雙波長HPLC法測定脈君安片中6種成分含量

孫迎春,程 卉,楊積慧

(1安慶市食品藥品檢驗中心,安慶 246001;2安徽中醫(yī)藥大學藥學院;*通訊作者,E-mail:xuanqi2009@126.com)

脈君安片由中藥材鉤藤(1 470 g)、葛根(549 g)和西藥氫氯噻嗪(1.5 g)組成,按處方劑量將中藥材簡單粉碎、部分浸提,再與氫氯噻嗪混合,制成顆粒,壓制成1 000片,包糖衣即得,具有平肝熄風、解痙止痛之功效,臨床用于高血壓癥、頭痛眩暈、頸項強痛、失眠心悸、冠心病的治療[1]。方中鉤藤用量較大,具有息風定驚、清熱平肝的作用[2]。鉤藤的主要藥效成分為生物堿類[3,4],主要作用于心血管系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng),具有降低血壓、擴張血管、減慢心率和抑制心肌收縮力等多種功效,以鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿和異去氫鉤藤堿為代表的單萜吲哚類生物堿是鉤藤的主要活性成分[5-8]。葛根具有解肌退熱、生津止渴、透疹、升陽止瀉等功效,其主要活性成分葛根素具有擴張血管、降血壓、降血糖、抗腫瘤、提高機體免疫力等作用,尤其在改善心腦血管疾病方面應用廣泛[9,10]。氫氯噻嗪為中效利尿藥,研究表明,葛根素、鉤藤堿與氫氯噻嗪合用能增強氫氯噻嗪體內(nèi)吸收的效果[11]。現(xiàn)行脈君安片質(zhì)量標準[1]僅有化學鑒別和對氫氯噻嗪的薄層鑒別,無含量測定項,文獻[12,13]僅以葛根素或氫氯噻嗪一種成分作為指標,均難以全面反映其內(nèi)在質(zhì)量。本研究通過雙波長高效液相色譜法(HPLC)同時測定脈君安片中葛根素、氫氯噻嗪、鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿的含量,以期為后續(xù)脈君安片的質(zhì)量標準提高提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

Waters e2695型高效液相色譜儀(美國沃特世公司);XPE105型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司);KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司)。

對照品葛根素(110752-201313,純度95.5%)、氫氯噻嗪(100309-201404,純度99.7%)均購于中國食品藥品檢定研究院;鉤藤堿(批號:MUST-21061511,純度≥98.0%)、異鉤藤堿(批號:MUST-21061510,純度≥98.0%)均購于成都曼思特生物科技有限公司;去氫鉤藤堿(ST10570120,純度≥98.0%)、異去氫鉤藤堿(ST11080120,純度≥98.0%)均購于上海詩丹德生物技術(shù)有限公司;3批脈君安片均購自國藥集團中聯(lián)藥業(yè)有限公司,批號分別為200060,210020,200010;甲醇為色譜純,來自美國Fisher公司,水為超純水,其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱:菲羅門Titank C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相:以甲醇為流動相A,以水(含0.05%的三乙胺溶液,用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至7.6)為流動相B,梯度洗脫(0～10 min,80%A;10～15 min,80%A→33%A;15～40 min,33%A;40～45 min,33%A→80%A;45～50 min,80%A);流速:1.0 ml/min;柱溫:30 ℃;檢測波長:270 nm(氫氯噻嗪)、245 nm(葛根素、鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿);進樣量:10 μl。

1.2.2 混合對照品溶液的制備 取各對照品適量,精密稱定,加甲醇使溶解,配制成每1 ml含氫氯噻嗪1.443 mg、葛根素7.681 mg、鉤藤堿0.162 mg、異鉤藤堿0.140 mg、去氫鉤藤堿0.117 mg、異去氫鉤藤堿0.132 mg的對照品儲備液,精密量取對照品儲備液1 ml,置25 ml棕色量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,作為混合對照品溶液,室溫避光保存,備用。

1.2.3 供試品溶液的制備 取本品20片,除去包衣,精密稱定,研細,取約0.37 g(約相當于一片量),精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇25 ml,密塞稱重,浸泡過夜,超聲處理40 min,放冷,再稱定質(zhì)量,用70%甲醇補足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過。精密量取續(xù)濾液10 ml,加在中性氧化鋁柱(100～200目,3 g,內(nèi)徑為1 cm)上,用70%甲醇40 ml洗滌,收集流出液及洗脫液,60 ℃水浴蒸干,殘渣加甲醇溶解,并定容至10 ml量瓶中,搖勻,用0.45 μm微孔濾膜濾過,即得供試品溶液。

