ERK1/2信號(hào)蛋白和蛋白降解酶在骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨/軟骨下骨中的表達(dá)及其意義

蒲沛東，馬騰洋，周士平，張賽，韓飛，馬青源，王超，王維山*

1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科中心，新疆石河子 832000；2解放軍69337部隊(duì)衛(wèi)生隊(duì)，新疆塔城 834600；3解放軍69245部隊(duì)醫(yī)院骨科，烏魯木齊 830000；4解放軍32330部隊(duì)衛(wèi)生隊(duì)，烏魯木齊 830000

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種以不同程度的關(guān)節(jié)疼痛、僵硬、功能障礙和畸形為特征的慢性退行性關(guān)節(jié)病[1-2]。OA特征性病理改變?yōu)檐浌墙到馀c軟骨下骨代謝紊亂[3]。研究發(fā)現(xiàn)，軟骨降解和軟骨下骨改變與OA發(fā)展存在內(nèi)在聯(lián)系[4-5]，但由于目前對(duì)OA病變的認(rèn)識(shí)不足，尚無有效的方法阻止OA的進(jìn)展。軟骨降解和軟骨下骨代謝改變共同促進(jìn)OA的發(fā)生發(fā)展，因此探討導(dǎo)致二者共同信號(hào)的通路及蛋白水解酶的作用對(duì)調(diào)控和阻止疾病進(jìn)展可能具有重要意義。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal regulated kinases 1/2，ERK1/2)是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)家族的一員，對(duì)骨和軟骨的正常生長(zhǎng)發(fā)育及代謝起著重要的調(diào)控作用，且在OA中呈高表達(dá)[6]。蛋白降解酶是一類催化多肽或蛋白水解的酶，可降解軟骨基質(zhì)使軟骨發(fā)生退變，降低關(guān)節(jié)的穩(wěn)定性，促進(jìn)OA的發(fā)生[7]，尤其以基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)[8]和聚蛋白多糖酶(Aggrecanase)目前研究最多且發(fā)揮作用最為顯著。研究發(fā)現(xiàn)，尿激酶型纖溶酶激活物(urokinase type plasmin activator，uPA)激活后，MMP-3即可發(fā)揮較強(qiáng)的軟骨基質(zhì)降解作用，且可與激活的MMP-9發(fā)揮較強(qiáng)的級(jí)聯(lián)放大作用，從而促進(jìn)軟骨降解[9-10]。本課題組前期對(duì)OA臨床標(biāo)本進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，軟骨/軟骨下骨中的MMPs不僅參與軟骨降解，還在軟骨下骨代謝過程中發(fā)揮作用[11]。聚蛋白多糖酶是帶有血小板凝血酶敏感蛋白樣模體的解整連蛋白金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs，ADAMTs)家族成員，能與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)結(jié)合并參與其代謝過程[12]。在小鼠模型中已經(jīng)證實(shí)，敲除ADAMT5基因可抑制OA和炎癥性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展[13]，由此可見，ADAMT5在OA病變中發(fā)揮重要作用。軟骨下骨位于軟骨與骨組織之間，其改變是OA發(fā)生機(jī)制的重要組成部分[14-15]，因此對(duì)軟骨下骨微結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究也可為探討OA病變機(jī)制提供新的依據(jù)。本研究探討了ERK1/2信號(hào)蛋白與OA致病相關(guān)蛋白降解酶在軟骨/軟骨下骨中的表達(dá)及其意義，以期為OA的早期診斷及治療提供新的方法與思路。

1 資料與方法

1.1 試劑及儀器 ERK1/2、pERK1/2、MMP-3、MMP-9、ADAMT5一抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；QuantiNova SYBR Green PCR Kit (500)購(gòu)自德國(guó)QIAGEN GmbH公司；SDS-PAGE Gel Kit購(gòu)自北京Solarbio科技有限公司；Trizol試劑和SuperScriptFirst-Strand Synthesis System反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。PCR擴(kuò)增儀(AG 22331 Hambrug)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf Corporation公司；紫外分光光度儀購(gòu)自北京Tiangen公司。

