間充質(zhì)干細(xì)胞染色體制片技術(shù)的優(yōu)化

夏福祥

摘要：近年來，在細(xì)胞醫(yī)學(xué)方面對于間充質(zhì)干細(xì)胞的有關(guān)研究逐漸增多。間充質(zhì)干細(xì)胞作為干細(xì)胞的一種，具有較強(qiáng)的分化潛能以及自我調(diào)控等特點(diǎn)。在國內(nèi)外對間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用的諸多研究實(shí)踐當(dāng)中，為能夠迅速擴(kuò)大我國間充質(zhì)干細(xì)胞品種的商品化生產(chǎn)面積及盡快滿足國內(nèi)外臨床及應(yīng)用中的特殊需求，對國內(nèi)外間充質(zhì)干細(xì)胞染色體的制片與技術(shù)問題進(jìn)行開展了一系列各項(xiàng)深入研究探索與方案不斷得到優(yōu)化，本文擬對有關(guān)間充質(zhì)干細(xì)胞染色體的相關(guān)研究成果進(jìn)行一個總結(jié)，并將討論今后在其他各項(xiàng)臨床研究項(xiàng)目中的關(guān)于間充質(zhì)干細(xì)胞染色體的制片方面的技術(shù)，以期能夠滿足間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用需求。

關(guān)鍵詞：間充質(zhì)干細(xì)胞;染色體制片;細(xì)胞遺傳學(xué);技術(shù)優(yōu)化

引言：

間充質(zhì)干細(xì)胞最早于骨髓中被發(fā)現(xiàn)，但目前在胚胎中所提取的間充質(zhì)干細(xì)胞由于其活性及分化特性等方面較骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞更優(yōu)良，因此在國內(nèi)外受到廣泛關(guān)注。MSC胚胎也有可能由單獨(dú)地在同一病人患者體內(nèi)或同一患者的體外胚胎直接地受宿主機(jī)體各種特定生物代謝活動條件等方面的基因誘導(dǎo)的影響情況下分化并發(fā)育增殖為寄主機(jī)體上各種功能相關(guān)的組織細(xì)胞，在進(jìn)行體內(nèi)胚胎傳代分化后的培養(yǎng)與增殖過程及經(jīng)體內(nèi)低溫冷凍保存和增殖處理后胚胎仍可能依然發(fā)育保持并具有表現(xiàn)了其一定或高度發(fā)育的各種遺傳功能分化特性和生殖潛能，我國醫(yī)學(xué)現(xiàn)階段目前對于體外MSC的研究及的一些臨床及應(yīng)用領(lǐng)域主要是集中在于臨床上與在臨床中用于早期診斷或治療疾病的脊髓骨損傷、腦癱、系統(tǒng)性紅斑狼瘡綜合征后遺癥及小兒脊髓系統(tǒng)性硬化癥綜合征后等多種神經(jīng)疾病診治中，大部分臨床研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果都令人滿意，因此逐漸將MSC的生產(chǎn)及應(yīng)用擴(kuò)大，并對其進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制。

一、間充質(zhì)干細(xì)胞概述

MSC是最早的于哺乳動物骨髓細(xì)胞中而被研究發(fā)現(xiàn)，但是作為骨髓來源之一的MSC還存在難以制備難以質(zhì)控、移植骨髓易脫落引起自體免疫反應(yīng)降低等嚴(yán)重問題，2006年，我國科研人員于哺乳動物胎盤內(nèi)及動物臍帶組織內(nèi)中均分離培養(yǎng)出了MSC，這種骨髓來源還可永久保持原MSC的生物學(xué)特性，并且便于質(zhì)控，冷凍后細(xì)胞損失較小，不易被感染。一般認(rèn)為骨髓干細(xì)胞MSC移植具有很強(qiáng)大的分裂增殖復(fù)制能力和胚胎多反向地分化生長潛能，具有細(xì)胞免疫功能調(diào)節(jié)免疫功能，異體細(xì)胞移植胚胎排異較輕，在對MSC的質(zhì)量控制當(dāng)中大部分在于加強(qiáng)對MSC染色體制片技術(shù)等方面。

