基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接探討杜仲葉防治骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制

趙繼榮 楊濤 陳祁青 馬同 趙寧 薛旭 郭培堯 李瑋農(nóng) 張立存

摘要 目的：采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)-分子對(duì)接預(yù)測(cè)杜仲葉防治骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制。方法：利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP）及SwissTargetPrediction分析平臺(tái)對(duì)杜仲葉活性成分及作用靶點(diǎn)進(jìn)行篩選，使用GeneCards、在線人類孟德爾遺傳（OMIM）數(shù)據(jù)庫、治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫（TTD）對(duì)骨質(zhì)疏松癥的對(duì)應(yīng)靶標(biāo)進(jìn)行篩選，將中藥靶基因與疾病靶基因相交集，將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，使用STRING分析平臺(tái)及Cytoscape軟件構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，篩選核心靶點(diǎn)。對(duì)中藥-疾病共同靶標(biāo)進(jìn)行基因本體（GO）功能富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）功能富集分析，得出中藥-疾病共同靶標(biāo)相關(guān)的信號(hào)通路，最后運(yùn)用AutoDock與Pymol軟件對(duì)預(yù)測(cè)靶標(biāo)與其對(duì)應(yīng)的成分進(jìn)行分子對(duì)接。結(jié)果：篩選后得到杜仲葉治療防治骨質(zhì)疏松癥的有效成分7個(gè)，杜仲葉-骨質(zhì)疏松癥共同靶標(biāo)231個(gè)，并推斷其作用機(jī)制可能與動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路的下游核因子κB信號(hào)通路，MAPK信號(hào)通路、TNF、PI3K-AKT、IL-17及HIF-1信號(hào)通路等有關(guān)，且MAPK1、STAT3、VEGFA、IL6、TP53、EGF、AKT1、JUN、MAPK8、EGFR、TNF基因可能起著關(guān)鍵的作用。結(jié)論：杜仲葉可能通過減輕氧化應(yīng)激損傷、抑制破骨細(xì)胞形成、促進(jìn)成骨細(xì)胞形成等作用發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用。

關(guān)鍵詞 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);分子對(duì)接;杜仲葉;骨質(zhì)疏松癥;分子機(jī)制;信號(hào)通路

Mechanism of Eucommia ulmoides Oliv.Leaves in Preventing and Treating Osteoporosis Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

ZHAO Jirong1，YANG Tao2，CHEN Qiqing1，MA Tong1，ZHAO Ning1，XUE Xu1，GUO Peiyao1，LI Weinong2，ZHANG Licun2

（ Gansu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Lanzhou 730050，China; 2 Gansu University of Chinese Medicine，Lanzhou 730030，China）

Abstract Objective：To explore the mechanism of Eucommia ulmoides Oliv.Leaves in treating osteoporosis based on network pharmacology and molecular docking.Methods：The active components and targets of E.ulmoides leaves were screened by Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP） and SwissTargetPrediction，and the corresponding targets of osteoporosis were searched by GeneCards，Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM） and Therapeutic Target Database（TTD）.The targets of Chinese herbal medicine and disease were intersected and input into Cytoscape to construct the component-target regulatory network.The protein-protein interaction（PPI） network was constructed by STRING and Cytoscape to screen the core targets.Gene Ontology（GO） and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） functional enrichment analysis were carried out on the common targets of Chinese herbal medicine and disease，and the signaling pathways related to the common targets were obtained.Finally，AutoDock and Pymol were used for molecular docking between the predicted targets and its corresponding components.Results：After screening，7 active components of E.ulmoides leaves in the treatment of osteoporosis were obtained，and 23 common targets were identified.The mechanism was inferred to be related to NF-κB，MAPK，TNF，PI3K-Akt，IL-17，and HIF- signaling pathways，and MAPK1，STAT3，VEGFA，IL6，TP53，EGF，AKT1，JUN，MAPK8，EGFR and TNF genes might play a key role.Conclusion：E.ulmoides leaves may exert the anti-osteoporosis effect by alleviating oxidative stress injury，inhibiting osteoclast formation and promoting osteoblast formation.

