HOXB5對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞有氧糖酵解和惡性增殖的影響

潘烽平 李彥 張明明

據(jù)2018年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)報(bào)告，每年因結(jié)直腸癌（colorectal cancer,CRC）死亡超過(guò) 700 000例[1]。在我國(guó)，多數(shù)CRC患者確診時(shí)已經(jīng)處于進(jìn)展期，對(duì)于這部分患者，目前的手術(shù)和輔助治療效果有限且不良反應(yīng)較大[2-3]，患者預(yù)后欠佳[4]。因此，深入了解CRC發(fā)生及發(fā)展的分子機(jī)制至關(guān)重要。正常細(xì)胞主要依靠線粒體的氧化磷酸化供能，而腫瘤細(xì)胞即使在氧氣充足的條件下，依然優(yōu)先通過(guò)有氧糖酵解途徑來(lái)提供能量，該現(xiàn)象稱為 Warburg效應(yīng)[5]。研究表明，癌基因、抑癌基因在腫瘤有氧糖酵解過(guò)程中發(fā)揮重要作用[6]，例如在胰腺癌中，UHRF1通過(guò)轉(zhuǎn)錄抑制SIRT4來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的有氧糖酵解和增殖[7]；在CRC中，B7-H3調(diào)控HK2來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的有氧糖酵解和化療抵抗，從而影響患者的預(yù)后[8]。同源盒蛋白（homeobox protein,HOX）B5是一種新型轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控。相關(guān)研究表明，HOXB5參與人類(lèi)多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，例如在胰腺癌中，HOXB5通過(guò)激活GSK3β/β-catenin通路來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移和侵襲[9]；在雌激素受體陽(yáng)性的乳腺癌中，HOXB5能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[10]；在CRC中，HOXB5的高表達(dá)與患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、高臨床分期和預(yù)后不良呈正相關(guān)[11]。但尚無(wú)研究證明HOXB5是否能通過(guò)調(diào)節(jié)CRC細(xì)胞代謝來(lái)參與癌變過(guò)程。因此，本研究就HOXB5對(duì)CRC細(xì)胞有氧糖酵解和惡性增殖的影響作一探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人 CRC細(xì)胞株（SW480、Lovo、Caco2、HCT116）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。將細(xì)胞株置于含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)。每1～2 d使用胰蛋白酶消化傳代1次，保持細(xì)胞活力，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 細(xì)胞選擇 內(nèi)源性HOXB5蛋白表達(dá)水平在Caco2細(xì)胞中最低，在 SW480、Lovo細(xì)胞中次之，在HCT116細(xì)胞中最高，見(jiàn)圖1。故本實(shí)驗(yàn)選擇Caco2細(xì)胞用于過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，HCT116細(xì)胞用于敲低實(shí)驗(yàn)。

圖1 HOXB5在CRC細(xì)胞系中表達(dá)的電泳圖

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 過(guò)表達(dá)HOXB5的質(zhì)粒、敲低HOXB5的質(zhì)粒、對(duì)照質(zhì)粒均購(gòu)自蘇州吉瑪公司。將細(xì)胞（3×104個(gè)/孔）均勻接種至24孔板內(nèi)，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合度約70%時(shí)，按照Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)步驟將目的質(zhì)粒、對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.4 HOXB5對(duì)CRC細(xì)胞增殖能力影響的檢測(cè) 采用CCK-8法。將細(xì)胞（3×103個(gè)/孔）鋪在96孔板中培養(yǎng)，每24 h測(cè)定一次細(xì)胞活力。每次測(cè)量時(shí)加入10 μl CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱中孵育2 h，然后使用分光光度計(jì)測(cè)量每個(gè)樣品波長(zhǎng)450 nm處的吸光度（OD450）值。每組測(cè)量3孔，取平均值。

1.5 HOXB5對(duì)CRC細(xì)胞平板克隆形成能力影響的檢測(cè) 采用平板克隆實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞（4×104個(gè)/孔）接種至6孔板中，并在含10%FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周。甲醇固定菌落，結(jié)晶紫染色，采集圖像并計(jì)數(shù)平板克隆形成數(shù)。

