安五脂素對(duì)小鼠肺纖維化的改善作用及其機(jī)制研究

陳悅琪，陳奕良，郭春花，徐銘晨，方菁，王宇瑤，郝凱敏，王春靖，王春梅，莊文越*

1北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林省吉林市 132013；2吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，吉林省吉林市 132013；3北華大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，吉林省吉林市 132013；4北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林省吉林市 132013

肺纖維化是一種以成纖維細(xì)胞增殖分化、肺纖維灶不斷生成聚集和大量細(xì)胞外基質(zhì)沉積，并伴有炎癥損傷、組織結(jié)構(gòu)破壞等特征的肺部疾病，會(huì)對(duì)肺部造成不可逆轉(zhuǎn)的損害[1]，目前臨床主要應(yīng)用免疫抑制劑聯(lián)合糖皮質(zhì)激素、肺移植等方法進(jìn)行治療，或使用吡非尼酮、尼達(dá)尼布等藥物延緩其進(jìn)展，但一直未發(fā)現(xiàn)療效好且不良反應(yīng)少的特效藥物。氧化應(yīng)激是多種器官(包括肺)纖維化的重要分子機(jī)制[2]，主要包括大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生和(或)耗盡的抗氧化防御引起的所有分子、細(xì)胞和組織異常[3]。鐵死亡最早由Dixon發(fā)現(xiàn)并提出[4]，是一種鐵依賴的非凋亡細(xì)胞死亡形式，通過(guò)積累ROS和脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，引發(fā)大量鐵沉積促使細(xì)胞死亡。細(xì)胞發(fā)生鐵死亡時(shí)，可產(chǎn)生大量ROS，超過(guò)機(jī)體的清除能力，導(dǎo)致氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡[5]，從而誘發(fā)氧化應(yīng)激，引起肺纖維化。有研究發(fā)現(xiàn)，使用鐵死亡抑制劑(Fer-1)可改善肺纖維化[6]。安五脂素是近年來(lái)從南五味子中新提純的單體，研究發(fā)現(xiàn)其具有抗炎[7]、抗氧化[8]、保肝[9]等功效。目前有研究發(fā)現(xiàn)，安五脂素在小鼠疲勞模型中可通過(guò)Nrf2/ARE信號(hào)通路發(fā)揮抗氧化作用[10]，但其在肺纖維化中對(duì)氧化應(yīng)激與鐵死亡的干預(yù)作用尚不清楚。本研究應(yīng)用博來(lái)霉素(bleomycin，BLM)誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1誘導(dǎo)的HFL-1細(xì)胞模型探討安五脂素的抗纖維化作用，以期為臨床治療肺纖維化提供新的藥物靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 BLM購(gòu)自杭州瀚暉制藥有限公司；安五脂素購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司；TGF-β1(GF346)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；N-乙酰半胱氨酸(S0077)、CCK-8試劑盒(C0042)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；超氧化物歧化酶(SOD，A001-3)、丙二醛(MDA，S0131S)、谷胱甘肽(GSH，A006-2-1)、ROS(E004-1-1)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px，A005-1-2)、過(guò)氧化氫酶(CAT，A007-1-1)及羥脯氨酸(HYP，A030-2-1)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；β-actin(AC038)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA，A7248)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4(GPX4，A13309)、溶質(zhì)載體家族7成員11(SLC7A11，A2413)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(TF，A1448)、下調(diào)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(TFR1，A5865)多克隆抗體購(gòu)自武漢ABclonal生物科技有限公司；RNA抽提試劑盒(RC101-01)、HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(R223-01)、2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (Q711-02/03)購(gòu)自美國(guó)Vazyme公司。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及給藥 雄性ICR小鼠65只，體重(20±2) g，購(gòu)自長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(吉)-2018-0007]。隨機(jī)分成對(duì)照組、BLM模型組、安五脂素低劑量組、安五脂素高劑量組[11]與N-乙酰半胱氨酸組，每組13只。BLM模型組、安五脂素低劑量組、安五脂素高劑量組[10]及N-乙酰半胱氨酸組采用氣管灌注方法給予5 mg/kg BLM誘導(dǎo)肺纖維化，對(duì)照組經(jīng)氣管灌注給予等量生理鹽水。造模24 h后，對(duì)照組、BLM模型組灌胃給予0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液，N-乙酰半胱氨酸組和安五脂素低、高劑量組分別灌胃給予N-乙酰半胱氨酸(150 mg/kg)[11]和安五脂素(1 mg/kg、4 mg/kg)[10]治療21 d。飼養(yǎng)過(guò)程中，小鼠自由進(jìn)食及飲水，每天觀察小鼠的行為狀態(tài)，每2 d記錄1次小鼠體重，觀察體重變化。末次給藥后小鼠禁食不禁水12 h，眶周靜脈取血，待凝固后3000 r/min離心10 min收集血清，并取肺組織。本研究經(jīng)北華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批(20191202)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合國(guó)家和單位有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的管理和使用規(guī)定。