1.2 組織標(biāo)本 收集2017年12月－2019年12月于石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)外科住院的明確診斷為OA并行全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的50例患者的膝關(guān)節(jié)脛骨平臺(tái)樣本及創(chuàng)傷科因外傷截肢的10例患者(無任何形式的關(guān)節(jié)疾病)的健康膝關(guān)節(jié)脛骨平臺(tái)樣本(作為對(duì)照)。50例OA患者中，男24例，女26例，年齡(69.3±5.2)歲。10例截肢患者中，男6例，女4例，年齡(56.1±4.4)歲。根據(jù)OARSI-Modified Manking評(píng)分及病變程度將所有標(biāo)本分為對(duì)照組、輕度組(OARSI-Modified評(píng)分1～15分，Manking評(píng)分1～9分)及重度組(OARSI-Modified評(píng)分16～24分，Manking評(píng)分10～14分)。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書，本研究經(jīng)石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2017-119-01)。

1.3 納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 參照2014年國(guó)際骨關(guān)節(jié)炎研究協(xié)會(huì)制定的膝關(guān)節(jié)OA診斷標(biāo)準(zhǔn)，在排除類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、腫瘤性疾病及創(chuàng)傷的情況下，符合以下1+2條、1+3+5+6條或1+4+5+6條即可診斷為OA。(1)患者自覺膝關(guān)節(jié)有疼痛感；(2)膝關(guān)節(jié)負(fù)重位X線片顯示膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)間隙變窄、不對(duì)稱，關(guān)節(jié)軟骨硬化增生，并有骨贅，在硬化的關(guān)節(jié)軟骨下方出現(xiàn)囊性改變；(3)完成關(guān)節(jié)液實(shí)驗(yàn)室檢查2次，檢查結(jié)果符合OA診斷標(biāo)準(zhǔn)：關(guān)節(jié)液清亮，黏稠度正常，淡黃色，同時(shí)炎性指標(biāo)如紅細(xì)胞沉降率(ESR)及C反應(yīng)蛋白處于正常范圍；(4)膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度尚且存在，沒有關(guān)節(jié)強(qiáng)直等表現(xiàn)；(5)年齡≥40歲；(6)關(guān)節(jié)活動(dòng)時(shí)具有骨擦音或感覺到骨擦感。

對(duì)照組排除有膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷史、其他形式的關(guān)節(jié)炎、代謝性骨病、骨腫瘤或者服用影響骨重塑的藥物者，以及未包含足夠的軟骨下骨脛骨平臺(tái)(軟骨下骨板和軟骨下小梁骨的總厚度＜5 mm)者。

1.4 HE染色觀察軟骨退變情況及破壞程度 脛骨平臺(tái)組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟、乙醇水化后，于37 ℃恒溫0.4%胃蛋白酶溶液中修復(fù)30 min；PBS漂洗3次，滴加3%過氧化氫修復(fù)30 min；PBS漂洗3次，5%胎牛血清封閉30 min。蘇木精復(fù)染30 s、1%鹽酸酒精酸化3～5 s后沖洗，返藍(lán)10 min；PBS漂洗3次，經(jīng)95%乙醇清洗、無水乙醇脫水、二甲苯透明后，光學(xué)樹脂封片。其中細(xì)胞核呈紫藍(lán)色，軟骨基質(zhì)呈藍(lán)色。顯微鏡下觀察軟骨細(xì)胞數(shù)量及染色深度并進(jìn)行OARSI評(píng)分。OARSI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：(1)6個(gè)等級(jí)。1級(jí)關(guān)節(jié)軟骨表面尚完整；2級(jí)關(guān)節(jié)軟骨表面不連續(xù)，在中層軟骨區(qū)域伴隨出現(xiàn)細(xì)胞增殖；3級(jí)軟骨表面可見垂直裂紋，其深度可達(dá)中層軟骨；4級(jí)出現(xiàn)軟骨侵蝕，軟骨基質(zhì)丟失；5級(jí)鈣化軟骨層或軟骨下骨完全暴露；6級(jí)關(guān)節(jié)變形及微骨折，有骨贅形成。(2)4個(gè)階段。階段1指受累關(guān)節(jié)軟骨小于整個(gè)軟骨表面的10%，階段2指受累關(guān)節(jié)軟骨占整個(gè)軟骨表面的10%～25%，階段3指受累關(guān)節(jié)軟骨占整個(gè)軟骨表面的25%～50%，階段4指受累關(guān)節(jié)軟骨范圍達(dá)到整個(gè)軟骨表面的50%及以上。等級(jí)和階段相乘后得到軟骨破壞程度的最終評(píng)分，評(píng)分越高表明關(guān)節(jié)軟骨破壞程度越重。

