基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探討補(bǔ)陽還五湯治療糖尿病腦病的作用機(jī)制

李劍 張文風(fēng)

摘要 目的：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對接技術(shù)，探討補(bǔ)陽還五湯有效成分治療糖尿病腦病潛在作用機(jī)制。方法：從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）和中科院化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫篩選出補(bǔ)陽還五湯有效化學(xué)成分及其靶點(diǎn)，通過GeneCards、在線人類孟德爾遺傳（OMIM）數(shù)據(jù)庫收集糖尿病腦病靶點(diǎn)，運(yùn)用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖并通過Cytoscape 3.8.0軟件中CytoNCA插件篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)。利用ClusterProfiler程序包進(jìn)行基因本體（GO）和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析，并通過Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建補(bǔ)陽還五湯藥物-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，最后利用AutoDock軟件進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。結(jié)果：篩選得到補(bǔ)陽還五湯中活性成分108種，對應(yīng)潛在靶點(diǎn)469個，網(wǎng)絡(luò)圖顯示槲皮素、甘氨酸、洋川芎醌等是補(bǔ)陽還五湯治療糖尿病腦病的關(guān)鍵成分，蛋白激酶、P53蛋白、腫瘤壞死因子等是該方治療糖尿病腦病的關(guān)鍵靶點(diǎn)。GO富集分析顯示該方可能通過對氧化應(yīng)激的反應(yīng)、對藥物的反應(yīng)、對金屬離子的反應(yīng)等生物過程發(fā)揮作用，與膜筏、膜微域、膜區(qū)域等細(xì)胞組分有關(guān)，與酰胺結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、肽結(jié)合等分子功能有關(guān)。KEGG富集分析顯示主要與PI3K-AKT信號通路、MAPK信號通路有關(guān)。分子對接結(jié)果表明補(bǔ)陽還五湯中主要活性成分與核心作用靶點(diǎn)具有較為穩(wěn)定的結(jié)合活性。結(jié)論：本研究初步揭示了補(bǔ)陽還五湯多成分、多靶點(diǎn)、多通路治療糖尿病腦病的機(jī)制，為補(bǔ)陽還五湯的臨床開發(fā)利用提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞 補(bǔ)陽還五湯;糖尿病腦病;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);分子對接;作用機(jī)制

Study on the Mechanism of Buyang Huanwu Decoction in the Treatment of Diabetic Encephalopathy based on Network Pharmacology and Molecular Docking

LI Jian，ZHANG Wenfeng

（College of Basic Medicine，Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117，China）

Abstract Objective：To explore the possible mechanism of Buyang Huanwu Decoction in the treatment of diabetic encephalopathy（DE） based on network pharmacology and molecular docking.Methods：The active components and targets of Buyang Huanwu Decoction were selected from the Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP） and Chemistry Database of Chinese Academy of Sciences（CAS）.The DE targets were collected from the GeneCards and Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）.STRING was used to construct the protein-protein interaction（PPI） network，and the plugin CytoNCA of Cytoscape 3.8.0 was employed to screen the key targets.The Gene Ontology（GO） and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） enrichment analysis were conducted by Clusterprofiler.The drug-component-target-pathway network was constructed by Cytoscape 3.8.0，and AutoDock was adopted for molecular docking.Results：A total of 108 active components of Buyang Huanwu Decoction were obtained，corresponding to 469 potential targets.The drug-component-target-pathway network showed that quercetin，glycine and senkyunone were the key components of Buyang Huanwu Decoction in the treatment of DE，and protein kinase，P53 protein，and tumor necrosis factors were the key targets.GO enrichment analysis revealed that this prescription may exert the effect through processes such as acting on oxidative stress，drugs，and metal ions，involving the cell components of membrane raft，membrane microdomain and membrane region and the molecular functions of amide binding，DNA-transcription factor binding and peptide binding.KEGG enrichment analysis showed that PI3K-Akt and MAPK signaling pathways were mainly involved.Molecular docking indicated that the main active components in Buyang Huanwu Decoction had stable binding activity to the core action targets.Conclusion：This study revealed the mechanism of Buyang Huanwu Decoction in the treatment of DE，and provided a basis for the clinical development and utilization of the prescription.