Keywords Network pharmacology; Molecular docking; Eucommia ulmoides leaves; Osteoporosis; Molecular mechanism; Signaling pathway

中圖分類號(hào)：R285文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.05.012

骨質(zhì)疏松癥（Osteoporosis，OP）是一種因骨密度降低和骨組織微結(jié)構(gòu)破壞導(dǎo)致的骨骼強(qiáng)度減低而易發(fā)生骨折的慢性骨代謝性疾病[1]。人口老齡化及糖皮質(zhì)激素的廣泛使用使OP已成為“隱形的殺手”[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約2億人患有OP，由其引發(fā)的骨折每年高達(dá)890萬次以上，而在中國，50歲以上的近700萬人患有OP，并且每年會(huì)造成68.7萬例髖部骨折[3]。中醫(yī)將OP稱為“骨萎、骨枯、骨極”，根據(jù)中醫(yī)經(jīng)典理論“腎主骨生髓”，近年來在探索挖掘中醫(yī)藥防治OP方面成果顯著。研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎中藥牛膝[4]、淫羊藿[5]、杜仲[6]等對(duì)OP均具有較好的防治效果。而杜仲為杜仲科杜仲屬多年生落葉喬木，資源稀缺，是我國特有的第三紀(jì)孑遺植物，是國家二級(jí)珍貴保護(hù)樹種[7]，主要藥用部位為其干燥樹皮，但只有15年以上杜仲樹才可剝皮藥用，且剝皮后的杜仲樹要經(jīng)過3～4年的生長修復(fù)才可再次剝皮，并且常因剝皮后護(hù)養(yǎng)不當(dāng)造成皮剝樹死[8-9]。由于杜仲為單科、單屬、單種類植物，新藥源的開辟只能從其自身非藥用部位入手，故杜仲葉能否作為杜仲皮的替代品是目前杜仲新藥源的研究熱點(diǎn)。杜仲葉（Eucommia Folium）為杜仲科植物杜仲的干燥葉，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨之效。用于肝腎不足，頭暈?zāi)垦?，腰膝酸痛，筋骨痿軟[10]。研究發(fā)現(xiàn)杜仲葉與杜仲皮有效成分及藥理作用大致相同。目前從杜仲葉中分離鑒定出有機(jī)化合物約70種以上，無機(jī)礦物元素15種以上。大致可分為環(huán)烯醚萜類、木脂素類、黃酮類、酚類等[11]。其有效成分能夠抗肝纖維化，保肝利膽，抑菌抗氧化，并且能夠改善骨質(zhì)疏松的骨微結(jié)構(gòu)，增加骨密度，發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用[12]。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)探索杜仲葉防治OP的作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究杜仲葉能否替代杜仲用于防治OP提供科學(xué)的理論依據(jù)。

資料與方法

1. 資料來源

本研究所使用的研究平臺(tái)及各大數(shù)據(jù)庫見表1。

1.2 方法

1.2. 篩選杜仲葉主要化學(xué)成分

在 中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP）檢索杜仲葉化學(xué)成分，以口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%、類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)，初步篩選候選化合物，然后進(jìn)一步查閱文獻(xiàn)對(duì)化合物進(jìn)行進(jìn)一步補(bǔ)充[13]。

1.2.2 收集藥物作用靶點(diǎn)

檢索TCMSP，篩選出1.2.1中化合物作用靶點(diǎn)，使用UniProt數(shù)據(jù)庫將靶點(diǎn)基因名稱規(guī)范為官網(wǎng)名稱。利用SwissTargetPrediction平臺(tái)，再次對(duì)候選化合物的靶點(diǎn)基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，然后將篩選出的2個(gè)數(shù)據(jù)庫潛在作用靶點(diǎn)合并，刪除重復(fù)值，得到藥物潛在的作用靶點(diǎn)基因。

1.2.3 已知OP疾病靶點(diǎn)基因的獲取

在GeneCards、OMIM、TTD數(shù)據(jù)庫中以“osteoporosis”為檢索詞對(duì)已知的OP靶點(diǎn)基因進(jìn)行檢索和篩選，刪除重復(fù)基因后得到疾病靶點(diǎn)基因。

1.2.4 篩選藥物靶點(diǎn)基因和疾病靶點(diǎn)基因的交集

運(yùn)用Venny平臺(tái)將1.2.2中所得靶點(diǎn)與1.2.3所得靶點(diǎn)進(jìn)行交集，所得交集靶點(diǎn)即為杜仲葉治療OP的可能作用靶點(diǎn)。

1.2.5 構(gòu)建中藥-成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

應(yīng)用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建中藥、成分、疾病及靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)。節(jié)點(diǎn)（node）表示中藥、成分、疾病、靶點(diǎn)。邊（edge）表示中藥-成分-疾病-靶點(diǎn)之間的相互聯(lián)系。

