PDLIM2對(duì)前列腺癌預(yù)后影響的生物信息學(xué)分析

樸松哲 鄭蘭 王鑫 何浩輝 柯莽

前列腺癌（prostate cancer,PCa）是男性常見的惡性腫瘤之一。據(jù)2021年全球統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)報(bào)告，PCa發(fā)病率居男性惡性腫瘤的第一位[1]。盡管PCa早期患者的治愈率有所提高，但轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)PCa，特別是去勢(shì)抵抗性 PCa（castration resistant prostate cancer,CRPC）患者的預(yù)后仍較差。目前，免疫療法在癌癥治療中被廣泛應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，PCa的腫瘤微環(huán)境表現(xiàn)為免疫抑制，因此免疫療法在轉(zhuǎn)移性PCa中的臨床獲益有限[2]。除派姆單抗被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability,MSI）和高腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutation burden,TMB）晚期實(shí)體腫瘤治療外，Sipuleucel-T療法仍是美國(guó)FDA批準(zhǔn)的唯一用于轉(zhuǎn)移性PCa的免疫療法。因此，探索一種能預(yù)測(cè)腫瘤免疫治療反應(yīng)性的生物標(biāo)志物和新的免疫治療靶點(diǎn)是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。PDLIM2基因位于人8號(hào)染色體（8p21.2）上，是輔肌動(dòng)蛋白相關(guān)LIM蛋白超家族成員之一，參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、細(xì)胞極化、細(xì)胞間連接的調(diào)節(jié)以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、免疫細(xì)胞識(shí)別等過程[3]。近來研究發(fā)現(xiàn)，PDLIM2參與免疫調(diào)節(jié)過程，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用[4]。相關(guān)研究報(bào)道，下調(diào)PDLIM2表達(dá)能明顯抑制CRPC樣癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲能力[4-6]。然而，目前關(guān)于PDLIM2在PCa中的表達(dá)及其與臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系尚不清楚。因此，本文利用生物信息學(xué)技術(shù)分析PDLIM2對(duì)PCa預(yù)后的影響，并深度挖掘其基因功能，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取 利用UCSC Xena數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.xebabrowser.net）下載癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）PCa的3級(jí)RNA序列數(shù)據(jù)、突變數(shù)據(jù)、臨床病理參數(shù)和生存期數(shù)據(jù)。

1.2 表達(dá)差異分析 利用R軟件（V4.0.3）limma、ggplot2程序包分析PCa組織與癌旁正常組織中PDLIM2 mRNA表達(dá)水平的差異。

1.3 表達(dá)驗(yàn)證 利用UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)（http://ualcan.path.uab.edu/）中的TCGA模塊比較PCa組織與癌旁正常組織中PDLIM2 mRNA表達(dá)水平及其啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平，并進(jìn)一步根據(jù)患者Gleason評(píng)分、分子亞型進(jìn)行分層分析。TCGA將PCa分為7個(gè)分子亞型，包括ERG融合、ETV1融合、ETV4融合、FLI1融合、SPOP突變、FOXA1突變、IDH1突變。利用HPA數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.proteinatlas.org）比較不同級(jí)別PCa組織中PDLIM2蛋白表達(dá)水平的差異，分析PDLIM2在細(xì)胞內(nèi)的定位。

1.4 生存分析 對(duì)TCGA的PCa RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素Cox回歸分析，比較PDLIM高、低表達(dá)（以PDLIM2 mRNA表達(dá)水平的中位數(shù)為界值）組患者總生存期（overall survival,OS）和無進(jìn)展生存期（progression free survival,PFS）。

1.5 PDLIM2共表達(dá)基因富集分析 使用Linked Omics數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.linkedomics.org/login.php）的 Link Finder模塊分析PCa隊(duì)列（479例）中與PDLIM2相關(guān)的差異表達(dá)基因，采用Spearman秩相關(guān)分析方法。使用Linked Omics數(shù)據(jù)庫(kù)的Link Interpreter模塊對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行通路和網(wǎng)絡(luò)分析，采用基因本體富集分析法。

