抑制組織蛋白酶B對(duì)膿毒癥急性肺損傷小鼠肺組織細(xì)胞焦亡的影響

楊柳，劉強(qiáng)勝，張彬，何倩雯，李禎，劉安鵬，鄭鋒，詹佳*

1武漢大學(xué)中南醫(yī)院麻醉科，武漢 430071；2湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院/襄陽(yáng)市中心醫(yī)院麻醉科，湖北襄陽(yáng) 441000

膿毒癥是由于入侵的病原體引起的免疫應(yīng)答不能恢復(fù)到穩(wěn)態(tài)，最終形成以持續(xù)的過(guò)度炎癥及免疫抑制為特征的病理綜合征[1]。近年來(lái)，雖然人們對(duì)膿毒癥復(fù)雜病理機(jī)制的認(rèn)識(shí)有所提升，并實(shí)施了早期目標(biāo)導(dǎo)向治療、使用抗生素及生命體征支持等治療方案，但并未降低其高重癥率及高病死率的現(xiàn)狀[2]。隨著對(duì)膿毒癥誘導(dǎo)的免疫抑制在器官功能損傷方面研究的深入，靶向細(xì)胞焦亡通路的臨床試驗(yàn)將為膿毒癥患者的治療提供更多的選擇[3-4]。焦亡是由半胱天冬酶(caspase)-1介導(dǎo)的一類伴有炎性介質(zhì)釋放的程序性細(xì)胞死亡[5]。肺臟是膿毒癥發(fā)生時(shí)極易損傷的器官之一[6]，膿毒癥早期即可發(fā)生急性肺損傷或急性呼吸窘迫綜合征，與膿毒癥的發(fā)病率及病死率密切相關(guān)[7]。在膿毒癥發(fā)生過(guò)程中，激活的Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)一方面通過(guò)上調(diào)含pyrin結(jié)構(gòu)域核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域樣受體家族3(nucleotide-binding oligomerization domain,leucine- rich repeat and pyrin domain-containing 3，NLRP3)炎性小體促進(jìn)細(xì)胞焦亡，另一方面通過(guò)激活MyD88及核因子(NF)-κB信號(hào)通路，上調(diào)IL-1RI的表達(dá)，增加細(xì)胞對(duì)IL-Iβ的敏感性，從而促進(jìn)細(xì)胞焦亡，兩者相互作用加重肺損傷[8]。所以，抑制肺組織細(xì)胞焦亡在膿毒癥急性肺損傷的治療中尤為重要。組織蛋白酶B(cathepsin B，CTSB)是一種在多種細(xì)胞中廣泛表達(dá)的半胱氨酸蛋白水解酶[9]，其表達(dá)異常增加或過(guò)度激活與炎癥、感染、腫瘤及神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)[10]。CTSB抑制劑的臨床應(yīng)用受到廣泛關(guān)注，但其是否能通過(guò)抑制細(xì)胞焦亡從而改善膿毒癥，目前尚未明確。本研究通過(guò)建立膿毒癥小鼠急性肺損傷模型，探討能否通過(guò)靶向抑制CTSB的表達(dá)抑制肺組織焦亡，從而改善膿毒癥引起的急性肺損傷。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 30只SPF級(jí)健康雄性C57BL/6小鼠，8～10周齡，體重(23±1) g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于武漢大學(xué)中南醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：假手術(shù)組(n=6)、膿毒癥組(n=15)及膿毒癥+組織蛋白酶B抑制劑CA-074組(膿毒癥+CA-074組，n=9)。膿毒癥組及膿毒癥+CA-074組均使用經(jīng)典的盲腸結(jié)扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)法[11]構(gòu)建小鼠膿毒癥模型：將小鼠用戊巴比妥鈉60 mg/kg腹腔注射麻醉后，固定于手術(shù)臺(tái)上，剔除手術(shù)部位體毛，消毒手術(shù)野，于劍突下1 cm沿腹中線作一條長(zhǎng)1～2 cm的切口，打開(kāi)腹腔，探取盲腸并分離，注意避免損傷血管及腹腔臟器。用4-0絲線小心結(jié)扎盲腸遠(yuǎn)端1/3處，于盲腸盲端至結(jié)扎部位的中點(diǎn)處，用20G無(wú)菌針頭刺穿盲腸，擠出少許腸內(nèi)容物后將盲腸放回腹腔，并逐層關(guān)腹。術(shù)畢皮下注射預(yù)熱的37 ℃無(wú)菌生理鹽水(5 ml/100 g)復(fù)蘇，并在暖燈下觀察至少2 h。假手術(shù)組除不行盲腸結(jié)扎及穿孔外，其他操作同膿毒癥組。術(shù)后15 min，膿毒癥+CA-074組小鼠腹腔注射10 mg/kg CA-074。實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合國(guó)家及單位有關(guān)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定。

