不同抗凝劑對(duì)富血小板血漿的濃縮及功能的影響

祖文軒,李 林,石 傲,葉子悅,燕博民,蔣邦紅,張 莉*

(1蚌埠醫(yī)學(xué)院解剖教研室,蚌埠 233030;2蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院整形外科;*通訊作者,E-mail:drzhangli65@163.com)

富血小板血漿(platelet-rich plasma,PRP)系全血經(jīng)離心、分離后濃縮而來的血液制品,自1998年提出以來,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床[1]。其內(nèi)血小板經(jīng)激活后可釋放多種生長因子,例如血小板衍生因子(PDGF)、血管生長因子(VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)等,在組織創(chuàng)傷局部建立有助于修復(fù)的微環(huán)境,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于皮膚、肌肉、骨骼等組織創(chuàng)傷的修復(fù)[2,3]。目前PRP的制備方法有多種,主要有手工離心分離法、PRP專用提取套盒、成分血單采制備等[4-6]。各種方法的制備過程中,對(duì)于全血的收集需要添加抗凝劑,目前廣泛應(yīng)用的抗凝劑為檸檬酸鈉。但筆者發(fā)現(xiàn)EDTA抗凝管收集并濃縮到的PRP中含有更多血小板數(shù)量,對(duì)于這一步驟尚缺乏全國統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。本文采用3.8%檸檬酸鈉抗凝管、EDTA抗凝管和肝素抗凝管分別提取收集PRP,檢測血小板數(shù)量、形態(tài)及激活前后細(xì)胞因子的含量等,旨在探索抗凝劑對(duì)PRP濃縮及功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

募集健康成年志愿者5名,年齡25～40歲,男3名,女2名。排除心臟病、糖尿病、高血壓及高血脂、血液相關(guān)疾病等,近期有感染、創(chuàng)傷等疾病。志愿者均簽署知情同意書。本研究經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),批準(zhǔn)號(hào)為2020KY045。

1.2 抗凝劑管

實(shí)驗(yàn)按采血抗凝劑的種類進(jìn)行分組,共分為3組。實(shí)驗(yàn)組(EDTA組):EDTA紫頭負(fù)壓采血抗凝管,規(guī)格7 ml;陽性對(duì)照組(9NC組):3.8%檸檬酸鈉藍(lán)頭負(fù)壓采血抗凝管,全血:檸檬酸為9 ∶1,規(guī)格10 ml;陰性對(duì)照組(肝素組):肝素綠頭負(fù)壓采血抗凝管,規(guī)格5 ml。

1.3 血樣采集

采取志愿者上肢靜脈血,每種抗凝管采20 ml全血,每位志愿者總采血量為60 ml。

1.4 PRP的制備

將不同采血管放置離心機(jī)行第一次離心(300g,15 min)。之后取上層血漿及中間血小板層行二次離心(600g,15 min),將中間的血小板層吸出并按1/10全血體積濃縮各組血小板,即每種采血管可最終獲得2 ml PRP。取1 ml作血液涂片染色,血常規(guī)檢測及細(xì)菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。余下1 ml用血漿5倍稀釋,留取部分原液,剩余量添加10%葡萄糖酸鈣注射液激活,激活前后進(jìn)行細(xì)胞因子濃度檢測。

1.5 細(xì)菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

將各組樣本送至蚌醫(yī)一附院檢驗(yàn)科微生物實(shí)驗(yàn)室,作一般細(xì)菌培養(yǎng)+藥敏實(shí)驗(yàn)。采用血平板接種法,于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 d,觀察有無菌落生長并分離鑒定。

1.6 PDGF和TGF-β的測定

各組樣本采用免疫酶聯(lián)吸附測定試劑盒檢測激活前后PDGF和TGF-β的濃度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism軟件分析數(shù)據(jù),對(duì)血常規(guī)及細(xì)胞因子濃度的數(shù)據(jù)結(jié)果行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,兩組間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間的比較采用單因素單方差分析。

2 結(jié)果

2.1 三組PRP中血常規(guī)檢測結(jié)果

第一次離心后,陰性對(duì)照(肝素)組抗凝管中上層血清較為清亮(見圖1A),剩余兩組較為渾濁。第二次離心后可以明顯觀察到EDTA組中間壓縮的血小板層最厚(見圖1B)。此外實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果提示,三組抗凝劑制備的PRP中血小板計(jì)數(shù)(PLT)量分別為(1 250.2±246.0)×109/L、(1 030.8±101.7)×109/L、(957.2±89.9)×109/L,其中EDTA組數(shù)量最多,陰性對(duì)照組數(shù)量最少。全血中的PLT數(shù)量為(221.0±18.4)×109/L,三組的血小板計(jì)數(shù)均達(dá)到全血中數(shù)量的4倍以上,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖2)。血小板平均體積(MPV)和大型血小板比例(P-LCR)在EDTA組和陰性對(duì)照(肝素)組中較全血有所升高,而陽性對(duì)照(9NC)組與全血沒明顯差異(見圖2)。血小板壓積(PCT)與PLT的檢測結(jié)果相一致,均為EDTA組最高,且組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖2)。三組中血小板平均分布寬度(PDW)與全血保持一致,差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖2)。