1.2.6 Hub網(wǎng)絡(luò)的提取及Hub中的靶標(biāo)

利用STRING在線軟件構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖，將導(dǎo)出string interactions的文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，?jì)算得Degree、BC、CC的中位數(shù)，根據(jù)大于2倍Degree中位數(shù)和大于其他指標(biāo)中位數(shù)的篩選標(biāo)準(zhǔn)，選出關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。

1.2.7 基因功能和富集分析

使用Metascape平臺(tái)對(duì)作用靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）注釋分析及京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析，然后使用GraphPad Prism 7.0將分析結(jié)果可視化。

1.2.8 有效成分與核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接

根據(jù)Degree值高低對(duì)靶點(diǎn)基因進(jìn)行排序，在PDB數(shù)據(jù)庫下載相應(yīng)靶點(diǎn)蛋白結(jié)構(gòu)的3D結(jié)構(gòu)，保存為pdb格式文件，在Pubchem數(shù)據(jù)庫獲取有效成分的sdf格式文件，使用Pymol軟件將蛋白質(zhì)分子去水，去磷酸根，使用AutoDockTools進(jìn)行對(duì)接。

2 結(jié)果

2. 杜仲葉主要活性成分的篩選

杜仲葉主要活性成分的篩選 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索得到杜仲葉有效成分78個(gè)，根據(jù)OB≥30%，DL≥0.18，得有效成分3個(gè)，檢索相關(guān)文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)杜仲葉中的苯丙素類化合物綠原酸含量豐富，一般可達(dá)1%～5%，為杜仲葉主要成分;而綠原酸能夠通過Shp2/Erk信號(hào)通路促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞的增值;另外，京尼平苷酸及桃葉珊瑚苷可促進(jìn)膠原的合成，而Ⅰ型膠原是骨基質(zhì)中的主要膠原;金絲桃苷可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）成骨分化。因此，經(jīng)過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選及文獻(xiàn)補(bǔ)充，共得到杜仲葉治療OP的主要活性成分7個(gè)。見表2。

2.2 杜仲葉作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

經(jīng)過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫，使用Uniprot數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)化基因名后得到潛在靶點(diǎn)249個(gè)，SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫獲得基因靶點(diǎn)500個(gè)，將2個(gè)數(shù)據(jù)庫基因靶點(diǎn)合并去重后得到杜仲葉治療OP的潛在靶點(diǎn)基因396個(gè)。通過檢索GeneCards、OMIM、TTD數(shù)據(jù)庫，刪除重復(fù)值后得到與OP相關(guān)的靶點(diǎn)基因4 138個(gè)。使用Venny 2.1.1在線平臺(tái)將藥物作靶點(diǎn)基因與疾病靶點(diǎn)基因進(jìn)行交集，得到二者的韋恩圖及藥物疾病的共有靶點(diǎn)基因231個(gè)。見圖1。

2.3 成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

以231個(gè)靶基因作為杜仲葉治療OP的潛在靶點(diǎn)構(gòu)建杜仲葉治療OP的成分靶點(diǎn)圖。見圖2。圖中共有238個(gè)節(jié)點(diǎn)，430條邊，節(jié)點(diǎn)代表藥物成分及作用靶基因，邊代表成分與靶基因的相互作用。此圖充分體現(xiàn)了杜仲葉多成分、多靶點(diǎn)治療OP的機(jī)制。

2.4 靶基因PPI網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建及關(guān)鍵靶基因的篩選

Venny分析得到231個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，去除16個(gè)無相互作用的靶點(diǎn)，將導(dǎo)出String Interactions的文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，?jì)算得Degree、BC、CC的中位數(shù)分別為13、0.005 9、0.666 7，根據(jù)大于2倍Degree中位數(shù)和大于其他指標(biāo)中位數(shù)的篩選標(biāo)準(zhǔn)，選出24個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。見圖3。所得關(guān)節(jié)靶點(diǎn)基因及其Degree、BC、CC值見表3。

2.5 GO注釋分析與KEGG富集分析

將杜仲葉治療OP的231個(gè)潛在靶點(diǎn)輸入Metascape數(shù)據(jù)庫，對(duì)其進(jìn)行GO注釋分析和KEGG信號(hào)通路分析，將輸出的結(jié)果使用GraphPad Prism 7.0進(jìn)行可視化。杜仲葉治療OP潛在靶點(diǎn)的GO注釋分析見圖4，KEGG信號(hào)通路可視化見圖5。