1.5 免疫組化染色檢測(cè)ERK1/2、pERK1/2、MMP-3、MMP-9、ADAMT5的表達(dá)情況 脛骨平臺(tái)組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟、乙醇水化后，于0.4%胃蛋白酶溶液中置于37 ℃恒溫箱靜置修復(fù)30 min；PBS漂洗3次，滴加3%過氧化氫修復(fù)30 min；PBS漂洗3次，5%胎牛血清封閉液封閉30 min；滴加ERK1/2(1:50)、pERK1/2(1:200)、MMP-3(1:100)、MMP-9(1:100)、ADAMT5(1:50)一抗4 ℃孵育過夜，PBS漂洗3次；滴加山羊抗兔IgG二抗37 ℃孵育30 min；DAB顯色后沖洗，經(jīng)蘇木精復(fù)染30 s、1%鹽酸酒精酸化3～5 s、沖洗至無顏色后，返藍(lán)10 min；清洗及脫水后光學(xué)樹脂封片。顯微鏡下計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及著色強(qiáng)度來判斷陽(yáng)性強(qiáng)度。判斷標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分比＜5%、5%～25%、25%～50%、50%～75%、75%～100%，分別計(jì)0、1、2、3、4分；著色強(qiáng)度為無著色、淺棕黃色、棕黃色、棕褐色，分別計(jì)0、1、2、3分。由兩項(xiàng)評(píng)分相乘獲得最終積分，0～1、2～4、5～8、9～12分分別評(píng)定為-、+、++、+++，其中-為陰性，+為弱陽(yáng)性，++/+++為強(qiáng)陽(yáng)性。

1.6 Western blotting檢測(cè)ERK1/2、pERK1/2、MMP-3、MMP-9、ADAMT5蛋白的表達(dá) 將脛骨平臺(tái)組織樣品研磨成粉狀收集到1.5 ml EP管中，加入1 ml RIPA及蛋白酶抑制劑，4 ℃孵育過夜；勻漿90 min，4 ℃下12 000 r/min離心30 min，取上清，分裝于EP管中。使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，然后向EP管中加入1/4的Loading Buffer煮沸10 min，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩ｋ娪巨D(zhuǎn)膜后將PVDF膜置于5% BSA中室溫封閉2 h，于搖床上用TBST洗膜5 min×3次，滴加一抗4 ℃孵育過夜；TBST漂洗3次，滴加二抗室溫孵育2 h。TBST漂洗3次，洗膜后顯影，根據(jù)內(nèi)參條帶灰度值調(diào)整上樣量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)10次。

1.7 實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)ERK1/2、MMP-3、MMP-9、ADAMT5mRNA的表達(dá) 采用QIAGEN試劑盒和Trizol試劑提取脛骨平臺(tái)組織總RNA，使用SuperScriptFirst-Strand Synthesis System反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，行RT-qPCR檢測(cè)。反應(yīng)體系20 μl：SYBR GreenMaster PCR Mix 10 μl、DPEC水5 μl、上下游引物各1 μl、Rox 2 μl及cDNA 1 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性30 s，60 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分析ERK1/2、MMP-3、MMP-9和ADAMT5mRNA相對(duì)表達(dá)水平。引物序列如表1所示。