A.第一次離心后3種抗凝劑管內(nèi)血液分層情況;B.第二次離心后3種抗凝劑管內(nèi)濃縮血小板層的厚度;紫色圓點(diǎn)代表紫頭采血管,即EDTA管;藍(lán)色圓點(diǎn)代表藍(lán)頭采血管,即9 NC管;綠色圓點(diǎn)代表綠頭采血管,即肝素管圖1 三種抗凝劑管在兩步離心后得到的血液分層結(jié)果Figure 1 Blood stratification in the three anticoagulant tubes after two centrifugation steps

PLT:血小板計(jì)數(shù);MPV:血小板平均體積;PCT:血小板壓積;P-LCR:大型血小板比例;PDW:血小板平均分布寬度;與全血相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001圖2 三種抗凝劑管制備的PRP與全血血常規(guī)中血小板相關(guān)結(jié)果的對(duì)比Figure 2 Comparison of platelet-related items between PRP prepared in the three anticoagulant tubes and the whole blood routine

2.2 鏡下觀察三組PRP的形態(tài)特點(diǎn)

三組PRP鏡下形態(tài)均為不規(guī)則的細(xì)胞質(zhì)小塊,呈雪花狀,在血小板中有細(xì)小的紫藍(lán)色顆粒,呈聚集性分布;低倍鏡下見EDTA抗凝劑組血小板數(shù)量較其余兩組更密集,高倍鏡下均未發(fā)現(xiàn)異常形態(tài)的血小板;但陰性對(duì)照組中中性粒細(xì)胞邊緣毛躁(見圖3)。

2.3 三組PRP細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果

細(xì)菌培養(yǎng)3 d后,三組所得PRP種植的血平板表面清潔,未見任何菌落生長(見圖4)。提示本實(shí)驗(yàn)分離濃縮的PRP基本沒有細(xì)菌污染。

2.4 激活前后細(xì)胞因子釋放的濃度

鈣劑激活可以將PRP中的細(xì)胞因子表達(dá)量升高。對(duì)三組激活前后數(shù)據(jù)采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn),每組激活后的濃度較激活前都明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外,采用單因素方差分析得到,不同抗凝劑對(duì)激活前和激活后細(xì)胞因子的釋放均有影響,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中,激活前后EDTA組PRP所釋放的兩種細(xì)胞因子的濃度都是三組中最高,且三組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表1)。

黃色箭頭所指為血小板,黑色箭頭所指為邊緣毛躁的白細(xì)胞圖3 三種抗凝劑管制備的PRP血涂片染色鏡下結(jié)果Figure 3 Morphology of the PRP prepared in the three anticoagulant tubes by blood smear staining

圖4 三種抗凝劑管制備的PRP細(xì)菌培養(yǎng)3 d均未檢測出細(xì)菌Figure 4 No bacteria are detected in the PRP prepared in three anticoagulant tubes after bacterial culture for three days

表1 ELISA檢測激活前后PDGF和TGF-β的釋放濃度

3 討論

自體富血小板血漿(PRP)是血小板濃度高于全血的自體外周血經(jīng)離心、分離、濃縮處理后的液體部分。PRP療法用于各種適應(yīng)證已經(jīng)超過30年,在再生醫(yī)學(xué)治療中發(fā)揮了重要輔助作用。PRP的制備采用自體靜脈血,避免了免疫排斥反應(yīng),在組織修復(fù)過程中得以更好地改善局部微環(huán)境,促進(jìn)難治性創(chuàng)面的愈合[7]。然而不同的患者在注射PRP后預(yù)后不盡相同,可能是市面上不同的PRP套裝和PRP類系統(tǒng)造成血小板富集度的可變性增大[8]。目前PRP制備方面缺少標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一的方法,血小板濃縮的倍數(shù)也因人而異。