1.6 HOXB5對(duì)CRC細(xì)胞有氧糖酵解影響的檢測(cè)（1）葡萄糖消耗量檢測(cè)：按照葡萄糖檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，將細(xì)胞（3×104個(gè)/孔）接種至96孔板中，常規(guī)培養(yǎng)，生長(zhǎng)過(guò)夜。第2天將培養(yǎng)基移除，PBS清洗3次，加入100 μl無(wú)葡萄糖的培養(yǎng)基（含 150 μg/ml的 2-NBDG溶液），培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間。移除上清液，加入200 μl cellbased Assay Bufffer溶液，369 r/min 離心 5 min；移除上清液，加入 200 μl cell-based Assay Bufffer溶液，立即上機(jī)檢測(cè)。（2）乳酸含量檢測(cè)：按照乳酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，將1×106個(gè)細(xì)胞溶于100 μl乳酸檢測(cè)緩沖液中，12 000 r/min離心10 min，移除雜質(zhì)、過(guò)濾掉乳酸脫氫酶后，取10 μl加入96孔板中，加入適量乳酸檢測(cè)緩沖液調(diào)節(jié)體積至50 μl；再加入50 μl反應(yīng)工作液至96孔板中充分混勻，室溫、避光孵育30 min；使用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)。（3）ATP含量檢測(cè)：按照ATP檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，將2×106個(gè)細(xì)胞溶于100 μl ATP檢測(cè)緩沖液中，12 000 r/min離心11 min，吸取上清液后，取11 μl加入96孔板中，加入適量ATP檢測(cè)緩沖液調(diào)節(jié)體積至52 μl。再加入50 μl反應(yīng)工作液至96孔板中充分混勻，室溫、避光孵育30 min；使用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)。

1.7 HOXB5對(duì)CRC細(xì)胞糖酵解相關(guān)蛋白影響的檢測(cè) 采用Western blot法。將細(xì)胞平鋪在6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到75%時(shí)，用 PBS洗滌細(xì)胞并用 RIPA裂解液裂解。然后將裂解物置于冰上進(jìn)行超聲處理，4℃、13 000 r/min離心5 min，去除細(xì)胞碎片。經(jīng)過(guò)蛋白濃度測(cè)定、蛋白變性等步驟制作蛋白樣品。將樣品在12.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳（30 μg/泳道）中溶解并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上。在4℃下，使用適當(dāng)抗體探測(cè)膜過(guò)夜。洗滌3次后，將膜置于辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗中室溫下孵育2 h；采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯示蛋白質(zhì)條帶。實(shí)驗(yàn)中使用到的抗體有丙酮酸激酶同工酶 2（pyruvate kinase isoenzyme,PKM2）抗體（1∶1 000）、乳酸脫氫酶 A（lactate dehydrogenase A,LDHA）抗體（1∶1 000）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 1（glucose transporter 1，GLUT1）抗體（1∶1 000），均購(gòu)自英國(guó) Abcam 公司。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HOXB5對(duì)CRC細(xì)胞增殖能力的影響 在Caco2細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)HOXB5能明顯增強(qiáng)細(xì)胞增殖能力（P＜0.05）；在HCT116細(xì)胞中，敲低HOXB5能明顯減弱細(xì)胞增殖能力（P＜0.05），見(jiàn)圖 2。

圖2 HOXB5對(duì)CRC細(xì)胞增殖能力的影響（a：過(guò)表達(dá)HOXB5對(duì)Caco2細(xì)胞增殖能力的影響，*P＜0.05；b：敲低HOXB5對(duì)HCT116細(xì)胞增殖能力的影響，*P＜0.05）

2.2 HOXB5對(duì)CRC細(xì)胞平板克隆形成能力的影響在Caco2細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)HOXB5能明顯增強(qiáng)細(xì)胞平板克隆形成能力（P＜0.05）；在HCT116細(xì)胞中，敲低HOXB5能明顯減弱細(xì)胞平板克隆形成能力（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 HOXB5對(duì)CRC細(xì)胞平板克隆形成能力的影響（a：過(guò)表達(dá)HOXB5對(duì)Caco2細(xì)胞平板克隆形成能力的影響，*P＜0.05；b：敲低HOXB5對(duì)HCT116細(xì)胞平板克隆形成能力的影響，*P＜0.05）