表1 RT-qPCR引物序列Tab.1 Primer sequence of RT-qPCR

1.8 Micro-CT掃描分析軟骨下骨的厚度 沿長(zhǎng)軸掃描標(biāo)本(掃描精度：18 μm；過濾器：0.5 ml Al)，180°螺旋掃描(電壓60 kV，電流368 μA)，重建圖像數(shù)據(jù)后觀察冠狀、矢狀和橫斷面結(jié)構(gòu)。經(jīng)3D重建后，選擇人類脛骨平臺(tái)中軟骨下骨的感興趣區(qū)(ROI，9 mm×9 mm×5 mm，垂直于關(guān)節(jié)表面)，測(cè)量ROI的骨礦物質(zhì)密度(BMD)、骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)及骨小梁間距(Tb.Sp)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M(Q1，Q3)表示，組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 OA脛骨平臺(tái)標(biāo)本大體形態(tài) 如圖1所示，OA脛骨平臺(tái)外側(cè)面的關(guān)節(jié)軟骨輕度磨損，軟骨表面相對(duì)完整；內(nèi)側(cè)平臺(tái)表面不均勻，關(guān)節(jié)受力的區(qū)域和嚴(yán)重磨損的區(qū)域有軟骨剝脫跡象，表面骨贅增生，可見軟骨下骨裸露和軟骨下骨鈣化。

圖1 OA脛骨平臺(tái)大體觀察Fig.1 Gross observation of knee OA and tibial plateau

2.2 各組軟骨退變情況及破壞程度 根據(jù)OARSIModified Manking評(píng)分，50例OA患者中，輕度組31例，重度組19例。HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組軟骨表面完整無磨損，未見硬化軟骨，未見暴露的軟骨下骨；輕度組軟骨變薄，軟骨細(xì)胞層次排列不清，軟骨下骨厚度增加，軟骨表面不均勻且有深達(dá)軟骨下骨的裂縫；重度組軟骨幾乎完全消失，軟骨下骨明顯暴露并變形，鈣化軟骨增厚，軟骨下骨區(qū)骨細(xì)胞減少、骨小梁增粗，骨小梁排列紊亂(圖2)。OARSI評(píng)分結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，輕度組、重度組OARSI評(píng)分明顯升高[(8.14±0.56)分、(23.33±0.17)分vs. (3.53±0.11)分，P＜0.05]，且重度組高于輕度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖2)。

圖2 各組軟骨退變情況及破壞程度(HE染色，n=10)Fig.2 Degeneration and damage degree of cartilage in each group (HE staining, n=10)

2.3 各組軟骨下骨中ERK1/2、pERK1/2表達(dá)情況 免疫組化染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，輕度組和重度組軟骨下骨中pERK1/2多為高度表達(dá)(χ2=65.618，P＜0.001)，特別是在軟骨下骨靠近軟骨區(qū)域，但各組ERK1/2表達(dá)情況無明顯差異(圖3A)。Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，輕度組和重度組軟骨下骨中pERK1/2蛋白表達(dá)水平升高(0.42±0.03、0.51±0.07vs. 0.21±0.05，P＜0.05)，且重度組高于輕度組(P＜0.05，圖3B)。RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，各組ERK1/2mRNA表達(dá)水平無明顯差異(P＞0.05，圖3C)。

圖3 各組軟骨下骨中ERK1/2、pERK1/2表達(dá)情況Fig.3 Expression of ERK1/2 and pERK1/2 in subchondral bone of each group

2.4 各組軟骨/軟骨下骨中MMP-3、MMP-9和ADAMT5蛋白和mRNA表達(dá)情況 免疫組化染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，輕度組和重度組軟骨/軟骨下骨中MMP-3、MMP-9和ADAMT5表達(dá)水平明顯升高(χ2=43.927，P＜0.001，n=47)，且重度組高于輕度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖4A)。

Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，輕度組和重度組軟骨/軟骨下骨中MMP-3(0.43±0.04、0.57±0.04vs. 0.14±0.08，P＜0.001)、MMP-9(0.32±0.06、0.46±0.03vs. 0.12±0.05，P＜0.01)、ADAMT5(0.62±0.01、0.85±0.06vs.0.24±0.04，P＜0.05)蛋白表達(dá)水平升高，且重度組高于輕度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖4B)。

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，輕度組和重度組軟骨/軟骨下骨中MMP-3(30.44±0.47、108.82±0.11vs. 1.00±0.08，P＜0.05)、MMP-9(5.63±0.31、36.94±0.24vs. 1.00±0.10，P＜0.05)、ADAMT5(18.09±0.38、93.52±0.61vs. 1.06±0.09，P＜0.05) mRNA相對(duì)表達(dá)水平升高，且重度組高于輕度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖4C)。

