霉病品種揚麥16為輪回親本，感赤霉病種質(zhì)92R137為供體親本，在標記輔助聚合、和目標基因的同時，對群體進行赤霉病接種和抗性選擇，育成抗性接近蘇麥3號的小麥新品種揚麥38。在2020年國家小麥產(chǎn)業(yè)體系鑒定的全國育成品種(系)中，揚麥38的赤霉病抗性高居第二位。因此，充分利用揚麥本底抗性的同時兼顧數(shù)量性狀的超親優(yōu)勢，在赤霉病抗性育種中完全可行。

3.3 關于弱筋小麥品質(zhì)指標的探討

弱筋小麥一般要求有較低的籽粒硬度、蛋白質(zhì)和濕面筋含量、較短的面團穩(wěn)定時間、較小的溶劑保持力(SRC)等。蛋白質(zhì)和濕面筋含量2個指標受施肥模式和施氮量的影響顯著，在實際育種中僅作為參考指標。籽粒硬度穩(wěn)定性好，遺傳力高，在弱筋小麥品種選育中應予以重視。在本研究中，低世代利用硬度基因功能標記Pinb-D1b對軟質(zhì)麥進行篩選，取得了預期的效果。

中國弱筋小麥需求量持續(xù)攀升，但現(xiàn)有的弱筋小麥品種綜合抗病性還不強，影響其綠色生產(chǎn)。揚麥38實現(xiàn)了優(yōu)質(zhì)弱筋與綠色多抗相結合的突破，將為弱筋小麥綠色生產(chǎn)和相關產(chǎn)業(yè)鏈的培育提供重要的品種支持。