十棗湯對(duì)肺纖維化大鼠肺組織層粘連蛋白和血小板衍生生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響

牛曉 王燕青 逄舒婷 宋潤(rùn)琪 趙曉婷

摘要 目的：通過(guò)檢測(cè)博來(lái)霉素誘導(dǎo)肺纖維化大鼠肺組織層粘連蛋白（LN）和血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）的水平，初步探討十棗湯抗肺纖維化可能的作用機(jī)制。方法：以雄性無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)SD大鼠為研究對(duì)象，將96只SD大鼠隨機(jī)分為6組：空白組、模型組、吡啡尼酮組、十棗湯低劑量組、十棗湯中劑量組、十棗湯高劑量組，每組16只。采用氣管內(nèi)注入博萊霉素的方法建立肺纖維化模型。造模后第2天，空白組及模型組大鼠每日灌胃生理鹽水2 mL，吡非尼酮組每日灌胃吡非尼酮溶液2 mL，十棗湯低、中、高劑量組分別灌胃低、中、高濃度的十棗湯2 mL，每周3次，其余時(shí)間每日灌胃生理鹽水2 mL。于第14天各組隨機(jī)處死8只大鼠（模型組、十棗湯低劑量組7只），第28天處死其余大鼠，取肺組織。HE染色觀察肺組織病理學(xué)變化，ELISA法檢測(cè)肺組織中LN和PDGF的濃度。結(jié)果：與空白組比較，模型組出現(xiàn)典型肺纖維化改變，肺組織中LN和PDGF表達(dá)水平明顯升高（均P<0.01）;與模型組比較，各藥物觀察組肺纖維化程度明顯減輕，肺組織LN和PDGF的表達(dá)水平明顯降低（均P<0.01）;十棗湯高劑量組肺組織LN和PDGF的表達(dá)水平較其他組顯著降低（均P<0.01）。吡啡尼酮組與十棗湯中劑量組大鼠肺組織LN及PDGF表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）。結(jié)論：十棗湯能夠改善博來(lái)霉素所致大鼠肺纖維化，其作用機(jī)制可能與抑制肺組織中LN和PDGF的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 特發(fā)性肺纖維化;十棗湯;層粘連蛋白;血小板衍生生長(zhǎng)因子;博來(lái)霉素;SD大鼠;吡非尼酮;峻下逐水法

Effect of Shizao Decoction on Expression of LN and PDGF in Lung Tissues of Rats with Pulmonary Fibrosis

NIU Xiao1，WANG Yanqing2，PANG Shuting3，SONG Runqi4，ZHAO Xiaoting1

（ Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji′nan 250000，China; 2 Hiser Medical Center of Qingdao，Qingdao 266000，China; 3 The West Coast New District Second Traditional Chinese Hospital，Qingdao 266000，China; 4 Jiaozhou People′s Hospital，Qingdao 266000，China）

Abstract Objective：To investigate the underlying mechanism of Shizao Decoction against bleomycin-induced idiopathic pulmonary fibrosis in rats based on the levels of laminin（LN） and platelet-derived growth factor（PDGF）.Methods：A total of 96 SPF SD rats were randomized into the blank group，model group，pirfenidone group，and low-dose，medium-dose group，and high-dose Shizao Decoction groups，with 16 in each group.Pulmonary fibrosis was induced in rats by intratracheal injection of bleomycin.From the second day after modeling，rats in the blank group and the model group were given（i.g.） 2 mL normal saline each day and those in the pirfenidone group received（i.g.） 2 mL of pirfenidone solution each day.Moreover，and 2 mL of low-，medium-，and high-concentration of Shizao Decoction was given（i.g.） to the three Shizao Decoction groups，respectively，three times a week，and 2 mL of normal saline was given for the rest of the time.Eight rats（7 in model group and low-dose Shizao Decoction group） were killed in each group on the 14th day and the rest were killed on the 28th day.Lung tissues were collected and the pathological changes were observed based on hematoxylin-eosin（HE） staining.The concentration of LN and PDGF in lung tissues was detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.Results：Compared with the blank group，the model group showed typical pulmonary fibrosis and increase in the concentration of LN and PDGF in lung tissues（P<0.01）.Compared with the model group，the administration groups demonstrated significant alleviation of pulmonary fibrosis and obvious reduction in the concentration of LN and PDGF in lung tissues（P<0.01）.The concentration of LN and PDGF in lung tissues in high-dose Shizao Decoction group was lower than that in other groups（P<0.01）.The levels of LN and PDGF in lung tissues were insignificantly different between the pirphenidone group and the medium-dose Shizao Decoction group（P>0.05）.Conclusion：Shizao Decoction relieves the bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats by inhibiting the expression of LN and PDGF in lung tissues.