1.6 PDLIM2與腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度、TMB、MSI、免疫檢查點(diǎn)（immune checkpoint，ICP）基因表達(dá)及腫瘤干性評(píng)分的相關(guān)性分析 利用Sanger Box數(shù)據(jù)庫(kù)查詢“PDLIM2”，采用TIMER算法分析PCa組織中PDLIM2 mRNA表達(dá)水平。利用基因模塊分析PDLIM2 mRNA表達(dá)水平與腫瘤免疫細(xì)胞（包括B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞）浸潤(rùn)程度、TMB、MSI、ICP基因表達(dá)及腫瘤干性評(píng)分之間的相關(guān)性，采用Pearson相關(guān)分析法。

2 結(jié)果

2.1 PCa組織與癌旁正常組織中PDLIM2 mRNA表達(dá)水平的差異 利用TCGA數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，PCa組織中PDLIM2 mRNA表達(dá)水平明顯低于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 PDLIM2表達(dá)驗(yàn)證和相關(guān)分析 利用UCLCAN數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，與癌旁正常組織相比，PCa組織中PDLIM2 mRNA 表達(dá)水平較低（P＜0.05），見圖 1a（插頁(yè)）；而PDLIM2啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平較高（P＜0.05），見圖1b（插頁(yè)）?；赥CGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析PCa組織中PDLIM2 mRNA表達(dá)水平與Gleason評(píng)分、分子分型的關(guān)系，結(jié)果顯示Gleason評(píng)分9分者PCa組織中PDLIM2 mRNA表達(dá)水平明顯高于6、7分者（均 P＜0.05），見圖1c（插頁(yè)）；與癌旁正常組織比較，ERG融合、ETV1融合、SPOP突變者PCa組織中PDLIM2 mRNA表達(dá)水平均明顯下調(diào)（均P＜0.05），其中SPOP突變者較ERG融合者PDLIM2 mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)（P＜0.05），見圖1d（插頁(yè)）。HPA數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中PDLIM2主要定位于細(xì)胞肌動(dòng)蛋白絲，黏附位點(diǎn)，見圖1e（插頁(yè)）。免疫組化結(jié)果顯示，隨PCa組織級(jí)別的升高，PDLIM2的染色強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，見圖1f（插頁(yè)）。

圖1 PDLIM2表達(dá)水平與PCa患者不同臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系和細(xì)胞定位結(jié)果（a：PCa組織與癌旁正常組織中PDLIM2 mRNA表達(dá)水平比較；b：PCa組織與癌旁正常組織中PDLIM2啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平比較；c：不同Gleason評(píng)分患者PCa組織中PDLIM2mRNA表達(dá)水平比較；d：不同分子亞型患者PCa組織中PDLIM2 mRNA表達(dá)水平比較；e：PDLIM2細(xì)胞定位；f：不同級(jí)別PCa組織中PDLIM2蛋白表達(dá)的免疫組化染色所見）

2.3 生存分析 利用TCGA數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，在PCa患者中，PDLIM2高表達(dá)者PFS明顯短于PDLIM2低表達(dá)者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而 PDLIM2高、低表達(dá)者OS比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 PDLIM2共表達(dá)基因富集分析 使用Linked Omics的功能模塊分析479例PCa患者在TCGA中的mRNA測(cè)序數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示PDLIM2與12 198個(gè)基因呈正相關(guān)，與7 852個(gè)基因呈負(fù)相關(guān)，見圖2a（插頁(yè)）；熱圖分析顯示，PDLIM2 mRNA表達(dá)與TSPAN4、LGALS1、GAS6、GYPC、LYL1 基因均呈正相關(guān)（rs=0.76、0.74、0.73、0.73、0.73，均 P＜0.05），與 SMARCC1、HOOK1、ZNF24、DNAJC16、FOXA1基因均呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.65、-0.62、-0.62、-0.61、-0.61，均 P＜0.05），見圖 2b-c（插頁(yè)）。與PDLIM2相關(guān)的基因主要富集在膠原代謝過程、整合素介導(dǎo)的信號(hào)通路、體液免疫反應(yīng)、白細(xì)胞遷移、IFN-γ產(chǎn)生、血管生成、急性炎癥反應(yīng)等生物學(xué)過程。