1.2 小鼠肺泡灌洗液中白細(xì)胞計(jì)數(shù)及白細(xì)胞介素(IL)-18、IL-1β水平檢測(cè) CLP術(shù)后24 h，將小鼠用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后固定于試驗(yàn)臺(tái)上，頸部消毒，暴露右主支氣管，注意避免傷及血管，用20G靜脈留置針穿刺氣管并結(jié)扎固定。1 ml磷酸緩沖鹽溶液(PBS)緩慢注入肺部，輕輕擠壓胸廓約3 s后回抽，將回抽液置于5 ml的Eppendorf 3810型微量離心管中，重復(fù)上述操作3次。將回收液于4 ℃下1500×g離心10 min，收集上清，-20 ℃保存，采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)細(xì)胞因子IL-18、IL-1β水平。采用改良牛鮑計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)下層液中白細(xì)胞的數(shù)量。

1.3 小鼠肺組織病理學(xué)變化及肺損傷評(píng)分 取右側(cè)中葉肺組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，將切片放入蘇木精水溶液中染色數(shù)分鐘，酸水及氨水中分色，流水沖洗脫水后，酒精伊紅染色液染色2～3 min。染色完成后，脫水封片，光學(xué)顯微鏡觀察。根據(jù)肺組織病理學(xué)變化(組織壞死、肺泡水腫、透明膜形成、出血及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等)進(jìn)行肺損傷評(píng)分，視病變程度依次計(jì)為0～4分。無(wú)病變計(jì)0分，病變范圍≤10%計(jì)0.5分，病變范圍10%～25%計(jì)1分，病變范圍25%～50%計(jì)2分，病變范圍50%～75%計(jì)3分，病變范圍＞75%計(jì)4分，總分0～16分。

1.4 肺組織濕/干重比 取左側(cè)肺組織，用吸水紙吸取表面水分及血液，稱重為濕重(W)。置于65 ℃恒溫烘箱中，每24 h稱重1次，直至前后兩次重量之差小于1%，記錄為干重(D)。計(jì)算濕/干重比(W/D)。