1.2.4 陰性樣品溶液的制備 按處方比例(鉤藤1 470 g,葛根549 g,氫氯噻嗪1.5 g)分別制備無鉤藤、無葛根、無氫氯噻嗪的陰性樣品,再按“1.2.3”項下供試品溶液的制備方法分別制備各陰性樣品溶液。

2 結(jié)果

2.1 提取條件的考察

試驗考察了中性氧化鋁的目數(shù)(100～200目和200～300目)及用量(2,3,4 g)對提取率的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),目數(shù)100～200目,用量2 g時,提取率雖較高,但凈化效果欠佳,目數(shù)200～300目時,提取效率偏低,結(jié)果見表1。采用不同體積(20,30,40,50 ml)的70%甲醇進行洗脫,結(jié)果發(fā)現(xiàn),40 ml與50 ml提取效果接近,均高于20 ml和30 ml,結(jié)果見表2。因此供試品溶液的提取條件為中性氧化鋁柱的目數(shù)100～200目,3 g,用70%甲醇40 ml洗滌。

2.2 專屬性試驗

分別吸取“1.2.2”項下混合對照品溶液、“1.2.3”項下供試品溶液及“1.2.4”項下陰性樣品溶液各10 μl,按“1.2.1”項下色譜條件進行測定,結(jié)果表明:待測成分能基線分離,理論塔板數(shù)按各成分峰計算均大于8 000,陰性樣品溶液色譜與對照品、供試品色譜相對應保留時間處均沒有相應的色譜峰(見圖1),說明該方法對測定脈君安片中的葛根素、氫氯噻嗪、鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿及異去氫鉤藤堿具有專屬性,無其他干擾。

表1 中性氧化鋁的目數(shù)和用量對提取結(jié)果的影響 (n=3)

表2 不同體積70%甲醇洗脫對提取結(jié)果的影響 (n=3)

1.氫氯噻嗪;2.葛根素;3.異去氫鉤藤堿;4.異鉤藤堿;5.去氫鉤藤堿;6.鉤藤堿圖1 混合對照品、供試品與各陰性樣品HPLC色譜圖Figure 1 HPLC chromatograms of mixed reference, Maijun’an tablet sample and negative samples

2.3 線性考察

分別精密稱取氫氯噻嗪、葛根素、鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿對照品適量,加甲醇溶解并制成每1 ml含氫氯噻嗪1.148 4 mg/ml、葛根素6.103 4 mg/ml、鉤藤堿0.128 7 mg/ml、異鉤藤堿0.095 5 mg/ml、去氫鉤藤堿0.113 2 mg/ml、異去氫鉤藤堿0.107 1 mg/ml的混合對照品母液。精密吸取上述對照品母液0.1,0.5,1.0,2.0,5.0,10.0 ml分別置于20 ml量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,得系列混合對照品溶液,精密吸取上述系列混合對照品溶液按“1.2.1”項下色譜條件測定,記錄色譜圖。以各待測成分質(zhì)量濃度(μg/ml)為橫坐標(x),相應峰面積為縱坐標(y)進行線性回歸,結(jié)果顯示,各待測成分在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系(見表3)。

表3 各成分線性關(guān)系

2.4 精密度試驗

精密吸取“1.2.2”項下混合對照品溶液10 μl注入液相色譜儀,按“1.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次,記錄其峰面積測量值,結(jié)果氫氯噻嗪、葛根素、鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿的精密度RSD分別為0.39%,0.52%,0.41%,0.67%,0.58%,0.73%(見表4),表明儀器精密度良好。

2.5 重復性試驗

取同一批片劑(批號:210020)6份,按照“1.2.3”項下方法制備供試品溶液,按“1.2.1”項下色譜條件進樣,測得氫氯噻嗪、葛根素、鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿含量RSD分別為0.95%,1.47%,2.02%,1.03%,1.26%,1.90%(見表4),表明本方法重復性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一份供試品溶液,于溶液配制后的0,4,8,12,16,20,24 h按“1.2.1”項下色譜條件進樣,測得氫氯噻嗪、葛根素、鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿峰面積的RSD分別為0.43%,0.51%,1.56%,1.34%,1.01%,1.13%(見表4),表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表4 供試品溶液6種成分檢測的精密度、重復性、穩(wěn)定性試驗 (n=6)