圖2 PDLIM2共表達(dá)基因富集分析結(jié)果（a：火山圖，綠色所示為下調(diào)基因，紅色所示為上調(diào)基因；b：與PDLIM2呈負(fù)相關(guān)的前50個(gè)基因的熱圖；c：與PDLIM2呈正相關(guān)的前50個(gè)基因的熱圖）

2.5 PDLIM2與腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度、TMB、MSI、ICP基因表達(dá)及腫瘤干性評(píng)分的相關(guān)性 PCa組織中PDLIM2 mRNA表達(dá)水平與B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞浸潤(rùn)程度均呈正相關(guān)（r=0.24、0.39、0.12、0.29、0.49、0.44，均 P＜0.05）；與 TMB、MSI均呈正相關(guān)（均 r＞0，均 P＜0.05）；與 38個(gè) ICP基因表達(dá)均呈正相關(guān)（均 r＞0，P＜0.05）；與腫瘤干性評(píng)分呈正相關(guān)（r=0.16，P＜0.05）。

3 討論

目前關(guān)于PDLIM2在腫瘤中的作用仍存在爭(zhēng)議。有文獻(xiàn)報(bào)道PDLIM2能夠調(diào)節(jié)乳腺上皮細(xì)胞極性，是抑制乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制[7]。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，上調(diào)PDLIM2表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞非錨定生長(zhǎng)[8]。Sun等[9]報(bào)道了PDLIM2在肺癌中受表觀遺傳抑制，并與程序性死亡受體1抑制劑治療的耐藥性和不良預(yù)后有關(guān)。而維生素D可直接上調(diào)PDLIM2表達(dá)，從而誘導(dǎo)乳腺浸潤(rùn)癌細(xì)胞中PDLIM2啟動(dòng)子區(qū)域的去甲基化[10]。以上結(jié)果均提示PDLIM2具有抑癌作用。然而，在雄激素非依賴性PCa細(xì)胞株DU145中PDLIM2表達(dá)明顯上調(diào)，而抑制PDLIM2表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞侵襲能力。此外，雄激素敏感的PCa細(xì)胞與CRPC樣癌細(xì)胞中的PDLIM2表達(dá)水平存在明顯差異。在雄激素敏感的PCa細(xì)胞中，PDLIM2過表達(dá)能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖能力；在CRPC樣癌細(xì)胞中，PDLIM2高表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞增殖、惡性轉(zhuǎn)化和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程[7]。以上研究結(jié)果說明PDLIM2同時(shí)具有促癌和抑癌作用，其作用可能與腫瘤類型和細(xì)胞環(huán)境等因素有關(guān)。此外，PDLIM2可能是PCa潛在的治療靶點(diǎn)。

