抗體偶聯(lián)藥物的質(zhì)量研究與質(zhì)量控制

花海清

摘要：抗體藥物偶聯(lián)物 （ADC） 是一種新型的抗癌藥物，隨著技術(shù)迭代更新，這類藥物在近幾年引起了人們的關(guān)注。 ADC 將單克隆抗體的選擇性與化療藥物的細胞殺傷特性（有效載荷）相結(jié)合，并通過適當?shù)倪B接子連接在一起?？贵w部分靶向腫瘤細胞和/或腫瘤微環(huán)境細胞表達的特定細胞表面抗原，充當在腫瘤組織內(nèi)遞送細胞毒性有效載荷的載體。盡管ADC藥物在選擇性和效力方面具有優(yōu)勢，但此類藥物的研發(fā)仍充滿挑戰(zhàn)，其中質(zhì)量研究和質(zhì)量控制是研發(fā)的難點之一。本文結(jié)合筆者工作中的實際經(jīng)驗，論述抗體偶聯(lián)藥物及其質(zhì)量研究與質(zhì)量控制相關(guān)內(nèi)容，為新型ADC藥物的研發(fā)提供支持。ADC藥物分為細胞毒性藥物，連接子和抗體三個部分，是高級結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子藥物。筆者分別分析和闡述了細胞毒性藥物，連接子和抗體在生產(chǎn)過程中需要重點關(guān)注的質(zhì)量研究內(nèi)容和質(zhì)量控制方法。在此基礎(chǔ)上，筆者進一步闡述了ADC藥物作為整體，對其質(zhì)量研究需要采用的方法和完成的內(nèi)容，包括結(jié)構(gòu)分析，雜質(zhì)分析和生物活性分析等。希望本文能為生物制藥行業(yè)中研究和生產(chǎn)ADC藥物的從業(yè)者帶來一定的參考。

關(guān)鍵詞：抗體偶聯(lián)藥物;質(zhì)量研究;質(zhì)量控制

【中圖分類號】 R97 【文獻標識碼】 A? ? ? 【文章編號】2107-2306（2022）09--03

引言

抗體偶聯(lián)藥物（ADC）屬于近些年來應(yīng)用比較多的一種腫瘤治療模式。ADC藥物由單克隆抗體通過小分子連接子與高活性的小分子化合物偶聯(lián)而成，兼具了抗體藥物的高靶向性和小分子化合物的高活性的特點，有優(yōu)異的臨床效果和廣闊的市場前景，表1總結(jié)了已獲批的ADC藥物。每個具體的ADC藥物產(chǎn)品都有其獨特的設(shè)計和生產(chǎn)方式，因此對于每個ADC產(chǎn)品的質(zhì)量研究和質(zhì)量控制措施需要根據(jù)其存在具有差異性的內(nèi)容，應(yīng)該做到針對性的分析。

1. ADC藥物的結(jié)構(gòu)特征

1.1 細胞毒性藥物

細胞毒性藥物的通常通過DNA 損傷、微管抑制、細胞周期抑制、RNA轉(zhuǎn)錄抑制等作用進行殺傷腫瘤細胞。相較于傳統(tǒng)毒性藥物而言，喜樹堿類的小分子化合物，活性適中，體內(nèi)毒性相對溫和。喜樹堿及其衍生物是拓撲異構(gòu)酶I抑制劑，它們穩(wěn)定了拓撲異構(gòu)酶誘導(dǎo)的DNA單鏈斷裂，當三元DNA-TOP1-抑制劑復(fù)合物遇到復(fù)制叉時，DNA發(fā)生雙鏈斷裂，促使腫瘤細胞死亡。此類分子具有較高的選擇性和成藥性，是能夠當作ADC藥物的藥效成分進行開發(fā)的[1]。

