白藜蘆醇調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路抑制膠質(zhì)瘤細胞的機制*

寧曉麗， 王炎， 余躍

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院 麻醉與疼痛科， 安徽 合肥 238000)

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最具有侵襲性的腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均居世界前列[1]。盡管隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，對于各類腫瘤的治療效果已經(jīng)取得了巨大進展，但是膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后仍然較差、死亡率較高，主要是因為膠質(zhì)瘤具有較強的增殖性和侵襲能力，因此對膠質(zhì)瘤患者的治療可考慮由其分子機制入手，抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移，提高凋亡率，以獲得較佳的臨床療效[2]。白藜蘆醇是花生、葡萄、虎杖等植物中廣泛存在的物質(zhì)，已有作為一種抗氧劑，能夠抑制血小板聚集、預(yù)防心腦血管疾病，臨床多將其用于對冠心病、動脈粥樣硬化、高血脂以及缺血性心臟病等患者的防治中[3]。白藜蘆醇可抑制多種細胞的增殖，促進腫瘤細胞凋亡，并在結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌、肝癌等的研究中獲得一定的效果，雖然尚未明確其具體作用機制，但是其作用效果仍為臨床治療膠質(zhì)瘤患者提供了新的方向[4]。Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對于胚胎的生長和形態(tài)發(fā)育具有一定調(diào)控作用，且Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路已經(jīng)明確與膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)[5]，因此本研究從白藜蘆醇對Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控作用來分析其對膠質(zhì)瘤細胞的作用機制，以期能為臨床治療提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 村料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞 由上海中國科學(xué)院細胞庫購入膠質(zhì)瘤細胞株U251，將其培養(yǎng)于高糖克改良伊格爾培養(yǎng)基(dulbecco modified eagle medium, DMEM)培養(yǎng)基(四季青公司，含10%胎牛血清、鏈霉素 10 mg/L、青霉素105 IU/L)，置于5%二氧化碳(carbon dioxide，CO2)、37 ℃的細胞恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細胞融合度為70%及以上時進行細胞傳代，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.1.2試劑與器材 試劑：胎牛血清(杭州江濱生物技術(shù)有限公司)、DMEM細胞培養(yǎng)液(美國Hyclone公司)、二甲基亞砜[百運渡(上海)生物科技有限公司]、Trizol試劑(美國Invitrogen公司)、噻唑藍(武漢卡諾斯科技有限公司)、CCK-8試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)、Annexin V/PI凋亡試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(伊艾博醫(yī)療有限公司)、實時定量PCR(real-time quantitative，qPCR)試劑盒(日本Toyobo公司)、碘化丙啶(PI，西安瑞禧生物科技有限公司)、四甲基偶氮唑鹽(MTT，美國Sigma公司)、磷酸緩沖鹽溶液(PBS，武漢普諾賽生命科技有限公司)、SYBR mix(碧云天生物技術(shù)有限公司)、注射用白藜蘆醇(扶風(fēng)斯諾特生物科技有限公司)。器材：超凈工作臺(山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司)、恒溫培養(yǎng)箱(無錫瑪瑞特科技有限公司)、電子天平(邢臺中德機械制造有限公司)、TGL-16臺式高速離心機(金壇市科析儀器有限公司)、酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)、流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1CCK-8試劑盒檢測細胞活性 將膠質(zhì)瘤細胞U251細胞接種于完全培養(yǎng)基(100 μL)的96孔板內(nèi)，密度為2×103細胞/孔，細胞貼壁后，分別于每孔內(nèi)加入0(對照組)、25(低劑量組)、50(中劑量組)以及100 μmol/L(高劑量組)的白藜蘆醇[6]進行24、48、72 h處理；并在各時間點處理完畢后棄去培養(yǎng)液，每孔內(nèi)加入100 μL二甲基亞砜，室溫下震蕩10 min，使用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測波長450 nm的吸光值(OD值)。