GO分析結(jié)果顯示：在分子功能（Molecular Function，MF）（圖4A）與激酶結(jié)合（Kinase Binding）、蛋白激酶結(jié)合（Protein Kinase Binding）、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合（Protein Domain Specific Binding）、蛋白激酶活性（Protein Kinase Activity）、內(nèi)肽酶活性（Endopeptidase Activity）、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（Transcription Factor Binding）、核受體活性（Nuclear Receptor Activity）、轉(zhuǎn)錄因子活性（Transcription Factor Activity）、磷酸轉(zhuǎn)移酶活性（Phosphotransferase Activity）、激酶活性（Kinase Activity）、蛋白質(zhì)同源二聚體活性（Protein Homodimerization Activity）等分子功能有關(guān);在生物過程（Biological Process，BP）（圖4B）涉及細(xì)胞對(duì)傷害的反應(yīng)（Response to Wounding）、細(xì)胞對(duì)有機(jī)氮化合物的反應(yīng)（Cellular Response to Organonitrogen Compound）、細(xì)胞對(duì)氮化合物的反應(yīng)（Cellular Response to Nitrogen Compound）、對(duì)脂多糖的反應(yīng)（Response to Lipopolysaccharide）、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路（Cytokine-mediated Signaling Pathway）、對(duì)細(xì)菌來源分子的反應(yīng)（Response to Molecule of Bacterial Origin）、調(diào)節(jié)細(xì)胞正向遷移（Positive Regulation of Cell Migration）、傷口愈合（Wound Healing）、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的正向調(diào)節(jié)（Positive Regulation of Cell Motility）、細(xì)胞成分運(yùn)動(dòng)的正調(diào)節(jié)（Positive Regulation of Cellular Component Movement）、對(duì)有毒物質(zhì)的反應(yīng)（Response to Toxic Substance）等生物過程;而細(xì)胞組分（Celluar Component，CC）（圖4C）涉及膜筏（Membrane Raft）、膜微區(qū)（Membrane Microdomain）、膜區(qū)（Membrane Region）、囊腔（Vesicle Lumen）、細(xì)胞質(zhì)囊腔（Cytoplasmic Vesicle Lumen）、細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular Matrix）、胞質(zhì)核周區(qū)（Perinuclear Region of Cytoplasm）、溶泡（Lytic Vacuole）、溶酶體（Lysosome）等組分。

KEGG通路分析顯示杜仲葉治療OP的靶點(diǎn)主要涉及腫瘤（前列腺癌、小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、膀胱癌）信號(hào)途徑、PI3K-AKT信號(hào)通路、乙肝信號(hào)通路、人類嗜T淋巴細(xì)胞病毒Ⅰ型感染、糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號(hào)通路、動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、內(nèi)分泌抵抗信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑抗性、細(xì)胞凋亡、MAPK、HIF-1及FoxO信號(hào)通路等多種信號(hào)通路。見圖5。

2.6 分子對(duì)接

對(duì)杜仲葉中篩選得到的7個(gè)核心成分與Degree值大于35的11個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，以得到的結(jié)合能值作圖，其中京尼平苷酸與桃葉珊瑚苷與核心靶點(diǎn)對(duì)接失敗，其余對(duì)接結(jié)果見圖6。圖中橫坐標(biāo)代表靶蛋白，縱軸為杜仲葉活性成分，圖中顏色越綠代表結(jié)合能越低，顏色越紅代表結(jié)合能越高，最低結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol即表明藥效分子與靶蛋白對(duì)接效果良好，結(jié)合能越低，表明分子與靶蛋白結(jié)合能力越佳。結(jié)果表明山柰酚與活性位點(diǎn)附近的3個(gè)Tyr-119及Pro-117、Lys-98這5個(gè)氨基酸形成氫鍵結(jié)合到TNF，結(jié)合能為-8.48 kJ/mol，與活性位點(diǎn)附近的Ser-153、Arg-191、Trp-192、Gly-230這4個(gè)氨基酸形成氫鍵結(jié)合到MAPK1，結(jié)合能為-8.08 kJ/mol，與活性位點(diǎn)附近的Tyr-13、Leu-8、Gly-12、Asp-17、Cys-14這5個(gè)氨基酸形成氫鍵結(jié)合到EGF，結(jié)合能為-7.59 kJ/mol;兒茶素與活性位點(diǎn)附近的2個(gè)Tyr-199及Gln-61、Lys-98這4個(gè)氨基酸形成氫鍵結(jié)合到TNF，結(jié)合能為-7.59;金絲桃苷活性位點(diǎn)附近的2個(gè)Glu-116、Ser-99以及2個(gè)Tyr-119這4個(gè)氨基酸形成氫鍵結(jié)合到TNF，結(jié)合能為-7.59，分子與蛋白之間具有強(qiáng)烈的結(jié)合活性。分別選擇5個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白具有最低結(jié)合能的藥效成分繪制對(duì)接模式圖。見圖7。