圖4 MMP-3、MMP-9和ADAMT5蛋白和mRNA在軟骨/軟骨下骨中的表達(dá)情況Fig.4 Expression of MMP-3, MMP-9 and ADAMT5 protein and mRNA in cartilage and subchondral bone

2.5 Micro-CT對(duì)軟骨下骨微結(jié)構(gòu)改變的鑒定情況

Micro-CT掃描顯示，對(duì)照組軟骨厚度正常，骨小梁排列稀疏無增粗，相互連接呈拱橋狀；輕度組和重度組中軟骨厚度降低，軟骨下骨骨小梁排列紊亂，小梁厚度增加，間隙變窄，相互連接呈現(xiàn)為厚板狀。與對(duì)照組比較，輕度組和重度組軟骨/軟骨下骨中BV/TV、Tb.Th、Tb.N、BMD明顯增高，Tb.Sp明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖5、表2)。

表2 各組軟骨下骨感興趣區(qū)域BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp、BMD比較(±s)Tab.2 Comparison of subchondral bone regions of interest BV/TV, Tb.Th, Tb.N, Tb.Sp and BMD in each group (±s)

表2 各組軟骨下骨感興趣區(qū)域BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp、BMD比較(±s)Tab.2 Comparison of subchondral bone regions of interest BV/TV, Tb.Th, Tb.N, Tb.Sp and BMD in each group (±s)

BV/TV. 骨體積分?jǐn)?shù)；Tb.Th. 骨小梁厚度；Tb.N. 骨小梁數(shù)量；Tb.Sp. 骨小梁間距；BMD. 骨密度；與對(duì)照組比較，(1)P＜0.05；與輕度組比較，(2)P＜0.05

參數(shù) 對(duì)照組(n=10)輕度組(n=19)重度組(n=31) P BV/TV 0.08±0.02 0.75±0.09(1) 0.81±0.05(1)(2) 0.003 Tb.Th(mm) 0.06±0.02 0.22±0.07(1) 0.22±0.06(1) 0.024 Tb.N(1/mm) 0.85±0.11 4.32±0.73(1) 3.45±0.79(1)(2) 0.013 Tb.Sp(mm) 0.81±0.29 0.06±0.01(1) 0.05±0.01(1) 0.046 BMD(mg/cm2) 25.49±2.19 502.25±24.69(1) 549.49±17.79(1)(2) 0.005

圖5 各組軟骨下骨感興趣區(qū)域micro-CT掃描冠狀面圖像Fig.5 Micro CT scanning coronal images of regions of subchondral bone regions interest in each group

3 討 論

MAPK可介導(dǎo)多種細(xì)胞凋亡[16]，調(diào)控成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的分化及增殖。越來越多的證據(jù)表明，MAPK的激活在OA病理改變中發(fā)揮主導(dǎo)作用，主要通過刺激軟骨細(xì)胞[17]和成骨細(xì)胞[18]的分化及增殖來誘導(dǎo)MMPs的表達(dá)。ERK1/2信號(hào)通路是MAPK最為重要的激活途徑，與軟骨基質(zhì)降解及軟骨細(xì)胞肥大分化有關(guān)[19]。研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制IL-1β來誘導(dǎo)ERK途徑的激活可延緩OA的進(jìn)展[20]，與靶向抑制MAPK通路(特別是抑制ERK1/2信號(hào)通路)的作用一致[21]，且該作用在骨性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型中也得到證實(shí)[22]。目前對(duì)ERK1/2信號(hào)通路在人軟骨/軟骨下骨中表達(dá)的研究較少，為此本研究對(duì)人OA脛骨平臺(tái)標(biāo)本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)軟骨/軟骨下骨中ERK1/2的磷酸化增加且與病變程度呈正相關(guān)，與Prasadam等[23]在OA軟骨細(xì)胞層面的研究結(jié)果相符。趙晉等[24]在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，軟骨下骨層面pERK1/2信號(hào)蛋白發(fā)生了改變，但不同退變程度關(guān)節(jié)中ERK1/2蛋白和mRNA的表達(dá)差異并不明顯。