1.2 連接子

連接子（即，連接藥物與抗體的 ADC 區(qū)）在正確的 ADC 遞送中發(fā)揮著重要作用。事實上，理想的連接子應(yīng)使 ADC 在血液中保持穩(wěn)定，確保免疫偶聯(lián)物可以完整地到達腫瘤組織，但在偶聯(lián)物內(nèi)化至癌細胞后，連接子應(yīng)能輕松斷裂，以釋放細胞毒性藥物。 連接子產(chǎn)生的應(yīng)用價值，就是確保ADC藥物分子具有正常的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，使得藥物在體液內(nèi)循環(huán)期間是穩(wěn)定的狀態(tài)。當ADC藥物經(jīng)過抗體的特異性結(jié)合內(nèi)化至腫瘤細胞中，通過溶酶體中的低pH值，或者蛋白酶解等過程，將藥物進行釋放出，從而發(fā)揮毒性作用，進而將腫瘤細胞進行消滅。藥物分子上的細胞毒性藥物，具備較強的疏水性特點，所以可以按照腫瘤的異質(zhì)性，采取合適親水性的連接子，促使療效更好的提升。很多的ADC 藥物屬于依賴內(nèi)化后釋放藥物，結(jié)果特殊設(shè)計的連接子，能夠通過特定的反應(yīng)（如低pH值或者蛋白酶）裂解，將小分子藥物釋放。

1.3 單抗分子

單抗分子屬于一種多結(jié)構(gòu)域的生物大分子，對其選擇期間，應(yīng)該先選擇其合適的靶點。ADC 的單抗分子部分通常會與腫瘤細胞或腫瘤微環(huán)境細胞組分表面表達的靶抗原結(jié)合。ADC在結(jié)合靶抗原之后，會通過內(nèi)化作用進入細胞內(nèi)部，攜帶有負載的抗體分子到達溶酶體后，產(chǎn)生裂解反應(yīng)，把細胞毒性藥物進行釋放。通常情況下，最優(yōu)的靶點就是在腫瘤組織高表達或者是在特異性表達靶點上。研究指出，如果單抗分子具有越高的腫瘤穿透能力，那么其更適合用于合成ADC藥物[2]。小分子藥物通過連接子，與單抗分子上的賴氨酸殘基或半胱氨酸殘基進行反應(yīng)后，共價連接到抗體分子上。偶聯(lián)藥物抗體比率（DAR）是ADC藥物的重要屬性，而且并不是具有越大的載藥量，ADC的治療效果就越好。過高的載藥量會引發(fā)ADC藥物的聚集，同時使得體內(nèi)ADC藥物過快的清除，從而削弱藥效。

2. ADC藥物的理化分析方法

2.1 ADC藥物的結(jié)構(gòu)與質(zhì)量的相關(guān)性分析

如圖1所示，由于ADC藥物的復(fù)雜性，對ADC藥物的質(zhì)量研究需要對其結(jié)構(gòu)特性進行全面分析。首先需要應(yīng)用采用適當?shù)?、高精度的分析技術(shù)，從理化性質(zhì)等角度對ADC藥物進行全面細致的分析;其次，應(yīng)結(jié)合對裸抗的特性分析充分了解偶聯(lián)前后的相關(guān)特性變化;再次，盡可能詳細的研究ADC藥物的質(zhì)量屬性后，需要確定ADC藥物的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，為制品質(zhì)量標準的建立提供依據(jù)。對于ADC藥物結(jié)構(gòu)進行解析過程中，應(yīng)該有對照的物品。單克隆抗體具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和相當程度的異質(zhì)性（如糖基化和不同形式的翻譯后修飾等）。單抗本身的異質(zhì)性疊加偶聯(lián)過程可能會產(chǎn)生的變異性，進一步增加了ADC藥物結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性。對于具有高度復(fù)雜異質(zhì)性的ADC，需采用具有足夠分辨率的可靠分析方法進行全面分析，分析內(nèi)容包括小分子藥物和連接子的化學(xué)性質(zhì)、偶聯(lián)方式（氨基偶聯(lián)、巰基偶聯(lián)、定點偶聯(lián)等）。