2.7 加樣回收率試驗

取各成分含量已知的脈君安片(批號:210020)適量,研細,精密稱取0.37 g,置具塞錐形瓶中,共6份,分別精密加入“1.2.2”項下對照品儲備液1.0 ml,按照“1.2.3”項下方法制備供試品溶液,再按“1.2.1”項下色譜條件進樣測定,記錄色譜圖,計算各成分加樣回收率及其RSD值,結(jié)果見表5。

2.8 檢測限與定量限

選定的色譜條件下,以信噪比S/N=3,測得最低檢測限:鉤藤堿為0.79 ng,異鉤藤堿0.61 ng,去氫鉤藤堿0.66 ng,異去氫鉤藤堿0.69 ng;以信噪比S/N=10,測得定量限:鉤藤堿為3.76 ng,異鉤藤堿3.19 ng,去氫鉤藤堿3.47 ng,異去氫鉤藤堿3.55 ng。

2.9 市售樣品檢測

取3批次脈君安片樣品(國藥集團中聯(lián)藥業(yè)有限公司,批號分別為200060,210020,200010)各3份,分別按照“1.2.3”項下方法制備供試品溶液,依法測定氫氯噻嗪、葛根素、鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿和異去氫鉤藤堿的含量并計算結(jié)果見表6。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

通過UV-2550型紫外可見分光光度計在190～400 nm波長段分別對葛根素、氫氯噻嗪、鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿進行掃描,并參考《中國藥典》2020年版一部和二部可知,葛根素和氫氯噻嗪分別在250 nm和270 nm波長處有最大吸收。鉤藤堿和異鉤藤堿,去氫鉤藤堿和異去氫鉤藤堿分別為同分異構(gòu)體,母核結(jié)構(gòu)基本相似,紫外吸收幾乎相同,分別在243～247 nm波長處有最大吸收。于245 nm和250 nm處對葛根素進行檢測,其峰面積、分離度幾乎無變化,參考相關(guān)文獻選擇245 nm為葛根素和4種生物堿的共同檢測波長[14,15]。

表5 六種成分加樣回收率試驗結(jié)果 (n=6)

表6 市售樣品中6種成分含量測定結(jié)果 (n=3)

3.2 供試品溶液提取方法的選擇

根據(jù)指標成分理化性質(zhì),參考文獻[16,17]選用70%甲醇作為提取溶劑,超聲或回流提取,提取率均較高但雜質(zhì)峰較多,為進一步純化,使用中性氧化鋁柱進行凈化處理后,雜質(zhì)峰明顯減少,分離度均能達到2.0以上。用“1.2.3”項下的方法提取供試品溶液,通過加樣回收率試驗,各成分平均加樣回收率為96.8%～99.2%,表明中性氧化鋁柱對指標成分含量測定結(jié)果幾乎無影響?？紤]回流提取溫度較高,鉤藤生物堿在高溫下穩(wěn)定性較差[18],受熱易發(fā)生轉(zhuǎn)化,而超聲提取處理時間較短且更為便捷,因此選擇超聲提取。

3.3 色譜條件的選擇

用甲醇-水或乙腈-水作流動相,4種生物堿色譜峰拖尾嚴重,在水相中加入三乙胺,并且對其濃度由0.01%逐漸增加,同時用冰醋酸調(diào)節(jié)pH,結(jié)果顯示,當水相三乙胺濃度為0.05%、pH值為7.5～8.0,有機相為甲醇時,4種生物堿峰形能得到明顯改善。進一步考察流動相的比例,當甲醇-三乙胺水溶液等度洗脫時,葛根素和氫氯噻嗪很難分開,改為梯度洗脫(見“1.2.1”項下),6種成分分離度均較好,且保留時間較為恰當,高效液相色譜圖基線平穩(wěn)。因此選擇上述流動相及洗脫條件。

綜上所述,建立了脈君安片的HPLC雙波長分析方法,測定了葛根素、氫氯噻嗪、鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿和異去氫鉤藤堿的含量,該方法操作簡便,專屬性強,重復性好,準確度高,可為脈君安片質(zhì)量評價與控制提供科學依據(jù)。