1.2.2 肺組織病理學(xué)染色 取各組小鼠左肺，于4%甲醛溶液中固定24 h、脫水、石蠟包埋、切片(厚度4 μm)，行HE染色和Masson三色染色。使用光學(xué)顯微鏡(200×)觀察肺組織病理形態(tài)并采集圖像，用ImageJ軟件進(jìn)行圖像分析，參照Ashcroft評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行肺纖維化評(píng)分，評(píng)分越高表明肺纖維化程度越嚴(yán)重。Ashcroft評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下。0分：正常肺組織；1分：肺泡或支氣管壁輕微增厚；3分：肺泡或支氣管壁中度增厚，但肺泡結(jié)構(gòu)沒(méi)有明顯破壞；5分：條索狀纖維帶或小范圍纖維灶形成，肺泡結(jié)構(gòu)明顯破壞；7分：肺泡結(jié)構(gòu)嚴(yán)重變形，廣泛的纖維灶形成，呈“蜂窩肺”；8分：肺組織全視野纖維化病變；2、4、6分介于相應(yīng)分?jǐn)?shù)之間。Masson染色的陽(yáng)性區(qū)域使用ImageJ軟件進(jìn)行定量分析。

1.2.3 肺組織HYP含量測(cè)定 取各組小鼠右肺，按照HYP試劑盒說(shuō)明書步驟操作，測(cè)定HYP含量。

1.2.4 qRT-PCR檢測(cè)肺組織中鐵死亡相關(guān)基因mRNA的表達(dá) 取各組小鼠右肺，使用RNA抽提試劑盒提取總RNA，按照HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書步驟合成cDNA。按照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒說(shuō)明書步驟行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，在NCBI(National Coalition Building Institute)中查找基因序列，用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)引物。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s (40個(gè)循環(huán))；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。制備熔解曲線，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析。引物序列如表1所示。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequence of qRT-PCR

1.2.5 Western blotting檢測(cè)肺組織中α-SMA及鐵死亡通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 取各組小鼠右肺，加入RIPA裂解液冰上裂解1 h，4 ℃下12 000 r/min離心5 min，取上清；使用BCA試劑盒測(cè)定總蛋白濃度，10% SDS-PAGE凝膠電泳分離45 μg蛋白并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；5%脫脂奶粉室溫封閉90 min，加入α-SMA(1∶500)、TF(1∶500)、TFR1(1∶500)、GPX4(1∶500)、SLC7A11(1∶500)特異性抗體4 ℃孵育過(guò)夜；用含Twin-80的Tris緩沖液(TBS-T)洗滌，加入抗兔或抗鼠辣根過(guò)氧化物酶抗體(1∶10 000)孵育1 h。增強(qiáng)型ECL顯影液顯色，利用全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)采集和分析數(shù)據(jù)。