3 討論

杜仲屬中醫(yī)補(bǔ)陽藥，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨之效，在臨床使用廣泛，療效顯著。但杜仲為單科、單屬、單種類植物，新藥源的開辟只能從其自身其他部位入手，故杜仲葉能否代替杜仲皮是目前杜仲新藥源的研究熱點(diǎn)。本研究基于中藥-靶點(diǎn)-基因-疾病的研究思路，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)，從微觀角度來闡述杜仲葉治療OP的分子作用機(jī)制，為臨床能否使用杜仲葉來代替杜仲皮治療OP提供理論依據(jù)。

本研究通過TCMSP檢索及查閱文獻(xiàn)共篩選得到杜仲葉7個(gè)有效成分，即山柰酚、兒茶素、槲皮素、綠原酸[14-15]、京尼平苷酸、桃葉珊瑚苷[16]、金絲桃苷[17]可能具有防治OP的作用;對(duì)應(yīng)活性成分較多的11個(gè)靶點(diǎn)MAPK1、STAT3、VEGFA、IL6、TP53、EGF、AKT1、JUN、MAPK8、EGFR、TNF可能為杜仲葉治療OP的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。黎海霞等[18]通過GWGS（Genome-wide Global Significance）芯片整合分析識(shí)別篩選出10個(gè)外周血細(xì)胞中與OP相關(guān)的樞紐基因，其中AKT1基因是度最大的樞紐基因，其影響著破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的功能;Zhang等[19]對(duì)原發(fā)性O(shè)P的治療候選基因做了表達(dá)譜的分析，根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)及其子網(wǎng)絡(luò)，得出了EGFR、AKT1和轉(zhuǎn)錄因子CTNNB1是程度較高的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，其與成骨細(xì)胞分化及破骨細(xì)胞形成密切相關(guān)，可作為OP的治療靶點(diǎn)。骨代謝生化指標(biāo)臨床應(yīng)用專家共識(shí)（2020）中認(rèn)為IL-6能夠?qū)Τ晒羌?xì)胞和破骨細(xì)胞的生長和功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，其與OP的發(fā)生密切相關(guān)，IL-6升高可作為機(jī)體破骨細(xì)胞功能活躍的標(biāo)志[20]，并且有研究表明，OP外周血血清中IL-6的表達(dá)水平升高，且與OP患者骨密度降低程度正相關(guān)[21]。TNF具有TNF-α與TNF-β 2種亞型，而TNF-α由活化的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，占TNF總活性的70%～95%，目前常說的TNF多指TNF-α，而TNF-α是重要的破骨細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，其與OP的發(fā)生密切相關(guān)。一項(xiàng)關(guān)于TNF-α基因多態(tài)性與骨密度和骨質(zhì)疏松風(fēng)險(xiǎn)的Meta分析結(jié)果顯示，TNF-α基因G308A多態(tài)性可作為篩選、診斷和治療OP的潛在候選生物標(biāo)志物，有助于提高臨床對(duì)OP患者的個(gè)體化治療水平[22]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）在體內(nèi)或者體外環(huán)境中分化為成骨細(xì)胞，而TNF-α通過核因子κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路損害BMSCs的成骨作用[23]，Yuan等[24]研究發(fā)現(xiàn)杜仲葉提取物的主要黃酮類成分槲皮素能夠通過拮抗TNF-α而改善大鼠的骨質(zhì)疏松。VEGFA是VEGF家族的同源基因，已有研究證實(shí)原發(fā)性成骨細(xì)胞中存在功能性VEGF受體，使VEGF在促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和骨重塑中發(fā)揮作用[25]。最近的一項(xiàng)研究也表明，在BMSCs中，VEGFA過表達(dá)可增強(qiáng)細(xì)胞活力和增殖，Ⅰ型和Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)[26]。Min等[27]研究表明VEGFA也在破骨細(xì)胞分化中發(fā)揮作用。c-Jun是與細(xì)胞增殖相關(guān)的原癌基因，是調(diào)控細(xì)胞分化和發(fā)育的即刻早期基因，亦稱為快速反應(yīng)基因，c-Jun基因產(chǎn)物直接與成骨細(xì)胞增殖和破骨細(xì)胞的分化、成熟及功能密切相關(guān)[28]。環(huán)氧合酶-2（COX-2）亦稱為誘導(dǎo)型前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2），Chen等[29]研究發(fā)現(xiàn)敲除感覺神經(jīng)中的前列腺素E 2受體4（EP4）或者成骨細(xì)胞中的COX-2基因可顯著降低成年小鼠的骨骼體積。而表皮細(xì)胞生長因子（EGF）控制促炎信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并調(diào)節(jié)BMSCs的增殖，Müller-Deubert等[30]研究表明表皮生長因子是BMSCs的機(jī)械增敏劑，它可能與健康的骨重建和骨折愈合有關(guān)。MAP激酶負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄因子c-Jun在細(xì)胞核內(nèi)的特異性磷酸化，是c-Jun氨基端激酶。因此，MAP激酶也被稱為c-Jun氨基端激酶（JNK），JNK是與破骨細(xì)胞發(fā)生相關(guān)的最關(guān)鍵的通路之一[31]。Lee等[32]用甲基乙二醛處理RAW264.7巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)JNK是最有可能參與激活破骨細(xì)胞的因子。