MMP-3又稱間充質(zhì)裂解酶[25]，在OA患者的軟骨、滑膜、滑液和外周血中呈高表達(dá)[26]，其作用為降解軟骨基質(zhì)。MMP-9又稱明膠酶[27]，目前已有研究證實(shí)其在OA軟骨組織中呈高表達(dá)[28]。β-連環(huán)蛋白可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞中MMP-9高表達(dá)[29]，從而導(dǎo)致小鼠膝關(guān)節(jié)OA的發(fā)生，由此推測(cè)，MMP-9在軟骨下骨中也呈高表達(dá)，本研究證實(shí)了這一推測(cè)。越來越多的證據(jù)表明，ERK激活后可介導(dǎo)MMPs的產(chǎn)生，從而促進(jìn)軟骨降解[30-31]。軟骨降解與軟骨/軟骨下骨的相互作用有關(guān)，且MMPs在軟骨/軟骨下骨中的表達(dá)增加也促進(jìn)了兩者的相互作用。本研究檢測(cè)了人OA脛骨平臺(tái)標(biāo)本軟骨/軟骨下骨中ERK1/2及pERK1/2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)pERK1/2表達(dá)增加，且同一區(qū)域中MMP-3和MMP-9也呈高表達(dá)，由此推測(cè)，軟骨下骨中ERK1/2信號(hào)通路的激活可能會(huì)促進(jìn)MMPs的合成增加，最終導(dǎo)致軟骨和軟骨下骨相互作用增強(qiáng)并發(fā)生軟骨降解。ADAMT5是一種可在沒有MMPs參與情況下水解聚集蛋白聚糖的酶[32-33]。研究證實(shí)，ADAMT5在OA動(dòng)物模型[34]和人關(guān)節(jié)軟骨外植體[35]中均呈高表達(dá)。本研究檢測(cè)了人OA脛骨平臺(tái)標(biāo)本軟骨/軟骨下骨中ADAMT5的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ADAMT5表達(dá)增加。最近有學(xué)者對(duì)OA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞(ACC)和軟骨下骨成骨細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，ADAMTS和MMPs的上調(diào)與MAPK-ERK1/2信號(hào)的激活有關(guān)，而MAPK-ERK抑制劑PD98059可逆轉(zhuǎn)共培養(yǎng)細(xì)胞中ADAMTS和MMPs的過表達(dá)[23]，與本研究在人OA脛骨平臺(tái)標(biāo)本軟骨下骨層面的檢測(cè)結(jié)果一致。

機(jī)體通過協(xié)調(diào)骨形成和骨吸收來實(shí)現(xiàn)骨重塑，其中成骨細(xì)胞沉積鈣化骨基質(zhì)而破骨細(xì)胞再吸收骨[36-37]?；罨腅RK1/2可調(diào)控軟骨下骨中成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化而影響骨形成[38-39]，但OA關(guān)節(jié)中發(fā)生了異常骨重塑，軟骨下骨結(jié)構(gòu)的變化導(dǎo)致應(yīng)力不均勻及關(guān)節(jié)軟骨的退化，進(jìn)一步導(dǎo)致未結(jié)合的骨重塑發(fā)生。本研究micro-CT及免疫組化染色結(jié)果顯示，與完整的軟骨組織相比，軟骨區(qū)損傷的軟骨下骨微結(jié)構(gòu)發(fā)生異常增生，ERK1/2蛋白的磷酸化增加，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化而導(dǎo)致異常骨重塑，進(jìn)而誘發(fā)OA的發(fā)展。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，OA軟骨/軟骨下骨中pERK1/2、MMP-3、MMP-9及ADAMT5呈高表達(dá)，且軟骨下骨微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，而pERK1/2表達(dá)增加可能是蛋白降解酶活性增強(qiáng)及軟骨下骨微結(jié)構(gòu)改變的原因之一。OA的病理機(jī)制復(fù)雜，其發(fā)生發(fā)展不僅與軟骨退變有關(guān)，還與軟骨下骨有關(guān)，但本研究缺乏對(duì)上述因子的對(duì)照實(shí)驗(yàn)，須進(jìn)一步在細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物模型中利用抑制劑加以驗(yàn)證，以期為OA的早期診斷及治療提供更多的理論依據(jù)。