1.2.6 小鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè) 取各組小鼠血清，按照SOD、GSH-Px、CAT、GSH、MDA試劑盒說(shuō)明書步驟操作，檢測(cè)抗氧化物酶SOD、GSHPx、CAT活性，抗氧化劑GSH水平，以及脂質(zhì)過(guò)氧化代謝產(chǎn)物MDA含量。

1.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法 HFL-1細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心細(xì)胞庫(kù)，用含10%胎牛血清的F12K培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化，按照1∶2比例瓶傳代。

1.3.1 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HFL-1細(xì)胞，消化后接種于96孔板中(每孔8×103個(gè)/100 μl)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，隨機(jī)分成對(duì)照組與安五脂素給藥組(0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80 μmol/L)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，作用48h后每孔加入10 μl CCK-8溶液孵育1 h。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的光密度值(OD)。

1.3.2 細(xì)胞分組、造模及形態(tài)觀察 待培養(yǎng)瓶中HFL-1細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，設(shè)置對(duì)照組，TGF-β1模型組及安五脂素低、高劑量組。對(duì)照組使用含1%血清的F12K培養(yǎng)基培養(yǎng)，TGF-β1模型組使用5 ng/ml TGF-β1[12]誘導(dǎo)24 h，安五脂素低、高劑量組使用5 ng/ml TGF-β1誘導(dǎo)24 h后分別給予濃度為5、10 μmol/L的安五脂素繼續(xù)培養(yǎng)48h。相應(yīng)濃度安五脂素及TGF-β1溶液均由含1%血清的F12K培養(yǎng)基稀釋而成。各組HFL-1細(xì)胞造模給藥后，于倒置相差顯微鏡下拍照觀察HFL-1細(xì)胞的形態(tài)變化。

1.3.3 HFL-1細(xì)胞中氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè) 待培養(yǎng)瓶中HFL-1細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，按照1.3.2方法分組處理后，用0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗滌3次，取各組細(xì)胞沉淀，按照試劑盒說(shuō)明書步驟操作，檢測(cè)SOD、GSH-Px、CAT活性，GSH水平，以及MDA含量。

1.3.4 ROS水平檢測(cè) HFL-1細(xì)胞接種于6孔板中(1×105個(gè)/ml)，每孔加入10 μmol/L DCFH-DA熒光探針，于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)作用45 min，胰酶消化后，PBS洗滌2次，用PBS重懸后接種于6孔板中，于熒光顯微鏡下(200×)拍照觀察各組HFL-1細(xì)胞ROS活性變化。

1.3.5 qRT-PCR檢測(cè)鐵死亡相關(guān)基因mRNA的表達(dá)待培養(yǎng)瓶中HFL-1細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，按照

1.3.2方法分組處理后，用0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗滌3次，取各組細(xì)胞沉淀使用RNA抽提試劑盒提取總RNA，按照1.2.4方法進(jìn)行后續(xù)操作。引物序列如表1所示。

1.3.6 Western blotting檢測(cè)α-SMA及鐵死亡通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 取各組HFL-1細(xì)胞，按照1.2.5方法進(jìn)行后續(xù)操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，行方差齊性檢驗(yàn)。若方差齊，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；若方差不齊，組間比較采用Welch法行近似方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 安五脂素對(duì)BLM誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化的影響

HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡大小、結(jié)構(gòu)正常，肺泡壁較薄，無(wú)充血、炎癥等表現(xiàn)；BLM模型組肺泡間隔明顯增厚，幾乎沒(méi)有正常的肺泡結(jié)構(gòu)，可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；與BLM模型組比較，安五脂素組炎癥病變有所減輕；與安五脂素低劑量組比較，安五脂素高劑量組炎癥病變明顯減輕。Masson染色結(jié)果顯示，膠原纖維被苯胺藍(lán)染成藍(lán)色，BLM模型組肺泡間隔明顯增厚，肺泡結(jié)構(gòu)被破壞，可見(jiàn)大量藍(lán)染的膠原纖維(P＜0.01)；與BLM模型組比較，安五脂素組的膠原沉積有所減少，且安五脂素高劑量組少于安五脂素低劑量組(P＜0.001) (圖1A、B)。