1.5 RT-PCR法測(cè)定肺組織相關(guān)基因mR NA表達(dá)水平 取右上葉肺組織，采用Tr i z o l(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)法提取總R N A。按照EntiLinkTM1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(武漢ELK Biotechnology公司)使用說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以β-actin為內(nèi)參照。引物序列如下：β-actin上游5'-CTGAGAGGGAAATCGTGCGT-3'，下游5'-CCACAGGATTCCATACCCAAGA-3'；小凹蛋白-1(caveolin-1)上游5'-AGGTGACTGAGAAGCAAGT GTATG-3'，下游5'-CAAGCGGTAAAACCAATATTT TG-3'；單核細(xì)胞趨化蛋白誘導(dǎo)蛋白1(MCPIP1)上游5'-CCCAAGCCTTCCACTCTAGAAC-3'，下游5'-TTCCTCCAAGATGGCACAAAC-3'；Caspase-1上游5'-GATGGCATTAAGAAGGCCCA-3'，下游5'-CCC TATCAGCAGTGGGCATC-3'；成孔效應(yīng)蛋白D(gasdermin D，GSDMD)上游5'-CGTGGCAGGAGCA GAGTTCT-3'，下游5'-ATAGAGCGCACTTGTGGGG A-3'；CTSB上游5'-GCTGTCGGATGACCTGATTAA C-3'，下游5'-ATCTATGTCCTCACCGAACGC-3'。按照EnTurboTMSYBR Green PCR SuperMix試劑盒(武漢ELK Biotechnology公司)說(shuō)明書(shū)操作，采用10 μl體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：2×Master Mix 5.0 μl，引物工作液(2.5 μmol/L)1.0 μl，模板1.0 μl，ddH2O 2.0 μl，PCR儀校正染料1.0 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循環(huán)40次。使用StepOneTMReal-Time PCR儀(美國(guó)Life Technologies公司)進(jìn)行擴(kuò)增并分析處理數(shù)據(jù)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 Western blotting測(cè)定肺組織中CTSB、caspase-1及G S D M D 蛋白表達(dá)水平 取右下葉肺組織50～100 mg，置于1～2 ml勻漿器中，用干凈的剪刀將組織塊剪碎，按照每20 mg組織150～250 μl裂解液的比例加入高效RIPA組織/細(xì)胞裂解液(美國(guó)ASPEN公司)，冰上勻漿，于4 ℃下13 000×g離心15 min，收集上清并使用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。取40 μg總蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，分離蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，使用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，以阻斷非特異性結(jié)合，再加入兔抗鼠β-actin一抗(1:10 000)、兔抗鼠CTSB一抗(1:1000)、兔抗鼠caspase-1一抗(1:1000)、兔抗鼠GSDMD一抗(1:1000)，以上抗體均購(gòu)自武漢三鷹生物科技有限公司，4 ℃脫色搖床孵育過(guò)夜。用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次，每次10 min。使用上述方法稀釋HRP山羊抗兔二抗(1:10 000，美國(guó)ASPEN公司)，室溫下孵育1～2 h，洗膜后ECL法顯影。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0及GraphPad Prism 8進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)及Tamhane's T2檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例(%)表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CLP術(shù)后24 h小鼠基本情況及存活率 與術(shù)前相比，假手術(shù)組小鼠術(shù)后24 h基本情況無(wú)明顯變化，存活率100.0%；膿毒癥組小鼠出現(xiàn)背部豎毛、行動(dòng)遲緩、厭食、精神萎靡、寒顫抽搐等癥狀，存活率為40.0%(6/15)；膿毒癥+CA-074組小鼠的上述癥狀有不同程度的緩解，存活率為66.7%(6/9)。與假手術(shù)組比較，膿毒癥組小鼠24 h存活率明顯降低(P＜0.05)；膿毒癥+CA-074組與膿毒癥組小鼠存活率無(wú)明顯差異(P＞0.05)。

2.2 各組小鼠肺組織病理變化 假手術(shù)組肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁不厚，肺間質(zhì)內(nèi)幾乎無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；與假手術(shù)組比較，膿毒癥組肺泡結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，肺泡間隔增厚及水腫，肺間質(zhì)中見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及點(diǎn)狀或片狀出血灶；與膿毒癥組比較，膿毒癥+CA-074組肺泡結(jié)構(gòu)破壞減輕，肺間質(zhì)水腫緩解，間質(zhì)內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少(圖1)。

圖1 各組小鼠肺組織病理學(xué)變化(HE染色，×400)Fig.1 Pathological changes of lung tissues of mice in each group (HE ×400)

2.3 各組小鼠肺組織相關(guān)指標(biāo)比較 與假手術(shù)組比較，膿毒癥組損傷性指標(biāo)caveolin-1mRNA水平明顯升高，修復(fù)性指標(biāo)MCPIP1mRNA水平明顯降低，肺損傷評(píng)分增加，肺組織濕/干重比增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與膿毒癥組相比較，膿毒癥+CA-074組caveolin-1mRNA水平降低，MCPIP1mRNA水平升高，肺損傷評(píng)分降低，肺組織濕/干重比降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表1)。