Keywords Idiopathic pulmonary fibrosis; Shizao Decoction; LN; PDGF; Bleomycin; SD rats; Pirphenidone; Drastic hydragogue method

中圖分類號(hào)：R289.4;R563文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.05.017

特發(fā)性肺纖維化（Idiopathic Pulmonary Fibrosis，IPF）是一種特殊的慢性進(jìn)行性間質(zhì)性肺疾病。IPF病因不明，臨床表現(xiàn)為漸進(jìn)性的呼吸困難和肺功能惡化，是呼吸系統(tǒng)常見(jiàn)的難治性疾病。其發(fā)病率逐年上升，致死率高，根據(jù)有關(guān)統(tǒng)計(jì)，確診后患者5年生存率僅為20%[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)其有研究，但均無(wú)重大進(jìn)展[2]。實(shí)驗(yàn)表明，層粘連蛋白（Laminin，LN）和血小板衍生生長(zhǎng)因子（Platelet-derived Growth Factor，PDGF）與IPF病情進(jìn)展密切相關(guān)[3-4]。目前西醫(yī)采用抗纖維化、激素及免疫抑制劑等治療IPF，但其臨床不良反應(yīng)多，費(fèi)用高，遠(yuǎn)期療效不穩(wěn)定[5]。近年來(lái)，中醫(yī)藥治療IPF取得較大進(jìn)展[6]。目前，導(dǎo)師在臨床上應(yīng)用十棗湯制劑治療IPF，發(fā)現(xiàn)十棗湯能夠有效改善患者的臨床癥狀，提高患者的生命質(zhì)量，明顯延長(zhǎng)患者生存期。本實(shí)驗(yàn)采用博來(lái)霉素復(fù)制肺纖維化大鼠模型[7-8]，觀察大鼠肺組織中LN和PDGF表達(dá)情況，探討十棗湯抗肺纖維化的可能的作用機(jī)制，以期為臨床治療提供借鑒。

材料與方法

1. 材料

1.1. 動(dòng)物 選用雄性無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)SD大鼠96只，由北京華阜康生物科技股份有限公司購(gòu)入，8周齡，體質(zhì)量（200±20）g。在相對(duì)空氣濕度為20%、室溫在18～22 ℃的環(huán)境中，自由進(jìn)食、飲水，常規(guī)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 藥物 十棗湯，制備方法如下：大棗、甘遂、大戟、芫花4味中藥由青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)中藥房提供，后3味研成細(xì)末過(guò)篩100目，按照1∶1∶1的比例等分。用藥劑量按人與大鼠每公斤體質(zhì)量折算系數(shù)計(jì)算[9]，十棗湯低、中、高生藥劑量分別為：0.18 g/kg，0.9 g/kg，1.8 g/kg，棗湯調(diào)制后十棗湯低、中、高的藥物濃度分別為：18 mg/mL，90 mg/mL，180 mg/mL。