肺纖維化程度評(píng)分結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，BLM模型組肺纖維化評(píng)分明顯升高(P＜0.001)；與BLM模型組比較，安五脂素低劑量組肺纖維化評(píng)分無(wú)明顯變化(P＞0.05)，但安五脂素高劑量組肺纖維化評(píng)分有所降低(P＜0.001)，且安五脂素高劑量組明顯低于安五脂素低劑量組(P＜0.001，圖1B)。

與對(duì)照組比較，BLM模型組小鼠體重明顯下降(P＜0.01)；與BLM模型組比較，安五脂素低、高劑量組小鼠體重均有所上升，安五脂素高劑量組小鼠體重明顯上升(P＜0.05，圖1C)。與對(duì)照組比較，BLM模型組小鼠肺組織HYP含量明顯增加(P＜0.001)；與BLM模型組比較，安五脂素低劑量組小鼠肺組織HYP含量無(wú)明顯變化(P＞0.05)，但安五脂素高劑量組小鼠肺組織HYP含量明顯降低(P＜0.001)，且安五脂素高劑量組低于安五脂素低劑量組(P＜0.001，圖1D)。

圖1 安五脂素對(duì)BLM誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化的影響(±s，n=3)Fig.1 Effects of anwulignan on BLM-induced pulmonary fibrosis in mice (±s, n=3)

2.2 安五脂素對(duì)BLM誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化氧化應(yīng)激的影響 與對(duì)照組比較，BLM模型組小鼠血清SOD、CAT、GSH-Px、GSH活性明顯下降(P＜0.05或P＜0.001)，MDA含量明顯增高(P＜0.001)。與BLM模型組比較，安五脂素低劑量組小鼠血清SOD、CAT、GSH-Px、GSH及MDA含量無(wú)明顯變化(P＞0.05)，但安五脂素高劑量組小鼠血清SOD、CAT、GSH-Px、GSH活性明顯升高(P＜0.01)，MDA含量明顯降低(P＜0.001)，且安五脂素高劑量組小鼠血清SOD、CAT、GSH-Px活性高于安五脂素低劑量組，MDA含量低于安五脂素低劑量組(P＜0.05、P＜0.01或P＜0.001，表2)。

表2 安五脂素對(duì)BLM誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化氧化應(yīng)激的影響(±s，n=3)Tab.2 Effects of anwulignan on oxidative stress in mice with BLM-induced pulmonary fibrosis (±s, n=3)

表2 安五脂素對(duì)BLM誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化氧化應(yīng)激的影響(±s，n=3)Tab.2 Effects of anwulignan on oxidative stress in mice with BLM-induced pulmonary fibrosis (±s, n=3)

BLM. 博來(lái)霉素；SOD. 超氧化物歧化酶；CAT. 過(guò)氧化氫酶；GSH-Px. 谷胱甘肽過(guò)氧化物酶；GSH. 谷胱甘肽；MDA. 丙二醛；與對(duì)照組比較，(1)P＜0.05，(2)P＜0.001；與BLM模型組比較，(3)P＜0.01，(4)P＜0.001；與安五脂素低劑量組比較，(5)P＜0.05，(6)P＜0.01，(7)P＜0.001

組別 SOD (U/ml) CAT (U/ml) GSH-Px (U/ml) GSH (U/ml) MDA (μmol/ml)對(duì)照組 58.48±3.48 48.31±0.69 703.21±21.75 45.82±0.21 9.34±2.24 BLM模型組 37.44±3.49(1) 29.57±4.44(2) 585.28±13.41(1) 15.86±5.08(2) 22.13±1.58(2)安五脂素低劑量組 47.16±2.77 35.62±2.34 656.51±13.56 25.32±4.89 19.91±1.36安五脂素高劑量組 65.29±7.89(3)(6) 45.44±0.95(3)(5) 770.36±60.42(3)(5) 35.21±3.47(3) 10.34±0.77(4)(7)N-乙酰半胱氨酸組 78.22±9.87(4) 51.45±4.72(4) 826.38±47.94(4) 48.15±0.71(4) 8.71±2.64(4)