注：達到臨床研究階段的實驗性 ADC 可能具有與已獲批 ADC 相同的靶抗原（此類抗原在綠框中以粗體表示），或可識別通常在實體瘤表達的新型腫瘤相關(guān)抗原 （TME）（此類抗原在綠框中不以粗體表示）或由腫瘤微環(huán)境中存在的免疫/基質(zhì)細胞表達的新型腫瘤相關(guān)抗原 （TME）（紫色框）。這些 ADC 中的少數(shù)藥物靶向新出現(xiàn)的細胞譜系特異性抗原（這些抗原由某些惡性血液病選擇性表達）。與已獲批的 ADC 一樣，通過酸敏感、不可裂解或可裂解連接子將 mAb 部分連接到具有細胞毒性的有效載荷上。在大多數(shù)情況下，試驗用 ADC 遞送的細胞毒性化合物與已獲批 ADC 所遞送的化合物的不同（常見有效載荷列在粉色框中;新型有效載荷列在紅色框中）。試驗用 ADC 的 mAb 成分包括嵌合、人源化或全人源化 IgG1、IgG2 或 IgG4（也存在于已獲批 ADC 中的常見 IgG 亞類以粗體表示）。

2.2 ADC藥物一級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)的理化分析方法

由于ADC藥物的創(chuàng)新性和復(fù)雜性，其質(zhì)量研究是一個系統(tǒng)性的工程，主要研究內(nèi)容可以參考《抗體偶聯(lián)藥物質(zhì)量控制和臨床前評價專家共識》[3]。ADC的理化性質(zhì)分析首先分析和評價偶聯(lián)工藝對抗體一級結(jié)構(gòu)的影響，可以采用肽圖譜法和質(zhì)譜等分析方法，評估偶聯(lián)工藝對抗體一級結(jié)構(gòu)的影響，重點需要關(guān)注偶聯(lián)后的氨基酸序列與單抗序列的一致性，偶聯(lián)后的二硫鍵連接形式及其與單抗的區(qū)別，同時可以進一步分析糖基化修飾的變化和翻譯后修飾的變化等。偶聯(lián)過程能夠在一定程度上影響到抗體分子的一級結(jié)構(gòu)，因此結(jié)構(gòu)表征需要涉及到翻譯后修飾。藥物抗體偶聯(lián)比（DAR）表示每個抗體分子上偶聯(lián)的小分子藥物的平均數(shù)量，它是ADC重要的質(zhì)量屬性之一，與ADC藥物的安全性和有效性都有很強的相關(guān)性。檢測DAR值的分析方法需要根據(jù)小分子藥物的化學(xué)性質(zhì)和ADC藥物整體的理化性質(zhì)確定。常用方法有：紫外分光光度法、反相色譜法、疏水色譜法和質(zhì)譜法（MS）。紫外可見光譜是一種簡單和最常用的DAR測定方法，該方法的先決條件是：1）藥物應(yīng)含有紫外線吸收基團;2）藥物和抗體在紫外線可見光譜中表現(xiàn)出明顯獨立的最大吸收峰;3）藥物的存在不應(yīng)影響ADC樣本中抗體的光吸收特性，反之亦然。根據(jù)測量到的吸光率和消光系數(shù)，可以根據(jù)Beer–Lambert原理計算出蛋白質(zhì)和藥物的濃度，依此計算平均DAR，公式如下：

質(zhì)譜法（MS）是另外一種常用的分析DAR的方法。目前使用包括電噴霧電離質(zhì)譜（ESI）、飛行時間質(zhì)譜（TOF）或Orbitrap，以區(qū)分ADC的異質(zhì)分子種類。根據(jù)質(zhì)譜測定的分子量及相應(yīng)峰面積等，使用以下公式計算平均DAR。