二、間充質(zhì)干細(xì)胞染色體制片

染色體制片常用于對植物細(xì)胞進(jìn)行制片，一般步驟包括對細(xì)胞的處理與固定、解離、染色、壓片等等，需要重點(diǎn)和注意到的這一點(diǎn)尤其是我們在進(jìn)行染色體制片試驗(yàn)的時候也特別地需要著重去關(guān)注到細(xì)胞分裂相數(shù)的相對數(shù)量多少與染色體形態(tài)。首先對于人體骨髓細(xì)胞的染色體制片中，常用秋水仙素進(jìn)行制片前細(xì)胞處理，主要原因在于秋水仙素能夠使骨髓細(xì)胞保持在分裂中期，在制片后進(jìn)行觀察時能夠觀察出組織形態(tài)良好的細(xì)胞組織。所需建議使用的秋水仙素濃度量為10μg/mL，然后放置于在37℃的培養(yǎng)箱環(huán)境中培養(yǎng)60min[1]。另外對于干細(xì)胞染色體制片還需注意低滲時間及室溫關(guān)系、固定液比例及固定次數(shù)、離心速度及時間、沖洗過程及制片過程等等。在廖繼東對胎肝干細(xì)胞抗原陽性細(xì)胞的研究過程中，對于細(xì)胞切片的制片工作中，載玻片是用多聚糖賴氨酸進(jìn)行處理，在細(xì)胞切片制成后于60℃加熱，過夜固定[2]。在方利君等對家兔骨髓MSCs的體外培養(yǎng)試驗(yàn)當(dāng)中，選用了2.5g/L的胰酶室溫進(jìn)行消化約5-10min時間[3]，在唐濤進(jìn)行的MSC抑制大鼠骨關(guān)節(jié)炎作用的研究實(shí)驗(yàn)研究當(dāng)中，將骨髓MSC暴露于約37℃、5%的CO2的飽和濕度環(huán)境進(jìn)行體外培養(yǎng)，0.25%的胰蛋白酶進(jìn)行體外消化試驗(yàn)[4]，在MSC體內(nèi)向骨骼肌樣細(xì)胞分化生實(shí)驗(yàn)中將胚胎與MSC胚胎同樣保存于溫度37℃、體積分?jǐn)?shù)大于5%和CO2超飽和高濕度空氣中進(jìn)行培養(yǎng)，用0.25%的胰酶液在室溫37℃狀態(tài)下進(jìn)行消化約1小時-5min[5]。在國外對MSC細(xì)胞的分離培養(yǎng)及其制片加工過程實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，隨著科學(xué)家對純化MSC技術(shù)研究領(lǐng)域的了解不斷得到深入，在細(xì)胞處理分離方面，常分別使用了密度梯度離心法、貼壁篩選法及對流式細(xì)胞儀分選法純化等純化方法來直接獲得純度較優(yōu)純化的純化MSC的細(xì)胞，以進(jìn)行染色體制片過程[6]。在歐陽明玥的研究當(dāng)中，MSC的處理經(jīng)DPBS洗滌兩次后，在室溫下450×g離心5 min進(jìn)行離心，保障干細(xì)胞獲得良好的分裂相[7]。在對大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)研究當(dāng)中，李延清對離心時間進(jìn)行了測試，選取其中離心程度最佳的離心速度與實(shí)踐進(jìn)行細(xì)胞分離操作[8]。較快的離心速度或較長的離心時間都容易造成細(xì)胞破裂，影響制片，因此一般離心速度都在1000轉(zhuǎn)/min之內(nèi)，時間小于10min。孫亞東對人胎兒肺間充質(zhì)干細(xì)胞染色體的制備便采用1000r/min離心5min來獲取細(xì)胞，然后從細(xì)胞膜的破損率來確定制片所需的最佳低滲處理時間。低滲可以使細(xì)胞膨脹，從而促進(jìn)染色體在細(xì)胞內(nèi)均勻地分散開來，制成良好的染色體標(biāo)本[9]。