2.3 安五脂素對(duì)BLM誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠鐵死亡相關(guān)基因表達(dá)的影響 qRT-PCR和Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，BLM模型組小鼠肺組織中GPX4、SLC7A11、TFmRNA和蛋白表達(dá)水平降低(P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001)，TFR1mRNA和蛋白表達(dá)水平升高(P＜0.001)。與BLM模型組比較，安五脂素低劑量組小鼠肺組織中GPX4、SLC7A11、TFmRNA表達(dá)水平升高(P＜0.05)，TFR1mRNA表達(dá)水平明顯降低(P＜0.01)；安五脂素高劑量組小鼠肺組織中GPX4、SLC7A11、TFmRNA和蛋白表達(dá)水平升高(P＜0.01或P＜0.001)，TFR1mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低(P＜0.001)。與安五脂素低劑量組比較，安五脂素高劑量組小鼠肺組織中SLC7A11蛋白表達(dá)水平明顯升高(P＜0.001)，GPX4、TFmRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05或P＜0.001)，TFR1mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低(P＜0.01或P＜0.001)(圖2A、B)。

圖2 安五脂素對(duì)BLM誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠鐵死亡相關(guān)基因表達(dá)的影響(±s，n=3)Fig.2 Effects of anwulignan on ferroptosis in mice with BLM-induced pulmonary fibrosis (±s, n=3)

2.4 安五脂素對(duì)HFL-1細(xì)胞增殖及TGF-β1誘導(dǎo)的HFL-1細(xì)胞形態(tài)的影響 CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，安五脂素濃度＜20 μmol/L時(shí)對(duì)HFL-1細(xì)胞增殖沒(méi)有明顯影響(P＞0.05，圖3A)，因此選用5、10 μmol/L濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

倒置相差顯微鏡觀察顯示，對(duì)照組HFL-1細(xì)胞呈梭形且邊界清晰，排列規(guī)則；TGF-β1模型組HFL-1細(xì)胞呈扁平狀，邊界不清晰，細(xì)胞核比例增大，而當(dāng)給予5、10 μmol/L濃度安五脂素后，TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)改變被逆轉(zhuǎn)，恢復(fù)了梭形形態(tài)，且安五脂素高劑量組較低劑量組形態(tài)改變明顯(圖3B)。

Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，TGF-β1模型組α-SMA表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.001)，安五脂素低、高劑量組α-SMA表達(dá)均下調(diào)(P＜0.05，P＜0.01)，且安五脂素高劑量組低于安五脂素低劑量組(P＜0.05，圖3C)。

圖3 安五脂素對(duì)HFL-1細(xì)胞增殖及形態(tài)的影響(±s，n=3)Fig.3 Effects of anwulignan on proliferation and morphology of HFL-1 cells (±s, n=3)

2.5 安五脂素對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HFL-1細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 與對(duì)照組比較，TGF-β1模型組HFL-1細(xì)胞的SOD、CAT、GSH-Px、GSH活性明顯下降(P＜0.001)，MDA含量明顯增高(P＜0.001)；安五脂素給藥后，HFL-1細(xì)胞的SOD、CAT、GSH-Px、GSH活性均明顯升高(P＜0.01或P＜0.001)，MDA含量明顯降低(P＜0.01或P＜0.001)，且安五脂素高劑量組HFL-1細(xì)胞CAT活性高于安五脂素低劑量組(P＜0.001)，MDA含量低于安五脂素低劑量組(P＜0.001，表3)。

表3 安五脂素對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HFL-1細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響(±s，n=3)Tab.3 Effects of anwulignan on oxidative stress in TGF-β1-induced HFL-1 cells (±s, n=3)

表3 安五脂素對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HFL-1細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響(±s，n=3)Tab.3 Effects of anwulignan on oxidative stress in TGF-β1-induced HFL-1 cells (±s, n=3)