此外，還可利用質(zhì)譜法對ADC藥物中的偶聯(lián)位點進行表征。 有時候，翻譯后修飾對于偶聯(lián)位點的表征會產(chǎn)生干擾，可通過脫糖、胰蛋白水解及還原烷基化等舉措，減少干擾，保障檢測的精準度。當小分子藥物通過半胱氨酸殘基偶聯(lián)至抗體的情況下，還需要對二硫鍵的配對、游離巰基的數(shù)量以及巰基氧化等內(nèi)容進行研究。為進一步研究ADC藥物的高級結(jié)構(gòu)，可采用圓二色譜、差示掃描量熱等物理學(xué)分析方法。ADC的分子大小變異體是體現(xiàn)ADC藥物純度的重要指標，關(guān)系到ADC產(chǎn)品的安全性，可通過分子排阻色譜法（SEC-HPLC）重點分析ADC藥物的聚體，通過非還原型十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（NR-SDS-PAGE）和還原型十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（R-SDS-PAGE）或者非還原型十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺毛細管凝膠電泳（NR-CE-SDS）和還原型十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺毛細管凝膠電泳（R-CE-SDS）ADC藥物的片段。另外，需要重點研究ADC藥物的穩(wěn)定性以及生物學(xué)活性[4]。

3. ADC生產(chǎn)過程中產(chǎn)生雜質(zhì)的控制方法

3.1 產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)的控制方法

由于ADC藥物結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性以及生產(chǎn)工藝的繁瑣，使其與傳統(tǒng)的單抗類藥物相比有更加特殊的雜質(zhì)。ADC藥物生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的雜質(zhì)主要分為產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)和工藝相關(guān)雜質(zhì)。其中產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)主要是游離的小分子毒素。而游離的小分子毒素與產(chǎn)品的安全性息息相關(guān)，為保證產(chǎn)品的生物安全性，需要重點關(guān)注。ADC藥物中的游離小分子毒素主要通過純化等方式去除，因此需要關(guān)注純化和超濾工藝及清洗驗證等步驟的效果。對生產(chǎn)工藝中的純化和超濾過程中的關(guān)鍵步驟加以控制，尤其是會影響游離小分子藥物的去除效果的步驟?？梢钥紤]對關(guān)鍵工藝步驟設(shè)置中控檢測（如藥物抗體偶聯(lián)比和純度等）。另外，對于其他的產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)，如產(chǎn)品的裸抗及其降解產(chǎn)物、連接子及其衍生物等相關(guān)雜質(zhì)，需要遵循工藝、毒理數(shù)據(jù)、穩(wěn)定性等，科學(xué)的對殘留限度進行設(shè)定。對于裸抗的去除，可以考慮通過離子交換層析等手段，根據(jù)ADC藥物和裸抗的表面電荷分布的差異，實現(xiàn)去除未偶聯(lián)的裸抗。

3.2 工藝相關(guān)雜質(zhì)的控制方法

ADC藥物中的另一大類雜質(zhì)是工藝相關(guān)雜質(zhì)。其中最主要的是殘留的有機溶劑。因此，偶聯(lián)反應(yīng)需要嚴格的遵循工藝流程，對于控制溶劑殘留的關(guān)鍵步驟，在相關(guān)的原液、成品中應(yīng)該重點關(guān)注。對于生產(chǎn)過程中使用的材料和設(shè)備，尤其是直接接觸偶聯(lián)反應(yīng)溶液的部分，需要耐受有機溶劑，應(yīng)對其可能的浸出物進行分析。運用的連接子具備親水性，能夠減少有機溶劑的運用，或者能夠避免運用，由此實現(xiàn)了蛋白聚集的減少，而且可以將治療指數(shù)提升。ADC的生產(chǎn)工藝的設(shè)計和控制需考慮可重現(xiàn)性和一致性，通過對關(guān)鍵工藝參數(shù)的控制（如投料比例、反應(yīng)體積、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間等），保證原液和成品的質(zhì)量的批間一致性，同時需要保證工藝相關(guān)雜質(zhì)和產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)始終處于可控的區(qū)間。