本研究利用TCGA數(shù)據(jù)分析顯示，PDLIM2在PCa組織中呈低表達(dá)，且PCa組織中PDLIM2啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平高于癌旁正常組織；生存分析結(jié)果顯示，PDLIM2高表達(dá)的PCa患者PFS更短。Song等[11]報(bào)道PDLIM2啟動(dòng)子甲基化可下調(diào)PDLIM2 mRNA表達(dá)水平，與本研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PDLIM2 mRNA表達(dá)水平隨Gleason評(píng)分增高而升高，與Gleason 6、7分患者比較，Gleason 9分患者PCa組織中PDLIM2 mRNA表達(dá)水平明顯較高。HPA數(shù)據(jù)庫(kù)的免疫組化分析結(jié)果顯示，PDLIM2主要定位于細(xì)胞肌動(dòng)蛋白絲，黏附位點(diǎn)；且隨著PCa組織級(jí)別的升高，PDLIM2蛋白染色強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。這說明PDLIM2 mRNA表達(dá)水平與PCa組織分級(jí)有關(guān)，可能參與PCa發(fā)生、發(fā)展過程。本研究還分析了PCa中與PDLIM2共表達(dá)基因的生物學(xué)功能，結(jié)果顯示PDLIM2共表達(dá)基因主要富集在膠原代謝過程、整合素介導(dǎo)的信號(hào)通路、體液免疫反應(yīng)、白細(xì)胞遷移、IFN-γ產(chǎn)生、血管生成、急性炎癥反應(yīng)等生物學(xué)過程。研究發(fā)現(xiàn)，PDLIM2作為腫瘤抑制因子，通過抑制腫瘤相關(guān)基因，增加參與抗原呈遞和T細(xì)胞啟動(dòng)，說明PDLIM2在PCa中可能參與免疫微環(huán)境調(diào)節(jié)[12]。

TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果顯示，PCa組織中PDLIM2 mRNA表達(dá)水平與B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度均呈正相關(guān)。從理論上分析，具有高TMB、MSI的腫瘤患者對(duì)ICP抑制劑具有更高的敏感性。此外，ICP基因的高表達(dá)被廣泛作為免疫治療反應(yīng)的預(yù)測(cè)因子。本研究發(fā)現(xiàn)，PCa組織中PDLIM2 mRNA表達(dá)水平與TMB、MSI和ICP基因表達(dá)均呈正相關(guān)，說明PDLIM2可能是腫瘤免疫治療效果的潛在預(yù)測(cè)因子。2021年美國(guó)國(guó)家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)指南在M1期CRPC全身治療中考慮新增TMB檢測(cè)，并提出帕博麗珠單抗用于高M(jìn)SI或錯(cuò)配修復(fù)缺陷（different mismatch repair,dMMR）或TMB≥10 mut/Mb的M1期CRPC患者。但目前關(guān)于TMB在PCa免疫治療中的預(yù)測(cè)價(jià)值結(jié)果并不一致，可能與TMB算法不同有關(guān)[13]。Abida等[14]發(fā)現(xiàn)在1 033例轉(zhuǎn)移性CRPC患者中，有32例表現(xiàn)為高M(jìn)SI，其中11例接受基于ICP抑制劑的治療，近半數(shù)患者前列腺特異抗原水平下降幅度＞50%。Schweizer等[15]基于小樣本研究發(fā)現(xiàn)，10例PCa導(dǎo)管內(nèi)癌患者中有4例為dMMR，其中3例患者具有高M(jìn)SI特征；值得注意的是，其中1例dMMR/高M(jìn)SI患者在使用派姆單抗治療期間，前列腺特異抗原水平明顯降低。以上結(jié)果說明PDLIM2高表達(dá)的PCa患者可能對(duì)免疫療法更加敏感，可能從免疫治療中獲益，但仍需作進(jìn)一步研究證實(shí)。此外，PCa組織中PDLIM2表達(dá)水平與腫瘤干性評(píng)分呈正相關(guān)，說明PDLIM2可能促進(jìn)PCa腫瘤干性特征的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤發(fā)展。Dai等[16]研究發(fā)現(xiàn)，PCa的TME與其干細(xì)胞性呈負(fù)相關(guān)。Miranda等[17]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞干細(xì)胞可影響TME的免疫應(yīng)答，從而導(dǎo)致腫瘤異質(zhì)性。以上結(jié)果提示在PCa中，PDLIM2可能通過免疫調(diào)節(jié)來影響腫瘤細(xì)胞干性。

綜上所述，PDLIM2可能成為評(píng)估PCa預(yù)后的生物標(biāo)志物和腫瘤免疫治療的新靶點(diǎn)。但本研究結(jié)果是基于生物信息學(xué)技術(shù)分析的，仍需進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。