TGF-β1. 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1；SOD. 超氧化物歧化酶；CAT. 過(guò)氧化氫酶；GSH-Px. 谷胱甘肽過(guò)氧化物酶；GSH. 谷胱甘肽；MDA. 丙二醛；與對(duì)照組比較，(1)P＜0.001；與TGF-β1模型組比較，(2)P＜0.01，(3)P＜0.001；與安五脂素低劑量組比較，(4)P＜0.001

組別 SOD (U/mg prot) CAT (U/mg prot) GSH-Px (U/mg prot) GSH (μmol/mg prot) MDA (μmol/mg prot)對(duì)照組 106.04±8.36 22.11±0.86 111.81±6.81 180.98±11.47 2.74±0.19 TGF-β1模型組 54.97±13.21(1) 7.17±0.35(1) 40.06±6.09(1) 40.26±5.01(1) 7.51±0.32(1)安五脂素低劑量組 90.41±2.56(2) 15.49±0.18(3) 69.86±8.74(2) 231.72±15.91(3) 6.17±0.41(2)安五脂素高劑量組 105.52±6.37(3) 25.86±0.67(3)(4) 80.89±2.37(3) 249.11±17.34(3) 2.59±0.15(3)(4)

與對(duì)照組比較，TGF-β1模型組HFL-1細(xì)胞熒光明顯增強(qiáng)(P＜0.001)，提示ROS水平明顯升高。與TGF-β1模型組比較，安五脂素低劑量組ROS水平無(wú)明顯變化(P＞0.05)，但安五脂素高劑量組ROS水平明顯降低(P＜0.01)，且安五脂素高劑量組低于安五脂素低劑量組(P＜0.01，圖4)。

圖4 安五脂素對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HFL-1細(xì)胞ROS水平的影響(±s，n=3)Fig.4 Effects of anwulignan on the contents of ROS in TGF-β1-induced HFL-1 cells (±s, n=3)

2.6 安五脂素對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HFL-1細(xì)胞鐵死亡相關(guān)基因表達(dá)的影響 qRT-PCR和Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，TGF-β1模型組HFL-1細(xì)胞GPX4、SLC7A11、TFmRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低(P＜0.01或P＜0.001)，TFR1mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高(P＜0.01)。與TGF-β1模型組比較，安五脂素低劑量組HFL-1細(xì)胞GPX4mRNA表達(dá)水平明顯升高(P＜0.001)，SLC7A11、TFmRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001)，TFR1mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)；安五脂素高劑量組HFL-1細(xì)胞GPX4、SLC7A11、TFmRNA和蛋白表達(dá)水平升高(P＜0.01或P＜0.001)，TFR1mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低(P＜0.01)。與安五脂素低劑量組比較，安五脂素高劑量組HFL-1細(xì)胞SLC7A11mRNA表達(dá)水平升高(P＜0.05)，GPX4、TFmRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05，P＜0.01)，TFR1mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05)(圖5)。

圖5 安五脂素對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HFL-1細(xì)胞鐵死亡相關(guān)基因表達(dá)的影響(±s，n=3)Fig.5 Effects of anwulignan on expression of ferroptosis related genes in TGF-β1-induced HFL-1 cells (±s, n=3)