表1 各組小鼠肺組織中caveolin-1及MCPIP1 mRNA水平、肺損傷評(píng)分及肺組織濕/干重比值比較 (±s，n=6)Tab.1 Comparison of caveolin-1 and MCPIP1 mRNA level, lung injury score and wet/dry weight ratio of lung tissues of mice in each group (±s, n=6)

表1 各組小鼠肺組織中caveolin-1及MCPIP1 mRNA水平、肺損傷評(píng)分及肺組織濕/干重比值比較 (±s，n=6)Tab.1 Comparison of caveolin-1 and MCPIP1 mRNA level, lung injury score and wet/dry weight ratio of lung tissues of mice in each group (±s, n=6)

Caveolin-1. 小凹蛋白-1；MCPIP1. 單核細(xì)胞趨化蛋白誘導(dǎo)蛋白1；與假手術(shù)組比較，(1)P＜0.05；與膿毒癥組比較，(2)P＜0.05

組別 Caveolin-1 mRNA MCPIP1 mRNA 肺損傷評(píng)分(分) 肺組織濕/干重比假手術(shù)組 1.00±0.09 0.98±0.13 0.93±0.27 5.37±0.52膿毒癥組 3.01±0.34(1) 0.24±0.02(1) 11.35±1.73(1) 14.32±2.16(1)膿毒癥+CA-074組 1.77±0.15(1)(2) 0.55±0.07(1)(2) 8.45±2.36(1)(2) 11.12±2.01(1)(2)F 126.889 103.084 60.091 41.235 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.4 各組小鼠炎性指標(biāo)比較 與假手術(shù)組比較，膿毒癥組肺泡灌洗液中白細(xì)胞計(jì)數(shù)增加，焦亡相關(guān)炎性因子IL-18、IL-1β水平上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與膿毒癥組比較，膿毒癥+CA-074組白細(xì)胞計(jì)數(shù)減少，IL-18、IL-1β水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表2)。

表2 各組小鼠肺泡灌洗液中白細(xì)胞計(jì)數(shù)及IL-18、IL-1β水平比較 (±s，n=6)Tab.2 Comparison of leukocytes count, IL-18 and IL-1β levels in BALF of mice in each group (±s, n=6)

表2 各組小鼠肺泡灌洗液中白細(xì)胞計(jì)數(shù)及IL-18、IL-1β水平比較 (±s，n=6)Tab.2 Comparison of leukocytes count, IL-18 and IL-1β levels in BALF of mice in each group (±s, n=6)

IL-18. 白細(xì)胞介素-18；IL-1β. 白細(xì)胞介素-1β；BALF. 支氣管肺泡灌洗液；與假手術(shù)組比較，(1)P＜0.05；與膿毒癥組比較，(2)P＜0.05

組別 白細(xì)胞計(jì)數(shù)(×108/L) IL-18(pg/ml) IL-1β(pg/ml)假手術(shù)組 1.37±0.15 33.51±2.71 69.88±5.63膿毒癥組 6.20±1.10(1) 217.79±15.61(1) 311.34±17.43(1)膿毒癥+CA-074組 4.60±0.50(1)(2) 197.68±11.95(1)(2) 227.00±11.38(1)(2)F 73.771 466.879 581.040 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.5 各組小鼠肺組織CTSB、caspase-1及GSDMDmRNA表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組比較，膿毒癥組中CTSB、caspase-1及GSDMDmRNA表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與膿毒癥組比較，膿毒癥+CA-074組中CTSBmRNA表達(dá)無(wú)明顯變化(P=0.973)，caspase-1及GSDMDmRNA表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表3)。

表3 各組小鼠肺組織中CTSB、caspase-1及GSDMD mRNA表達(dá)水平比較(±s，n=6)Tab.3 Comparison of the expression levels of CTSB, caspase-1 and GSDMD mRNA in lung tissues of mice in each group (±s,n=6)