4. ADC藥物生物學(xué)活性的研究

研究期間，可根據(jù)ADC藥物的作用機制，設(shè)計科學(xué)合理的生物學(xué)活性檢測方法。選用合適的陽性細胞株構(gòu)建相應(yīng)的細胞毒性殺傷模型，進行驗證，在產(chǎn)品原液和成品批次檢驗等中進行運用。對于單抗部分的生物學(xué)活性，可通過抗體與抗原的結(jié)合活性進行表征和批次檢驗。對于生物活性的分析，通常采用四參數(shù) Logistic 回歸模型，計算藥物劑量與活性之間的關(guān)系。該模型中有四個參數(shù)，分別是：Top 是指最大響應(yīng); Bottom 是指基線響應(yīng);Hill Slope 是指曲線的坡度。 EC50 是最大有效濃度的一半。通采用回歸擬合后計算得到的EC50值，或者Top值來表征ADC藥物的生物學(xué)活性。四參數(shù) Logistic 方程有如下兩種形式：

1）一種是濃度 X 已經(jīng)用以 10 為底的對數(shù)做了變換的形式，其計算公式如下：

Y=Bottom+（Top-Bottom）/（1+10^（（LogEC50-X）*HillSlope））

2）一種是 X 沒有變換過，其計算公式如下：

Y=Bottom + （X^Hillslope）*（Top-Bottom）/（X^HillSlope + EC50^HillSlope）

對于任何一種方式，參數(shù)估計值、標準誤和置信區(qū)間都是相同的。

5. 結(jié)論與建議

ADC藥物具有非常復(fù)雜性的工藝，所以應(yīng)該重點進行控制生產(chǎn)用原材料、工藝流程設(shè)計、過程控制、穩(wěn)定性研究、工藝驗證等方面。按照臨床應(yīng)用的劑量、應(yīng)用的方式，在ADC 藥物的原液和制劑的質(zhì)量標準中進行增添常規(guī)檢項。DAR值緊密的關(guān)聯(lián)于藥物安全有效性，可以采取紫外分光光度法、反相色譜法、疏水色譜法和質(zhì)譜法（MS）等進行檢驗。檢測完整ADC藥物分子，可采取小分子藥物特異性抗體和抗體的靶標分子實施檢測。部分關(guān)鍵質(zhì)量屬性檢項，諸如純度和電荷異質(zhì)性等，落實互補的多種檢定技術(shù)。進行評價ADC藥物的異常毒性過程中，應(yīng)該密切的考慮到產(chǎn)品急性毒性試驗結(jié)果，進行給藥劑量的科學(xué)規(guī)定。

綜上所述，在ADC的質(zhì)量研究和質(zhì)量控制方面，應(yīng)該綜合考慮其產(chǎn)品特性、產(chǎn)品工藝等。開發(fā)藥物期間，變更是會產(chǎn)生的情況，所以質(zhì)量研究、質(zhì)量控制中，需要在產(chǎn)品的研發(fā)階段落實，對毒理、臨床、商業(yè)化生產(chǎn)批次之間的可比性進行分析考慮。未來期待產(chǎn)生更多樣化的具備創(chuàng)新作用機制的 ADC藥物，給患者臨床治療提供更好的福音。

參考文獻：

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[2]黃佳，王浩，鐘薇，陳岷. 抗體偶聯(lián)藥物戈沙妥組單抗在三陰性乳腺癌中的研究進展[J]. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2021，10（09）：1-5.

[3] 王蘭，郭莎，于傳飛，王文波，付志浩，霍艷，王欣，耿興超，劉麗，文海若，陳琰，Christopher Yu，藺亞萌，方言，房健民，姚雪靜，李新芳，胡朝紅，楊敬，Lise Loberg? . 抗體偶聯(lián)藥物質(zhì)量控制和臨床前評價專家共識 中國食品藥品檢定研究院

[4]齊連權(quán)，韋薇，常翠云，白玉，羅建輝. 抗體偶聯(lián)藥物及其質(zhì)量研究與質(zhì)量控制[J]. 中國新藥雜志，2019，28（12）：1428-1432.

撰寫日期：2022-04