3 討 論

近年來(lái)，肺纖維化的發(fā)病率和病死率呈不斷上升趨勢(shì)，新冠肺炎重癥患者炎癥后肺纖維化情況尤為顯著。肺纖維化很難逆轉(zhuǎn)，因此臨床開發(fā)有效的治療藥物刻不容緩。安五脂素是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的具有抗氧化功效的一種中藥單體，屬南五味子木脂素成分。有研究發(fā)現(xiàn)，在D-半乳糖誘導(dǎo)的小鼠衰老模型中，安五脂素發(fā)揮了顯著的抗氧化作用[13]。本研究采用氣管灌注BLM建立小鼠肺纖維化動(dòng)物模型，TGF-β1誘導(dǎo)HFL-1細(xì)胞建立肺纖維化細(xì)胞模型，分別通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)探討安五脂素對(duì)肺纖維化進(jìn)程中氧化應(yīng)激、鐵死亡及相關(guān)信號(hào)通路的干預(yù)作用，為臨床應(yīng)用中藥治療肺纖維化提供了一定的理論依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)給予肺纖維化小鼠不同劑量的安五脂素后，小鼠體重明顯上升，肺組織HYP含量明顯降低，HE染色和Masson染色結(jié)果提示小鼠肺纖維化病理改變發(fā)生逆轉(zhuǎn)，表明安五脂素能夠改善小鼠的肺纖維化表型。細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外氧化劑與抗氧化劑之間的平衡是正常肺穩(wěn)態(tài)的先決條件。當(dāng)肺部遭遇急性損傷發(fā)生炎癥反應(yīng)后，產(chǎn)生多種重要的內(nèi)源性ROS，包括過(guò)氧化物自由基、過(guò)氧化氫(H2O2)和羥基自由基等[14]。而當(dāng)機(jī)體清除ROS的功能低下時(shí)，體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)多的ROS，導(dǎo)致氧化還原失衡，引發(fā)氧化應(yīng)激。有研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激損傷后修復(fù)失敗是肺纖維化非常重要的誘因之一[2]。本研究發(fā)現(xiàn)，安五脂素可明顯提高肺纖維化動(dòng)物模型和細(xì)胞模型的抗氧化物酶SOD、CAT、GSH-Px活性及抗氧化劑GSH水平，降低脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的含量，從而逆轉(zhuǎn)氧化應(yīng)激對(duì)肺組織造成的損傷，減輕肺纖維化(表3，圖4、6)。

鐵死亡是近年來(lái)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種新型鐵依賴性細(xì)胞死亡形式，其特征是細(xì)胞內(nèi)鐵積累和脂質(zhì)過(guò)氧化增加。在生理?xiàng)l件下，細(xì)胞內(nèi)鐵通過(guò)吸收和代謝始終處于動(dòng)態(tài)平衡。膳食鐵主要以Fe3+的形式被腸上皮細(xì)胞吸收，與TF結(jié)合后通過(guò)膜上的TFR1進(jìn)入細(xì)胞，被還原為Fe2+釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中的不穩(wěn)定鐵池，該過(guò)程中相關(guān)蛋白的異常表達(dá)會(huì)引起細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量的Fe2+，并催化ROS的產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的持續(xù)積累并引起鐵死亡[15-17]。SLC7A11是細(xì)胞內(nèi)胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的重要組成部分，可通過(guò)促進(jìn)胱氨酸的吸收及GSH的合成保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激和鐵死亡[18]。SLC7A11減少會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸缺失，阻礙GSH的合成。GSH是GPX4發(fā)揮功能的輔助因子，其合成受阻會(huì)使GPX4的抗氧化活性減弱[19]。有研究發(fā)現(xiàn)，ROS、脂質(zhì)過(guò)氧化和GPX4在Erastin誘導(dǎo)的肺纖維化和鐵死亡中起重要作用[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，安五脂素可通過(guò)上調(diào)GPX4、SLC7A11和TF的表達(dá)，下調(diào)TFR1的表達(dá)，減少鐵的過(guò)度沉積來(lái)抑制鐵死亡，從而改善肺纖維化(圖5)。

圖6 安五脂素體內(nèi)體外抑制肺纖維化的作用Fig.6 Inhibition of pulmonary fibrosis with anwulignan in vivo and in vitro

綜上所述，本研究結(jié)果表明，安五脂素在體內(nèi)、體外均可發(fā)揮抗氧化作用，同時(shí)抑制鐵死亡的發(fā)生，從而改善肺纖維化。該結(jié)果為臨床開發(fā)肺纖維化治療藥物提供了新的靶點(diǎn)，但安五脂素抑制鐵死亡的更深層次的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。