1.2.2Transwells小室檢測細胞遷移和侵襲情況 (1)遷移：在Transwell小室上室內(nèi)加入DMEM培養(yǎng)基(1 ∶8稀釋)，將0.5 g/L Fibronectin使用移液槍涂抹至下室面，置于5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)包被2 h，加Matrigel凝固成膠，置于4 ℃下過夜風(fēng)干；將所取U251細胞分別加入0(對照組)、25(低劑量組)、50(中劑量組)以及100 μmol/L(高劑量組)的白藜蘆醇干預(yù)24、48以及72 h；將細胞拿出小室，并吸去殘余液體，每小室內(nèi)加入100 μL的DMEM，置于37 ℃孵育30 min，水化基底膜。收集各組細胞，重懸于DMEM培養(yǎng)液內(nèi)，調(diào)整密度為5×107/L，接種于上室，下室內(nèi)加入10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(600 μL)，置于5%CO2、37 ℃下培養(yǎng)24 h，取出小室，PBS清洗2次，加入4%多聚甲醛室溫下固定15 min，PBS清洗2次，將上室面殘余細胞擦拭干凈，使用結(jié)晶紫染色15 min，使用200倍光鏡觀察穿膜細胞數(shù)，設(shè)3個獨立樣本，由兩位實驗人員平行觀測各2次；(2)侵襲：操作同遷移檢測實驗，各組細胞培養(yǎng)24、48以及72 h后，將小室上層細胞和Matrigel基質(zhì)膠輕擦后PBS洗滌3次，后續(xù)操作同遷移檢測，封片后拍照觀察6個視野的細胞計數(shù)。

1.2.3Annexin V/PI凋亡試劑盒檢測細胞凋亡率 收集白藜蘆醇處理的各組細胞，使用PBS清洗3次，25 ℃， Annexin V-FITC 5 μL和PI 10 μL對細胞懸液進行黑暗染色15 min，混勻置于2～8 ℃下孵育5 min，1 h內(nèi)使用流式細胞儀檢測細胞凋亡率，各設(shè)3個獨立樣本，由兩位實驗人員平行觀測各2次，依據(jù)散點圖計算各組細胞的凋亡率。

1.2.4Western blot檢測細胞Wnt3a、β-catenin蛋白表達 將對數(shù)生長期U251細胞內(nèi)加入蛋白酶抑制劑PMSF和RIPA裂解緩沖液，4 ℃下孵育30 min，以12 000 r/min的速率離心10 min(半徑7 cm)，分離細胞碎片。使用蛋白濃度定量法對蛋白濃度進行測定，加入蛋白上樣緩沖液煮沸蛋白5 min，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(90 min)，以分離蛋白；用濕轉(zhuǎn)法將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上(PVDF)，切取目的條帶PVDF膜，使用5%脫脂奶粉封閉液于室溫下封閉2h，分別加入一抗Wnt3a(1 ∶1 000)、β-catenin(1 ∶1 000)，置于4 ℃下反應(yīng)過夜；使用TBST洗膜3次、5 min/次，然后加入對應(yīng)二抗(稀釋比例均為1 ∶10 000)，置于37 ℃下孵育2 h，TBST洗膜2次、10 min/次，以β-actin為參照，電化學(xué)發(fā)光法顯影。

1.2.5RT-qPCR檢測Wnt3a、β-cateninmRNA表達 使用Trizol試劑盒提取U251細胞總RNA，使用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，在Bio-Rad IQ5 PCR儀上擴增，并檢測mRNA表達量。反應(yīng)體系為cDNA模板1 μL，SYBR mix 10 μL，20 μmol/L PCR上下游引物各1 μL，RNA無酶水20 μL。條件：95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，40個循環(huán)；72 ℃、30 s，72 ℃、10 min。β-catenin上游引物5′-CTGCAGGGGTCCTCTGTG-3′，下游引物5′-TGCATATGTCGCCACACC-3′；Wnt3a上游引物5′-GTCACCTAGCAAGCTGCCGAACC-3′，下游引物5′-CGACAGACAAAGCGTCCCTCAAG-3′。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細胞活性