間充質(zhì)不僅能從骨髓中獲得，目前也有研究從羊水間獲取間充質(zhì)干細(xì)胞，在對其進(jìn)行培養(yǎng)制片時，用2-3μg/ml 的秋水仙素對細(xì)胞進(jìn)行前處理，培養(yǎng)4-6h，再以1000 r/min的速度離心10 min，37℃低滲5 min，在預(yù)固定與固定中均在加入固定液之后，以1000 r/min 離心5 min，再進(jìn)行烤片、顯帶與染色[10]。在對人外周血骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，采用了密度梯度離心技術(shù)的方法，經(jīng)5%C02，37℃，飽和濕度條件下進(jìn)行干細(xì)胞培養(yǎng)后，用0.25%胰酶對細(xì)胞進(jìn)行消化[11]。在對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離與純化等課題研究項(xiàng)目當(dāng)中，均認(rèn)為是在37℃，5%的CO2低飽和的濕度狀態(tài)下進(jìn)行離心培養(yǎng)，而張本斯則是采用密度梯度離心法，在每分鐘1000轉(zhuǎn)/min條件下連續(xù)離心培養(yǎng)10min，用胰蛋白酶進(jìn)行體外消化試驗(yàn)[12]，在肖鑾娟的分離純化實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，應(yīng)用0.25%的胰蛋白酶及0.02%EDTA進(jìn)行消化功能培養(yǎng)，對MSC進(jìn)行預(yù)處理[13]。

三、間充質(zhì)干細(xì)胞染色體制片技術(shù)的優(yōu)化

從上述對間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行染色體制片的研究當(dāng)中，對MSC進(jìn)行染色體制片時，首先需對MSC進(jìn)行培養(yǎng)，大多數(shù)研究都是采用秋水仙堿來進(jìn)行處理分散干細(xì)胞內(nèi)的染色體，由此來確定低滲溶液的濃度，再用胰酶來進(jìn)行消化。在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，均是采用0.25%的胰酶來對細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)進(jìn)行消化，然后進(jìn)行離心。低滲溶液則為KCL溶液，在37℃下進(jìn)行，低滲時間根據(jù)實(shí)驗(yàn)不同而不同，然后在預(yù)固定及固定當(dāng)中，也需進(jìn)行離心，再進(jìn)行烤帶、顯帶與染色。陳茂勝對間充質(zhì)干細(xì)胞染色體制片技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，他采用20μg/ml的秋水仙堿培養(yǎng)2h10min，用0.05%胰酶在37℃下進(jìn)行消化，以1500rpm離心10min，由此來確定低滲溶液的濃度及低滲時間[14]。吳雄志在對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的研究中則使用胰蛋白酶進(jìn)行了20min的消化[15]。在進(jìn)行低滲濾液操作時，國外一般控制在15-30℃之間，控制在20min以內(nèi)，而國內(nèi)則大多數(shù)控制在37℃之內(nèi)，并且對低滲的時間與控制室溫度還需分別進(jìn)行分析及計算，以實(shí)驗(yàn)室溫度為分析基礎(chǔ)來分別計算得出最佳的低滲時間，低滲濃度常為0.075mol/L。在預(yù)埋固定與固定試驗(yàn)當(dāng)中，需嚴(yán)格確定固定液量的使用比例范圍及固定的次數(shù)，實(shí)驗(yàn)室工作中最常用的冰醋酸：甲醇=1：2/1：3進(jìn)行固定，來保證染色體的形狀保持原樣，在進(jìn)行預(yù)固定及固定時也需進(jìn)行離心操作，然后再進(jìn)行烤片等過程。在滴加染液進(jìn)行染色時，一般采用移液器吸取10μl，再蓋上玻片。這種方法能夠保證MSC細(xì)胞染色均勻，且操作簡單[16]。在反復(fù)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)工作當(dāng)中，確定出能夠保證獲得最佳數(shù)據(jù)質(zhì)量的處理液體濃度、離心時間、固定液比例等等，干細(xì)胞的細(xì)胞密度越大，分析效果越好，因此可從細(xì)胞密度來對MSC染色體制片的質(zhì)量進(jìn)行把控，提高制片質(zhì)量，為后期的MSC研究提供便利。

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