1.1.3 試劑與儀器 注射用鹽酸博萊霉素（海正輝瑞制藥有限公司，批號(hào)：Y20262，配制成為5 mg/mL的溶液）、吡非尼酮（北京康蒂尼藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20133376，批號(hào)：170801，溶于1%羧甲基纖維素鈉溶液配成5 mg/mL）、羧甲基纖維素鈉（麥克林生物品牌，CAS：9004-32-4黏度：1500-3100 mpa.susp Grade，批號(hào)：A18105）、水合氯醛（武漢博萊特化工有限公司，批號(hào)：C0073）、層粘連蛋白（LN）ELISA檢測(cè)試劑盒（博士德生物有限公司提供，貨號(hào)：EKO435）、血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）ELISA檢測(cè)試劑盒（博奧森生物有限公司提供，貨號(hào)：bs-0196R-100 μL）、蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（索萊寶生物科技有限公司，貨號(hào)：G1120-100 mL）、實(shí)驗(yàn)超低溫冷凍儲(chǔ)存冰箱（中科美菱，型號(hào)：DW-HL398）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（山東濰坊精鷹醫(yī)療器械有限公司，型號(hào)：YLA-2000）、普通光源顯微鏡（奧林巴斯，型號(hào)：CX21）、多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)：iMark）。

1.2 方法

1.2. 分組及模型制備 采用隨機(jī)分組方法，將大鼠隨機(jī)分為6組，分別為空白組、模型組、吡非尼酮組、十棗湯低劑量組、十棗湯中劑量組、十棗湯高劑量組，每組16只。模型組及各藥物組采用氣管插管的方式，向大鼠氣管中灌注博來(lái)霉素，復(fù)制大鼠肺纖維化模型。10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射大鼠進(jìn)行全身麻醉，使用輸液用泵前軟管行氣管插管，在大鼠吸氣瞬間將博來(lái)霉素（0.2 mL/只）迅速推入，再向氣管內(nèi)注入少量氣體，使博來(lái)霉素完全進(jìn)入到氣管內(nèi)，拔出軟管，將大鼠直立并旋轉(zhuǎn)數(shù)次，使藥物快速、均勻地分散到肺組織?？瞻捉M應(yīng)用生理鹽水行氣管插管處理。

1.2.2 給藥方法 造模后第2天采用灌胃方式給藥，1次/d。吡非尼酮組給予吡啡尼酮2 mL/d;十棗湯低、中、高劑量組，給予低、中、高劑量十棗湯2 mL灌胃，每周3次，其他時(shí)間2 mL生理鹽水灌胃;空白組及模型組大鼠每天2 mL生理鹽水灌胃。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 觀察大鼠的一般情況、觀察肺組織病理變化、檢測(cè)肺組織中LN及PDGF表達(dá)水平。造模后第14天各組隨機(jī)處死8只大鼠（模型組、十棗湯低劑量組7只）、第28天處死其余大鼠。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，暴露胸腔。取右肺，于4%多聚甲醛中固定24 h，常規(guī)進(jìn)行脫水、透明、石蠟包埋、切片，制成病理切片，用于HE染色，觀察肺組織的病理變化;取左肺，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗干凈，并將其切割成合適大小，放入EP管中，于-80 ℃冰箱儲(chǔ)存，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）法檢測(cè)肺組織中LN及PDGF含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，符合正態(tài)分布及方差齊性，則進(jìn)行單因素方差分析，多重比較用LSD法;若方差不齊性，采取秩和檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 大鼠一般情況 造模第2天，模型組死亡1只，十棗湯低劑量組死亡1只，其余大鼠均未死亡?？瞻捉M大鼠：活動(dòng)靈敏，精力充沛，毛色光澤，目光靈活，呼吸均勻，進(jìn)食、飲水及排便正常，體質(zhì)量增長(zhǎng)正常。模型組大鼠：少動(dòng)，反應(yīng)遲鈍，毛色晦暗枯槁，目光呆滯，喘憋較重，可聞及喘鳴，部分大鼠呈直立呼吸，進(jìn)食減少，無(wú)明顯體質(zhì)量增長(zhǎng)。十棗湯低、中劑量組、吡非尼酮組、十棗湯高劑量組大鼠：活動(dòng)較好，精神可，反應(yīng)較靈敏，皮毛欠光澤，目光較靈活，呼吸欠均勻，進(jìn)食飲水正常，排稀軟樣便，體質(zhì)量增長(zhǎng)正常。

2.2 各組大鼠肺組織病理學(xué)表現(xiàn)