與對照組相比，各白藜蘆醇培養(yǎng)組細胞培養(yǎng)24、48以及72 h時細胞活性均降低，且各白藜蘆醇培養(yǎng)組的細胞活性隨培養(yǎng)時間的延長而降低(P<0.05)；各培養(yǎng)時間下，低劑量組的細胞活性均最高，高劑量組均最低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.025)。見表1。

表1 不同培養(yǎng)時間下各組細胞的活性比較Tab.1 Comparison of cell viability at different time points in each

2.2 細胞侵襲實驗

與對照組相比，各白藜蘆醇培養(yǎng)組細胞培養(yǎng)24、48、72 h時細胞侵襲個數(shù)均減少，且各白藜蘆醇培養(yǎng)組的細胞侵襲個數(shù)均隨培養(yǎng)時間的延長而增加(P<0.05)；各培養(yǎng)時間下，低劑量組的細胞侵襲個數(shù)均最多，高劑量組均最少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.025)。見表2、圖1。

圖1 各組細胞的侵襲實驗結(jié)果(Transwells小室，×400)Fig.1 Cell Invasion at different time points in each group (Transwell chamber,×400)

表2 不同培養(yǎng)時間下各組的細胞侵襲個數(shù)比較Tab.2 Comparison of invading cell numbers at different time points in each

2.3 細胞遷移實驗

與對照組相比，各白藜蘆醇培養(yǎng)組細胞培養(yǎng)24 h、48 h、72 h時細胞遷移個數(shù)均減少，且各白藜蘆醇培養(yǎng)組的細胞遷移個數(shù)均隨培養(yǎng)時間的延長而增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；各培養(yǎng)時間下，低劑量組的細胞遷移個數(shù)均最多，高劑量組均最少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.025)。見表3、圖2。

表3 不同培養(yǎng)時間各組細胞遷移數(shù)比較Tab.3 Comparison of migrating cell numbers at different time points in each

圖2 不同培養(yǎng)時間各組細胞的遷移情況(Transwells小室，×400)Fig.2 Cell migration at different time points in each group (Transwell chamber,×400)

2.4 細胞凋亡率

與對照組相比，各白藜蘆醇培養(yǎng)組細胞培養(yǎng)24、48以及72 h時細胞凋亡率均升高，且各白藜蘆醇培養(yǎng)組的細胞凋亡率均隨培養(yǎng)時間的延長而增加(P<0.05)；各培養(yǎng)時間下，低劑量組的細胞凋亡率均最低，高劑量組均最高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.025)。見表4、圖3。

圖3 不同培養(yǎng)時間下各組細胞的凋亡情況Fig.3 Cellular apoptosis at different time points in each group

表4 不同培養(yǎng)時間下各組細胞的凋亡率比較Tab.4 Comparison of apoptotic rates at different time points in each

2.5 Wnt3a、β-catenin蛋白表達

與對照組相比，各白藜蘆醇培養(yǎng)組細胞培養(yǎng)72 h時Wnt3a、β-catenin蛋白表達均降低，且低劑量組的細胞Wnt3a、β-catenin蛋白表達最高，高劑量組最低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表5、圖4。

表5 各組細胞培養(yǎng)72 h時的Wnt3a、β-catenin蛋白表達Tab.5 The relative protein expression levels of Wnt3a and β-catenin at 72 h after the treatment in each

圖4 各組細胞培養(yǎng)72 h時的Wnt3a、β-catenin蛋白表達(Western blot)Fig.4 The protein expression levels of Wnt3a and β-catenin at 72 h after the treatment in each group (Western blot)

2.6 Wnt3a、β-catenin mRNA水平

與對照組相比，各白藜蘆醇培養(yǎng)組細胞培養(yǎng)72 h時Wnt3a、β-cateninmRNA水平均降低，且低劑量組的細胞Wnt3a、β-cateninmRNA水平最高，高劑量組最低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表6。

表6 各組細胞培養(yǎng)72 h時的Wnt3a、β-catenin mRNA水平Tab.6 The relative mRNA levels of Wnt3a and β-catenin at 72 h after the treatment in each