Keywords Buyang Huanwu Decoction; Diabetic encephalopathy; Network pharmacology; Molecular docking; Mechanism

中圖分類號：R285文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.05.010

糖尿病腦?。―iabetic Encephalopathy，DE）是一種以大腦認(rèn)知功能減弱為主要癥狀的糖尿病并發(fā)癥[1]。根據(jù)其臨床表現(xiàn)，可類屬中醫(yī)“消渴”并發(fā)“健忘”“癡呆”的范疇。消渴日久，內(nèi)熱熾盛，傷津耗氣，氣虛則推動血液運(yùn)行無力，血液運(yùn)行不暢，瘀血阻滯腦絡(luò)，遂發(fā)為腦病。王永炎院士認(rèn)為“毒損腦絡(luò)”是DE的關(guān)鍵病機(jī)，解毒通絡(luò)為基本法則[2]。經(jīng)典名方補(bǔ)陽還五湯出自清代醫(yī)家王清任的《醫(yī)林改錯》，原主治氣虛血瘀之中風(fēng)，具有補(bǔ)氣活血通絡(luò)的作用，為益氣活血的代表方劑?；A(chǔ)研究顯示該方所包含的活血化瘀中藥可通過抑制海馬神經(jīng)元鈣離子升高和凋亡，抑制膠質(zhì)細(xì)胞的活化，改善血液流變學(xué)和微循環(huán)障礙，減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等機(jī)制，改善認(rèn)知功能[3-8]。

因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法聯(lián)合分子對接技術(shù)研究補(bǔ)陽還五湯治療DE的潛在分子機(jī)制，以期為補(bǔ)陽還五湯的后續(xù)研究提供理論依據(jù)。

資料與方法

1. 補(bǔ)陽還五湯有效成分的收集與篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）收集補(bǔ)陽還五湯中7味藥物的化學(xué)成分，其中并未檢索到地龍有效成分，故通過中科院化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫（http：//www.organchem.csdb.cn）進(jìn)行補(bǔ)充檢索，并按文獻(xiàn)報(bào)道設(shè)定口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%和類藥性值（Drug Likeness，DL）≥0.18，篩選符合條件的有效成分[9-10]。

1.2 補(bǔ)陽還五湯藥材-有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過TCMSP獲取黃芪、桃仁、紅花、赤芍、川芎、當(dāng)歸6味藥有效成分所對應(yīng)的靶點(diǎn)信息，同時利用中科院化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫補(bǔ)充檢索地龍有效成分，并通過PubChem數(shù)據(jù)庫獲取地龍有效成分的SMILE號，采用SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫獲取其靶點(diǎn)。將所有靶點(diǎn)合并、去重，并通過UniProt數(shù)據(jù)庫對其名稱標(biāo)準(zhǔn)化，然后利用Cytoscape 3.8.0軟件，構(gòu)建可視化網(wǎng)絡(luò)。

1.3 疾病靶點(diǎn)的獲取

利用在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）、GeneCards數(shù)據(jù)庫以“Diabetic Encephalopathy”為關(guān)鍵詞搜索與糖尿病腦病相關(guān)發(fā)病機(jī)制靶點(diǎn)，2個數(shù)據(jù)庫得到的靶點(diǎn)合并，并去掉重復(fù)的靶點(diǎn)，得到糖尿病腦病靶點(diǎn)。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用Venny 2.1.0繪制補(bǔ)陽還五湯與DE交集靶點(diǎn)韋恩圖，將其導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫中建立蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，并利用Cytoscape 3.8.0軟件中CytoNCA插件篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.5 基因本體功能與京都基因和基因組百科全書通路富集分析

采用計(jì)算機(jī)R語言中clusterProfiler程序包對交集靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析，并繪制氣泡圖進(jìn)行可視化。GO包括生物過程，分子功能和細(xì)胞組分3個方面[11]。

1.6 分子對接驗(yàn)證

在PubChem中得到補(bǔ)陽還五湯中化合物的2D結(jié)構(gòu)，并導(dǎo)入Chem3D軟件得到優(yōu)化后的3D結(jié)構(gòu);從PDB數(shù)據(jù)庫中篩選得到的關(guān)鍵靶蛋白的3D結(jié)構(gòu)“.pdb”格式文件，通過PYMOL軟件去除了水分子和配體，分離蛋白結(jié)構(gòu)。采用AutoDock軟件并運(yùn)用Grid模塊設(shè)置蛋白原配體為對接盒子中心，其格點(diǎn)盒子大小設(shè)定為40×40×40，并對配體小分子可能發(fā)生作用的區(qū)域進(jìn)行設(shè)定，利用AutoDock Vina分子模擬軟件對藥物小分子和靶蛋白受體進(jìn)行分子對接分析。結(jié)合能小于-5.0 kcal/mol（ kcal=4 186 J）是分子對接時配體和受體穩(wěn)定結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合能越低分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性越高[12]。