GO富集分析結(jié)果顯示杜仲葉有效成分的活性靶點(diǎn)是通過影響含氮化合物的合成，細(xì)胞及成分遷移運(yùn)動(dòng)，蛋白酶及蛋白激酶的活性等方面來防治OP的發(fā)生的。KEGG富集分析結(jié)果顯示動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路、PI3K-AKT信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路可能是杜仲葉防治OP的主要通路。動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路及TNF信號(hào)通路下游通路包括核因子κB號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、凋亡信號(hào)通路等。Yin等[33]研究發(fā)現(xiàn)甘氨酸可以抑制破骨細(xì)胞形成和骨吸收功能，并能部分抑制去卵巢小鼠的骨質(zhì)疏松，而這些作用主要是通過抑制RANKL誘導(dǎo)的核因子κB、ERKB和JNK 3條通路的激活來實(shí)現(xiàn)的。MAPK信號(hào)通路對(duì)于破骨細(xì)胞的形成和活化具有重要作用，沈云玲等[34]研究發(fā)現(xiàn)阿侖膦酸鈉可能通過調(diào)控核因子κB和MAPK信號(hào)通路產(chǎn)生抗OP的作用。季康等[35]研究發(fā)現(xiàn)唑來膦酸注射液聯(lián)合降鈣素治療老年性骨質(zhì)疏松療效顯著，可降低血清IL-6、TNF-α水平。PI3K-AKT信號(hào)通路是細(xì)胞凋亡的重要通路，毛滔等[36]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA NEAT1可能通過抑制PI3K/AKT/Bcl-2信號(hào)通路促進(jìn)OP。李運(yùn)江[37]研究認(rèn)為IL-17對(duì)成骨細(xì)胞生長起消極作用，不通過自噬介導(dǎo)，IL-17負(fù)向調(diào)控成骨細(xì)胞的分化，可能部分通過自噬作用介導(dǎo)。鐘航等[38]研究發(fā)現(xiàn)HIF-1信號(hào)通路參與了小鼠絕經(jīng)后OP的病理學(xué)改變，抑制HIF-1信號(hào)通路可改善PMOP的嚴(yán)重程度，而PMOP破骨細(xì)胞內(nèi)HIF-1信號(hào)通路的上調(diào)可能與AKT、ERK、核因子κB這3條信號(hào)通路有關(guān)。這些富集度高的信號(hào)通路主要通過減輕氧化應(yīng)激損傷、抑制破骨細(xì)胞形成、促進(jìn)成骨細(xì)胞形成等作用發(fā)揮防治骨質(zhì)疏松作用。

綜上所述，杜仲葉對(duì)治療OP具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的治療特點(diǎn);同時(shí)也啟示我們?cè)谥委烵P方面，杜仲葉可能能夠作為杜仲皮的替代品;但是上述研究也存在一定的局限性，需要基礎(chǔ)研究及臨床試驗(yàn)的進(jìn)一步確證。

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（2021-02-24收稿 本文編輯：魏慶雙）