光鏡下觀察，空白組大鼠肺組織無(wú)明顯病理改變，肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁完整，間隔未見(jiàn)明顯增厚，未見(jiàn)滲出物及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組第14天時(shí)肺間質(zhì)及肺泡腔可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡結(jié)構(gòu)松散，間隔增厚。第28天時(shí)炎癥滲出較第14天時(shí)減少，肺泡間隔明顯增寬，肺泡結(jié)構(gòu)被破壞，肺泡腔消失并出現(xiàn)病理性融合擴(kuò)張，大量成纖維細(xì)胞增殖。十棗湯低劑量組較模型組肺纖維化程度減輕，可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡結(jié)構(gòu)部分完整，肺泡間隔增寬。十棗湯中劑量組及吡非尼酮組的肺組織較模型組纖維化程度明顯減輕，肺泡結(jié)構(gòu)較為完整，偶見(jiàn)肺泡間隔增寬，病變較為局限。十棗湯高劑量組肺組織纖維化程度最輕，肺泡結(jié)構(gòu)完整。見(jiàn)圖1。

2.3 各組大鼠肺組織LN和PDGF表達(dá)水平

2.3. 給藥第14天時(shí)大鼠肺組織中LN、PDGF的表達(dá)情況

與空白組比較，模型組LN、PDGF表達(dá)水平明顯升高;與各觀察組比較，觀察組中LN、PDGF表達(dá)水平均降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01）;與其他組比較，十棗湯高劑量組LN、PDGF表達(dá)水平明顯降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）;與十棗湯低、中劑量組比較，吡非尼酮組LN表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）;吡非尼酮組與十棗湯中劑量組PDGF表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;與十棗湯低劑量組比較，吡非尼酮組PDGF表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與十棗湯低劑量組比較，十棗湯中劑量組PDGF表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.3.2 給藥第28天時(shí)大鼠肺組織中LN、PDGF的表達(dá)情況

與空白組比較，各組LN、PDGF表達(dá)水平明顯升高（均P<0.01）;與模型組相較，觀察組中LN、PDGF表達(dá)水平均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01）;與其他觀察組相較，十棗湯高劑量組LN、PDGF表達(dá)水平明顯降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）;吡非尼酮組與十棗湯中劑量組LN、PDGF表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）;與十棗湯低劑量組比較，吡非尼酮組LN、PDGF表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）;與十棗湯低劑量組比較，十棗湯中劑量組LN、PDGF表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。見(jiàn)表2。

3 討論

特發(fā)性肺纖維化是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)間質(zhì)性肺疾病的范疇，其組織學(xué)和（或）胸部HRCT特征性表現(xiàn)為普通型間質(zhì)性肺炎，病理生理機(jī)制為炎細(xì)胞滲出、成纖維細(xì)胞聚集及膠原等細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular Matrix，ECM）的過(guò)多沉積[10]。其中，LN及PDGF介入并介導(dǎo)肺纖維化，在其進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。LN是細(xì)胞基質(zhì)中的非膠原糖蛋白，主要由肺泡上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及某些間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，是基膜的主要結(jié)構(gòu)成分[11]，其主要功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、增殖和維持細(xì)胞骨架[12]。LN參與內(nèi)皮細(xì)胞的損傷過(guò)程，其大量增多能促使炎癥細(xì)胞積聚于基底膜，損傷肺組織進(jìn)而導(dǎo)致肺纖維化[13]。除此之外，LN能促進(jìn)巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞分泌淋巴因子，促使成纖維細(xì)胞合成膠原，其在肺纖維化發(fā)生發(fā)展的全過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[14]。PDGF是一種強(qiáng)的間質(zhì)細(xì)胞促有絲分裂素，由巨噬細(xì)胞和血小板等細(xì)胞分泌。PDGF可引起細(xì)胞過(guò)度增殖，特別是能刺激成纖維細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移，促進(jìn)肌纖維母細(xì)胞產(chǎn)生大量膠原蛋白，調(diào)節(jié)ECM沉積和降解，影響細(xì)胞外基質(zhì)代謝，引起肺部組織纖維化[15]，而其引起的細(xì)胞過(guò)度增殖能進(jìn)一步加重肺組織的炎癥反應(yīng)[16]，加快肺纖維化的進(jìn)程。本研究顯示，十棗湯能夠有效改善博來(lái)霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化的病理學(xué)改變程度，減輕肺組織炎癥活動(dòng)度，抑制肺組織中LN及PDGF的表達(dá)水平，表明了十棗湯具有良好的抗纖維化作用。