表3 各組小鼠肺組織中CTSB、caspase-1及GSDMD mRNA表達(dá)水平比較(±s，n=6)Tab.3 Comparison of the expression levels of CTSB, caspase-1 and GSDMD mRNA in lung tissues of mice in each group (±s,n=6)

組別 CTSB mRNA Caspase-1 mRNA GSDMD mRNA假手術(shù)組 0.99±0.08 1.00±0.06 1.00±0.18膿毒癥組 5.31±0.26(1) 6.33±0.29(1) 11.17±0.41(1)膿毒癥+CA-074組 5.32±0.32(1) 4.83±0.23(1)(2) 9.87±0.39(1)(2)F 618.739 940.458 1536.724 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.6 各組小鼠肺組織CTSB、caspase-1及GSDMD蛋白表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組比較，膿毒癥組CTSB、caspase-1及GSDMD蛋白表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與膿毒癥組比較，膿毒癥+CA-074組中CTSB、caspase-1及GSDMD蛋白表

CTSB. 組織蛋白酶B；Caspase-1. 半胱天冬酶-1；GSDMD.成孔效應(yīng)蛋白D；與假手術(shù)組比較，(1)P＜0.05；與膿毒癥組比較，(2)P＜0.05達(dá)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖2)。

圖2 各組小鼠肺組織中CTSB、caspase-1及GSDMD蛋白表達(dá)水平比較Fig.2 Comparison of the expression levels of CTSB, caspase-1 and GSDMD protein in lung tissues of mice in each group

3 討 論

Caveolin-1是細(xì)胞質(zhì)膜微囊(caveolae)的重要組成部分，在保持微囊完整性、囊泡的運(yùn)輸及細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中起一定作用。有研究表明，caveolin-1及微囊在免疫細(xì)胞中的普遍分布提示它們可能與膿毒癥有關(guān)[12]，并且caveolin-1在炎癥反應(yīng)強(qiáng)烈的區(qū)域表達(dá)增多[13]，是反映炎癥損傷的指標(biāo)。MCPIP1作為一種炎癥信號(hào)傳導(dǎo)抑制因子，在維持內(nèi)皮細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)及功能中起重要作用[14]，是反映組織修復(fù)的指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，膿毒癥組小鼠肺組織濕/干重比增加，損傷性指標(biāo)caveolin-1mRNA表達(dá)水平增高，修復(fù)性指標(biāo)MCPIP1mRNA表達(dá)水平下降，肺損傷評(píng)分增加，且出現(xiàn)了豎毛、腹瀉、精神萎靡、活動(dòng)能力減退等膿毒癥相關(guān)癥狀，存活率明顯降低，表明膿毒癥肺損傷模型制備成功。

細(xì)胞焦亡是一類由caspase-1介導(dǎo)炎癥介質(zhì)釋放引起的程序性細(xì)胞死亡，在感染、炎癥及免疫性疾病中扮演重要的角色[15]。CTSB是一種在多種細(xì)胞中廣泛表達(dá)的半胱氨酸蛋白水解酶，主要存在于溶酶體中[16]，它能降解通過(guò)內(nèi)吞或吞噬作用進(jìn)入細(xì)胞的蛋白，還能降解細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器及通過(guò)自噬處理的蛋白[17]，參與細(xì)胞凋亡、抗原提呈、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞自噬及細(xì)胞外基質(zhì)降解等多種病理生理過(guò)程[18]。在膿毒癥小鼠模型中，中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)導(dǎo)致溶酶體破裂，觸發(fā)CTSB的釋放，誘導(dǎo)NLRP3炎性小體的形成及caspase-1的激活[19]，活化的caspase-1一方面刺激IL-18及IL-1β轉(zhuǎn)化為成熟的炎性因子[19-20]，另一方面切割GSDMD形成可以在細(xì)胞上成孔的GSDMD-N片段，誘導(dǎo)細(xì)胞穿孔、破裂，釋放大量炎性介質(zhì)[20]。caspase-1及GSDMD作為細(xì)胞焦亡通路的重要介質(zhì)，是評(píng)價(jià)細(xì)胞焦亡的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，膿毒癥組CTSB、焦亡相關(guān)炎性因子IL-18和IL-1β，以及焦亡相關(guān)蛋白caspase-1、GSDMD的表達(dá)水平明顯增加，表明CTSB可能在膿毒癥急性肺損傷的肺組織焦亡中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