3 討論

Wnt/β-catenin信號通路是一個能夠調(diào)控胚胎發(fā)育、組織器官形成的高度保守通路，其能夠激活β-catenin，促使其在細胞核內(nèi)聚集，進而影響靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達，對細胞生長進行調(diào)控[7-8]。機體在正常狀態(tài)下的Wnt/β-catenin信號通路為抑制狀態(tài)，細胞內(nèi)的β-catenin及其他蛋白以復(fù)合物的形式存在于體內(nèi)，但當(dāng)機體遭受某些刺激時，泛素蛋白酶依賴的蛋白降解，進而促使機體內(nèi)β-catenin復(fù)合物降解成為β-catenin，導(dǎo)致機體內(nèi)β-catenin表達明顯升高，激活Wnt/β-catenin信號通路[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌、肝癌、舌鱗癌等多種癌癥患者體內(nèi)均存在β-catenin過度表達的情況，而給予患者Wnt/β-catenin信號通路抑制劑則能夠抑制肝癌細胞等癌細胞的生長、遷移能力，為臨床治療提供了新方向[11-12]。

白藜蘆醇作為植物內(nèi)常見的含有芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮類多酚化合物，早期研究發(fā)現(xiàn)其具有抗菌、抗炎、抑制血小板聚集、抗氧化、保肝、降血脂、平喘、鎮(zhèn)咳以及免疫調(diào)節(jié)等生物活性[13-14]。近年來，有學(xué)者指出白藜蘆醇可發(fā)揮抗腫瘤效果，如給予結(jié)腸癌細胞系HCT116白藜蘆醇培養(yǎng)，能夠?qū)Χ喾N信號傳導(dǎo)通路產(chǎn)生抑制，進而抑制癌細胞增殖[15-16]。細胞惡性增殖為腫瘤的生物特性之一，其主要機制為生物周期紊亂而導(dǎo)致的凋亡受阻和增殖過多，進而導(dǎo)致腫瘤細胞始終處于無法進入靜止期的增殖期，而使癌細胞快速增殖，加速病情進展[17-19]。本文研究結(jié)果顯示，給予膠質(zhì)瘤細胞U251白藜蘆醇干預(yù)后，其可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路抑制膠質(zhì)瘤細胞活性，減少細胞侵襲和遷移，促進細胞凋亡，且隨著白藜蘆醇劑量的升高而作用增強。胰島素樣生長因子-1能夠?qū)nt/β-catenin信號通路的下游激酶磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)及蛋白激酶B(Akt)產(chǎn)生刺激，進而增加Akt、糖原合成酶激酶3β(GSK3β)的磷酸化和細胞周期蛋白D1水平，促進腫瘤細胞增殖[20-21]。當(dāng)給予膠質(zhì)瘤U251白藜蘆醇干預(yù)時，其能夠抑制IGF-1誘導(dǎo)的IGF-1受體-Akt-Wnt信號傳導(dǎo)通路，進而下調(diào)IGF-1受體信號蛋白表達，抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖[22-23]。經(jīng)典Wnt信號通路中，β-catenin濃度為通路的中心地位，若為Wnt信號分子存在，則β-catenin被CKI和GSK3β磷酸化后進入蛋白酶體內(nèi)降解，而Wnt蛋白與受體結(jié)合，則能夠通過膜上信號引導(dǎo)APC復(fù)合體解體，促使機體內(nèi)β-catenin表達升高[24-25]。因此在本研究給予膠質(zhì)瘤細胞U251白藜蘆醇干預(yù)后，細胞內(nèi)異常聚集的β-catenin水平降低，進而抑制了c-Myc和cyclinD1基因的表達，進而發(fā)揮抑制膠質(zhì)瘤細胞生長的效果。但是白藜蘆醇如何降低異常聚集β-catenin表達，如何促使其降解，或者降低其轉(zhuǎn)錄的具體作用機制仍需要進一步探究。

綜上所述，白藜蘆醇可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路抑制膠質(zhì)瘤細胞活性，減少細胞侵襲和遷移，促進細胞凋亡。