中醫(yī)學(xué)將IPF歸納為肺痿、肺痹的范疇[17]，其主要病機(jī)為痰瘀深伏凝結(jié)、肺絡(luò)痹阻[18]。導(dǎo)師王燕青主任認(rèn)為，炎癥滲出和結(jié)締組織增生是中醫(yī)學(xué)“痰、瘀”的特征之一，其中頑痰是形成IPF的最根本原因，頑痰深伏，結(jié)成窠臼，留而不出，痹阻肺絡(luò)，阻滯經(jīng)脈氣血運(yùn)行。而氣血運(yùn)行不暢，久則成瘀，肺臟失養(yǎng)，無(wú)力推動(dòng)氣血運(yùn)行，血行滯澀，堵塞肺絡(luò)亦為瘀血，如此反復(fù)，痰瘀互結(jié)，肺絡(luò)痹阻愈甚。痰飲之邪為患，治療上當(dāng)以化痰為法，張仲景在《金匱要略》中便已提出“病痰飲者，當(dāng)以溫藥和之”之明訓(xùn)[19]，臨床治療中也大多遵循此法。而此病痰飲者，非仲景一般溫藥所能化之。IPF起病急，進(jìn)展快，預(yù)后差，屬“虎狼之病”，而導(dǎo)師從砒霜治療白血病中得到啟示，認(rèn)為虎狼之病須用虎狼之藥方可平之，必用十棗湯，達(dá)水飲窠囊隱僻之處，祛除窠臼之痰飲。方中甘遂擅驅(qū)經(jīng)絡(luò)之水飲，大戟擅消臟腑之水飲，芫花能破水飲窠臼，三藥合用峻泄肺中頑痰邪飲，導(dǎo)其水，挫其勢(shì)，加用棗湯調(diào)服，既健脾扶正，又能緩和峻藥之毒，使峻下而不傷正，四藥相和，使肺絡(luò)得通，氣血得以運(yùn)行，肺臟得以充養(yǎng)，宗氣生成充足，痰、瘀等癥狀均得到一定改善。在十棗湯原文有“……不卒死，至一百日或一歲，宜十棗湯”，體現(xiàn)了此方可用于治療病情危重，生存時(shí)間短的疾病，這便與IPF的臨床特點(diǎn)有不謀而合之處。十棗湯既能峻瀉有形之水飲，又能祛無(wú)形之邪氣，此峻猛之方能夠直達(dá)病所，以導(dǎo)水飲從大腸而出?！饵S帝內(nèi)經(jīng)·靈樞》中論述“肺合大腸，腸者，傳導(dǎo)之腑”，肺與大腸相表里，腑氣不通則肺氣不降，通過(guò)峻瀉大腸之法，給肺中之水飲邪氣以出路，腑氣得通，使肺之宣降功能得以恢復(fù)，這正體現(xiàn)了中醫(yī)“上病下治”的治療思想[19]。十棗湯為仲景峻下逐水之猛劑，從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度來(lái)看，其阻斷肺纖維化的發(fā)展進(jìn)程，截?cái)嗔思膊∵M(jìn)展期的瀑布反應(yīng)，起到了“截?cái)嗯まD(zhuǎn)”的作用[20]。

綜上所述，十棗湯能抑制肺組織中LN及PDGF的表達(dá)，從而發(fā)揮其抗肺纖維化作用，為峻下逐水法干預(yù)IPF的臨床推廣應(yīng)用提供了依據(jù)。但基于十棗湯有毒且逐水作用迅猛，臨床研究尚存在不足。

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（2020-01-14收稿 本文編輯：楊覺(jué)雄）