2 結(jié)果

2. 補(bǔ)陽還五湯有效成分及相關(guān)靶點(diǎn)的篩選

檢索化合物數(shù)據(jù)及對應(yīng)的靶點(diǎn)，其中赤芍29個、川芎7個、當(dāng)歸2個、紅花22個、黃芪20個、桃仁23個，由于。地龍主要化合物均不滿足OB≥30%和DL≥0.18的條件，故在此未列出地龍的相關(guān)數(shù)據(jù)。將所得化合物去重后共得到108個化合物。將所得靶點(diǎn)去重后共得到469個靶點(diǎn)。補(bǔ)陽還五湯主要化合物及其相關(guān)信息見表1。

2.2 構(gòu)建補(bǔ)陽還五湯藥材-有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

該網(wǎng)絡(luò)圖中共包括7個藥材節(jié)點(diǎn)、84個有效成分節(jié)點(diǎn)和469個靶蛋白節(jié)點(diǎn)，共560個節(jié)點(diǎn)。見圖1。

2.3 補(bǔ)陽還五湯靶點(diǎn)與DE靶點(diǎn)交集分析

合并去重得到DE靶點(diǎn)2 631個，將藥材與疾病靶點(diǎn)映射后，共得到靶點(diǎn)245個。見圖2。

2.4 構(gòu)建交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖。見圖3。通過Cytoscape 3.8.0插件CytoNCA對共有靶點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)浞治?，根?jù)degree值大小篩選前20位關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，得到關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖。見圖4。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)間連線節(jié)點(diǎn)數(shù)目排列，得到PPI網(wǎng)絡(luò)中核心靶點(diǎn)條形圖。見圖5。

2.5 GO富集分析 利用ClusterProfiler程序包進(jìn)行GO功能富集分析，根據(jù)基因富集數(shù)目與顯著程度，篩選各排名前10，通過R語言包繪制氣泡圖進(jìn)行可視化處理。見圖6。

其中生物過程主要涉及對金屬離子的反應(yīng)、對藥物的反應(yīng)、對氧化應(yīng)激的回應(yīng)、細(xì)胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、對營養(yǎng)水平的反應(yīng)、對脂多糖的回應(yīng)、對細(xì)菌起源的分子的反應(yīng)、細(xì)胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng)、老化、對活性氧類的回應(yīng)等;細(xì)胞組分主要涉及膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)、囊泡腔、胞質(zhì)囊腔、突觸后膜、蛋白激酶復(fù)合物、質(zhì)膜筏、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合物、細(xì)胞周期蛋白依賴蛋白激酶全酶復(fù)合物等;分子功能主要涉及酰胺結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、肽結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、羧酸結(jié)合、有機(jī)酸結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合、氨基酸結(jié)合等。

2.6 KEGG富集分析

利用clusterProfiler程序包進(jìn)行KEGG富集分析，篩選排名靠前的30條通路，通過R語言包繪制氣泡圖進(jìn)行可視化處理。通路富集分析結(jié)果顯示主要涉及PI3K-AKT信號通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、人類巨細(xì)胞病毒感染、乙肝、MAPK信號通路、癌癥中的蛋白質(zhì)、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、人T細(xì)胞白血病病毒1感染、前列腺癌、丙型肝炎、肝細(xì)胞癌、EB病毒感染、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、細(xì)胞衰老、細(xì)胞凋亡、甲型流感、HIF-1信號通路、乳腺癌、胰腺癌、內(nèi)分泌抵抗等。見圖7。

2.7 藥物-成分-靶點(diǎn)-通路的網(wǎng)絡(luò)分析

該網(wǎng)絡(luò)圖中包括7個藥材節(jié)點(diǎn)、84個有效成分節(jié)點(diǎn)、469個靶蛋白節(jié)點(diǎn)和20條通路節(jié)點(diǎn)，共580個節(jié)點(diǎn)。見圖8。由網(wǎng)絡(luò)圖分析結(jié)果知，有效成分中連接邊數(shù)較多的為槲皮素、甘氨酸、洋川芎醌、山柰酚、木犀草素;潛在靶點(diǎn)中AKT1、TP53、TNF、VEGFA、CASP3連接較多邊數(shù);通路中如PI3K-AKT信號通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、人類巨細(xì)胞病毒感染、乙肝、MAPK信號通路與潛在靶點(diǎn)有較多的連接。

2.8 分子對接結(jié)果

將藥材成分中度值排名前5的槲皮素、甘氨酸、洋川芎醌、山柰酚、木犀草素與度值排名前5的潛在靶點(diǎn)AKT1、TP53、TNF、VEGFA、CASP3進(jìn)行分子對接分析。見表2，圖9。對接結(jié)果顯示活性成分與受體蛋白的最低結(jié)合能結(jié)果大部分小于-5.0 kcal/mol，說明活性成分與受體蛋白具有較好的結(jié)合活性，其中木犀草素和AKT1、TP53最低結(jié)合能最小，穩(wěn)定性最高。分子對接模式見圖10。