CTSB是存在于各種生物體內(nèi)的半胱氨酸蛋白酶，在溶酶體內(nèi)通過(guò)激活其他蛋白水解酶系統(tǒng)、活化某些酶原或激素前體肽的方式參與蛋白質(zhì)的加工及降解[21]。異常的CTSB表達(dá)增加或激活增強(qiáng)在炎癥、感染、腫瘤及神經(jīng)退行性疾病等病理狀態(tài)下起關(guān)鍵作用[10]。因此，CTSB特異性抑制劑的應(yīng)用為這些疾病的治療提供了新的靶點(diǎn)。目前，通過(guò)結(jié)構(gòu)導(dǎo)向設(shè)計(jì)的CTSB人源化抗體抑制劑(商品名：赫賽汀)已用于乳腺癌的臨床治療。而一種新型的抗體-前肽融合技術(shù)，能夠使CTSB抑制劑在納米水平呈現(xiàn)高特異性，也處于研發(fā)階段[22]。由此可見(jiàn)，CTSB抑制劑具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。有研究發(fā)現(xiàn)，CTSB的表達(dá)增加促進(jìn)了NLRP3炎性小體的激活，而使用CTSB抑制劑后，可減輕NLRP3炎性小體的激活[23]。因此，本研究參照文獻(xiàn)的方法，使用10 mg/kg CTSB抑制劑CA-074腹腔注射[24]，探討CTSB在膿毒癥肺損傷中的作用。結(jié)果顯示，與膿毒癥組相比，膿毒癥+CA-074組caveolin-1表達(dá)水平降低，MCPIP1表達(dá)水平升高，肺組織濕/干重比降低，肺損傷評(píng)分降低，表明CTSB抑制劑CA-074有改善肺損傷、促進(jìn)肺組織修復(fù)的作用。使用CTSB抑制劑CA-074后，焦亡相關(guān)炎性因子釋放減少，焦亡相關(guān)蛋白caspase-1及GSDMD表達(dá)降低，提示抑制CTSB可阻斷肺組織焦亡途徑，減輕肺損傷。使用CTSB抑制劑CA-074后，與膿毒癥組相比，CTSB蛋白表達(dá)降低，而CTSBmRNA無(wú)明顯改變，提示CA-074不影響CTSB的轉(zhuǎn)錄水平，可能參與翻譯水平或者降解途徑的調(diào)節(jié)，具體機(jī)制有待后續(xù)進(jìn)一步研究。CA-074作為CTSB的特異性抑制劑，其減輕肺損傷的機(jī)制可能與干擾NLRP3激活，從而抑制焦亡有關(guān)。與膿毒癥組相比，膿毒癥+CA-074組小鼠存活率無(wú)明顯差異，可能與樣本量太少，或觀察時(shí)間過(guò)短等原因有關(guān)。但本研究尚存在以下不足：(1)僅進(jìn)行了單次給藥術(shù)后24 h的形態(tài)學(xué)分析及指標(biāo)檢測(cè)，后續(xù)將對(duì)長(zhǎng)期用藥實(shí)驗(yàn)后的生存情況及炎癥損傷進(jìn)行評(píng)估。(2)本研究發(fā)現(xiàn)抑制CTSB表達(dá)可以減輕肺組織焦亡，但其具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，在膿毒癥急性肺損傷中，CTSB表達(dá)增高可導(dǎo)致肺組織焦亡，抑制CTSB表達(dá)可阻斷肺組織焦亡途徑，從而改善膿毒癥急性肺損傷。