PRP試劑盒因其高昂的成本難以普及,手工離心法制備富血小板血漿有著便捷、易操作、低成本等優(yōu)點(diǎn),并且手工離心分離法制備和試劑盒提取在PLT和WBC數(shù)量上沒有顯著的差異[9],但有研究顯示不同的離心力和離心時(shí)間對(duì)PRP質(zhì)量影響較大[10,11],不同人體、不同部位的血液制備的PRP也存在差別[12,13],PRP中多種細(xì)胞因子直接影響其組織修復(fù)的能力,PLT濃度越高其相應(yīng)激活后釋放的細(xì)胞因子濃度就越高,血小板活化劑氯化鈣的濃度作用時(shí)間等可能對(duì)細(xì)胞因子釋放產(chǎn)生影響[14]。而這些因素都相同的前提下,是否還有一些操作環(huán)節(jié)可能對(duì)PRP的提取效果產(chǎn)生影響?筆者采用EDTA抗凝管收集全血,二期離心后發(fā)現(xiàn)這種抗凝劑管相較檸檬酸鈉抗凝劑管可以濃縮到更多的血小板。而目前臨床采用的主要是檸檬酸鈉制劑的抗凝劑,對(duì)于是否可以選用EDTA抗凝劑管濃縮PRP還沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)[15,16]。

EDTA-2K是國際血液標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(ICSH)推薦使用的抗凝劑,抗凝的濃度為1.5～2.2 mg/ml全血。它是強(qiáng)有效的金屬螯合劑,此抗凝劑不影響白細(xì)胞的計(jì)數(shù)及大小,并且有比檸檬酸鈉更強(qiáng)的金屬離子結(jié)合能力,故可以更好地抑制血小板的聚集,廣泛地應(yīng)用于血常規(guī)及凝血實(shí)驗(yàn)的全血收集。但是血制品的保存最常使用的抗凝劑為檸檬酸鈉制劑,需要降低大量輸血后因?yàn)榻饘匐x子的結(jié)合而產(chǎn)生的低血鈣,相較于EDTA更為安全。但PRP的提取僅需要50～80 ml的全血,濃縮以后的PRP中抗凝劑的含量并不會(huì)在局部注射后明顯影響體內(nèi)的離子濃度。

本實(shí)驗(yàn)選用了三組抗凝劑對(duì)PRP提取的效果進(jìn)行對(duì)比,采取了相同的制備方法,規(guī)避了其他因素對(duì)PRP質(zhì)量的影響,實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果提示EDTA管提取PLT數(shù)量高達(dá)(1 250.2±246.0)×109/L,優(yōu)于3.8%檸檬酸鈉抗凝管和肝素抗凝管,平均可達(dá)到全血的5～6倍,而肝素管僅3～4倍。需要注意的是,EDTA可以使血小板平均體積升高至11.4～12.9,以及大型血小板比例(P-LCR)平均升高至40.76%,但這一變化并沒有達(dá)到異常狀態(tài),鏡下的觀察亦沒有發(fā)現(xiàn)異常形態(tài)和分布的血小板。此外,為了驗(yàn)證三組PRP的生物學(xué)作用,本實(shí)驗(yàn)采用ELISA檢測鈣劑激活前后PRP中釋放的PDGF和TGF-β1的濃度。PDGF和TGF-β1為PRP釋放的眾多生物因子中作用最廣泛,最有利于促進(jìn)創(chuàng)面愈合的兩種因子之一。結(jié)果提示,EDTA抗凝管提取的PRP中釋放的兩種因子較其他兩組總體都相應(yīng)偏高,在創(chuàng)面愈合等疾病的治療中可以發(fā)揮更有利的生物學(xué)作用。作為可以加強(qiáng)凝血酶以及滅活多種凝血因子的臨床常用抗凝劑,肝素與EDTA和檸檬酸鈉的抗凝原理完全不同,故在第一次離心后,上清液十分清澈,血小板亦因壓合牢固難以取出。本課題采用肝素作為陰性對(duì)照,其對(duì)PRP的濃縮效果并不理想,不推薦使用。

PRP可促進(jìn)慢性難愈合的創(chuàng)面以及骨缺損和軟骨的再生,得益于其內(nèi)多種細(xì)胞因子的釋放和其獨(dú)特的抗菌性[17-20],如何在制備的過程中保證PRP的質(zhì)量及濃度需要進(jìn)一步探索和研究。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用相關(guān)方法驗(yàn)證得到,EDTA抗凝劑采血收集全血,二次梯度離心后,得到的PRP中血小板數(shù)量更多,且鈣劑激活后,PDGF和TGF-β1兩種因子的釋放濃度也相應(yīng)提高,未來還需對(duì)血小板的功能做進(jìn)一步的測定和分析,對(duì)是否可以采用EDTA抗凝劑制備PRP提供更進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。