3 討論

目前糖尿病腦病的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，尚未完全明確，本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合分子對接方法，構(gòu)建了藥材-有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)、靶點(diǎn)蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)、藥材-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，對補(bǔ)陽還五湯治療糖尿病腦病的分子機(jī)制進(jìn)行預(yù)測分析，為補(bǔ)陽還五湯的后續(xù)深入研究提供科學(xué)依據(jù)。

槲皮素、甘氨酸、洋川芎醌、山柰酚、木犀草素等活性成分度值較高，在治療過程中可能發(fā)揮重要作用。其中槲皮素能夠提高高糖培養(yǎng)海馬神經(jīng)元活性，抑制海馬神經(jīng)元凋亡，其作用機(jī)制可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)[13]。山柰酚可能是通過降低血糖，維持正常血脂水平，抗氧化、抗炎、降低醛糖酶途徑，從而對2型糖尿病大鼠的心腦血管等慢性并發(fā)癥產(chǎn)生保護(hù)作用[14]。木犀草素可以抑制海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡糖尿病腦病大鼠體內(nèi)的細(xì)胞，其作用機(jī)制包括間接的抗氧化作用和抑制凋亡相關(guān)因子。另外，木犀草素激活磷脂酰肌醇-3-激酶/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并因此抑制海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[15]。

PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析顯示，AKT1、TP53、TNF、VEGFA、CASP3等為補(bǔ)陽還五湯治療DE的潛在作用關(guān)鍵靶點(diǎn)。其中AKT1又稱蛋白激酶B，對海馬神經(jīng)元細(xì)胞的生長及生存起重要的調(diào)控作用[16]。有證據(jù)表明，AKT1蛋白可能與2型糖尿病患者認(rèn)知功能減退有關(guān)[17]。大腦AKT1磷酸化是胰島素和其他生長因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)[18]。TP53是一種抑癌基因，可參與葡萄糖等多種代謝途徑[19]。醛糖還原酶通過激活TP53導(dǎo)致糖尿病介導(dǎo)的線粒體功能障礙和損傷[20]。腫瘤壞死因子（TNF）可促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化，并參與某些自身免疫病的病理損傷[21]。有研究表明，糖尿病腦病小鼠腦組織中小膠質(zhì)細(xì)胞活化，TNF明顯升高[22]。血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）在血管生成和內(nèi)皮細(xì)胞生長中發(fā)揮重要作用，可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞遷移、抑制細(xì)胞凋亡并誘導(dǎo)血管通透性等[23]。胱天蛋白酶-3（Caspase-3）是能夠特異性切割靶蛋白天冬氨酸殘基上肽鍵的一種蛋白酶，在細(xì)胞凋亡過程發(fā)揮重要作用[24]。研究發(fā)現(xiàn)，海馬區(qū)細(xì)胞凋亡是糖尿病腦病發(fā)病的重要因素[25]。

通路富集分析顯示，補(bǔ)陽還五湯可能通過干預(yù)PI3K-AKT信號通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、人類巨細(xì)胞病毒感染、乙肝、MAPK信號通路等治療DE。劉昭前等[26]研究表明可通過抑制PI3K-AKT信號通路減輕炎癥反應(yīng)起到對糖尿病腦病大鼠模型的神經(jīng)保護(hù)作用。Liu等[27]研究表明糖尿病性腦病中小膠質(zhì)細(xì)胞的調(diào)節(jié)可能涉及MAPK信號通路，小膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元的相互作用在糖尿病性腦病中起重要作用，而小膠質(zhì)細(xì)胞活化的調(diào)節(jié)可能是糖尿病性腦病的治療目標(biāo)。

綜上所述，補(bǔ)陽還五湯可能通過槲皮素、甘氨酸、洋川芎醌、山柰酚、木犀草素等活性成分，作用于AKT1、TP53、TNF、VEGFA、CASP3等靶點(diǎn)，涉及PI3K-AKT信號通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、人類巨細(xì)胞病毒感染、乙肝、MAPK信號通路等機(jī)制來實(shí)現(xiàn)治療DE的目的。本研究表明，補(bǔ)陽還五湯治療DE呈現(xiàn)出多成分、多靶點(diǎn)、多通路的作用優(yōu)勢，為后續(xù)的細(xì)胞及動物實(shí)驗(yàn)研究和臨床新藥開發(fā)及應(yīng)用提供思路和參考依據(jù)。

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（2021-02-18收稿 本文編輯：魏慶雙）