2.3 HOXB5對(duì)CRC細(xì)胞有氧糖酵解的影響 在Caco2細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)HOXB5能明顯增加細(xì)胞葡萄糖消耗量以及乳酸、ATP含量（均P＜0.05）；在HCT116細(xì)胞中，敲低HOXB5能明顯減少細(xì)胞葡萄糖消耗量以及乳酸、ATP含量（均 P＜0.05），見(jiàn)圖 4。

2.4 HOXB5對(duì)CRC細(xì)胞糖酵解相關(guān)蛋白的影響在Caco2細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)HOXB5能明顯上調(diào)PKM2、LDHA、GLUT1蛋白表達(dá)水平（均 P＜0.05）；在 HCT116細(xì)胞中，敲低 HOXB5能明顯下調(diào) PKM2、LDHA、GLUT1蛋白表達(dá)水平（均P＜0.05），見(jiàn)圖5。

圖5 過(guò)表達(dá)或敲低HOXB5后CRC細(xì)胞糖酵解相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖

3 結(jié)論

在惡性腫瘤的發(fā)展過(guò)程中，整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)在癌基因、抑癌基因主導(dǎo)下發(fā)生“重編程”，而營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在代謝網(wǎng)絡(luò)中的流向和流量被重新定義。相較于正常細(xì)胞，癌細(xì)胞內(nèi)葡萄糖攝取和糖酵解速率明顯增加，高速糖酵解能快速產(chǎn)生ATP，不再偶聯(lián)線粒體氧化代謝，產(chǎn)生的丙酮酸大多數(shù)由乳酸脫氫酶催化，在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中轉(zhuǎn)化為乳酸。即使在氧氣充足支持氧化磷酸化的情況下，惡性腫瘤細(xì)胞仍青睞糖酵解作為主要產(chǎn)能途徑，這種糖代謝的“重編程”是癌細(xì)胞的一個(gè)顯著特征，該現(xiàn)象被稱為 Warburg效應(yīng)或有氧糖酵解[12]。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，有氧糖酵解對(duì)于多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖至關(guān)重要，可能是聯(lián)系惡性腫瘤細(xì)胞能量代謝與促增殖表型的一個(gè)普遍機(jī)制[13]。

越來(lái)越多研究表明，HOX家族在人類(lèi)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，且參與腫瘤細(xì)胞異常代謝的過(guò)程。研究表明，HOXC9調(diào)節(jié)鼻咽癌細(xì)胞糖酵解過(guò)程，并促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[14]。此外，也有研究證實(shí)HOXB5參與胰腺癌[15]、頭頸部鱗癌[16]、乳腺癌[17]、肺癌[18]、胃癌[19]等多種腫瘤的癌變過(guò)程。在CRC中，HOXB5高表達(dá)是患者腫瘤復(fù)發(fā)和預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。在機(jī)制方面，HOXB5過(guò)表達(dá)可通過(guò)反式激活CXCR4、ITGB3來(lái)促進(jìn)CRC轉(zhuǎn)移[11]。然而，目前尚無(wú)研究探討并明確HOXB5能否通過(guò)調(diào)節(jié)CRC有氧糖酵解過(guò)程來(lái)參與癌變過(guò)程。本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)HOXB5可以明顯增強(qiáng)Caco2細(xì)胞增殖及平板克隆形成能力，增加Caco2細(xì)胞葡萄糖消耗量以及糖酵解產(chǎn)物乳酸和ATP含量，上調(diào)糖酵解相關(guān)蛋白PKM2、LDHA和GLUT1蛋白表達(dá)水平；而敲低HOXB5可以明顯減弱HCT116細(xì)胞增殖及平板克隆形成能力，減少HCT116細(xì)胞葡萄糖消耗量以及糖酵解產(chǎn)物乳酸、ATP含量，下調(diào)糖酵解相關(guān)蛋白PKM2、LDHA、GLUT1蛋白表達(dá)水平。

綜上所述，本研究證實(shí)HOXB5通過(guò)促進(jìn)CRC細(xì)胞有氧糖酵解來(lái)增強(qiáng)其惡性增殖。但關(guān)于HOXB5調(diào)控有氧糖酵解的具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究明確。