不同方法誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生CD8+記憶性T細(xì)胞的研究

黃曉東 楊磊 黃清云 高雪辰

近年來記憶性T淋巴細(xì)胞在移植物免疫損傷中的作用已越來越受到人們的重視[1-2]，特別是同種移植中CD8+記憶性T細(xì)胞的作用尤受關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)，CD8+記憶性T細(xì)胞能在極短的時(shí)間內(nèi)清除再次進(jìn)入到體內(nèi)的抗原，發(fā)揮強(qiáng)大的免疫效能[3-4]。正是由于免疫反應(yīng)以及免疫記憶的存在，使受體體內(nèi)移植的健康器官難以長(zhǎng)時(shí)間發(fā)揮功能甚至難以長(zhǎng)期存活。自體移植在正常情況下，一般不會(huì)發(fā)生移植排斥反應(yīng)，但是在同種異體間進(jìn)行移植，常會(huì)發(fā)生不同程度的排斥反應(yīng)，T細(xì)胞同樣具有特異性和記憶性，在抑制排斥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[5-6]。免疫學(xué)相關(guān)文獻(xiàn)指出，不同品系小鼠之間進(jìn)行皮膚移植和輸注淋巴細(xì)胞的方法可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)[7-8]。本研究采用兩種方法誘導(dǎo)小鼠機(jī)體產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，探討并比較兩種方法形成CD8+記憶性T細(xì)胞性質(zhì)和數(shù)量的差異，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 受體小鼠采用4～6周齡雌性Bal B/C小鼠，共100只，體重18～20 g；提供皮片和脾臟淋巴細(xì)胞的為同一只6周齡C57小鼠，體重25 g。所有小鼠均由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案已通過廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 儀器和試劑 冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司，5810R）；流式細(xì)胞儀（美國(guó) BD 公司，CannonⅡ）；流式熒光抗體 CD3-FITC、CD8-PE、CD44-FITC、CD62L-cy5.5（美國(guó)BD公司）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（德國(guó)Thermo公司）；細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑及耗材（中國(guó)四季青公司）；無菌手術(shù)器械，包括一次性方巾、眼科剪、眼科鑷、持針器、一次性6-0帶針縫合線（美國(guó)FST公司）；高壓滅菌鍋（德國(guó)Thermo公司）；1%戊巴比妥鈉（中國(guó)點(diǎn)滴實(shí)驗(yàn)試劑有限公司）。

1.3 分組 將75只Bal B/C小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為移植組、1×106注射組、5×106注射組、1×107注射組、空白對(duì)照組，每組15只。

1.4 供體處理 將C57小鼠頸椎脫臼處死后浸泡于75%乙醇5 min，在生物安全柜內(nèi)應(yīng)用無菌操作取背部皮片，剪成每塊約0.25 cm2，共15塊，均浸泡于放有0.9%氯化鈉溶液的平皿中并置于冰上，備用于移植組小鼠背部移植。然后將小鼠取右側(cè)臥位，皮膚表面消毒后依次剪開皮膚、腹膜，無菌操作下取出整個(gè)脾臟，將脾臟置于有0.9%氯化鈉溶液的平皿中，用2支1 ml注射器的針頭（彎成直角）在脾臟表面刺破3～5個(gè)小孔后，再輕刮脾臟表面，充分將內(nèi)部組織刮出置于平皿中形成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液用冷凍離心機(jī)以1 200 r/min離心5 min，棄上清液后加入紅細(xì)胞裂解液，充分混勻后靜置10 min。重復(fù)該步驟2次后，使用200目過濾網(wǎng)過濾掉雜質(zhì)，所得細(xì)胞懸液即為淋巴細(xì)胞懸液。用牛鮑計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后分別取出1×106個(gè)、5×106個(gè)、1×107個(gè)細(xì)胞各15份，重懸于0.2 ml PBS緩沖液中，制成相應(yīng)的淋巴細(xì)胞懸液并置于冰上，備用于 1×106注射組、5×106注射組、1×107注射組小鼠腹腔注射。

1.5 受體處理 移植組小鼠采用1%戊巴比妥鈉0.1 ml/10 g腹腔注射麻醉。剃除背部皮膚毛發(fā)后用75%乙醇消毒，并剪除約0.25 cm2，取供體皮膚在2、3、5、6、8、9、11、12 點(diǎn)鐘方向進(jìn)行縫合，然后置于臺(tái)燈下復(fù)蘇。1×106注射組、5×106注射組、1×107注射組小鼠分別注射制備好的淋巴細(xì)胞懸液0.2 ml?？瞻讓?duì)照組小鼠腹腔注射PBS緩沖液0.2 ml。

1.6 CD8+記憶性T細(xì)胞百分比及CD3+T細(xì)胞數(shù)檢測(cè)上述處理后1、2、3個(gè)月時(shí)，5組小鼠均按隨機(jī)數(shù)字表法各取5只頸椎脫臼處死，取出脾臟制成淋巴細(xì)胞懸液，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD8+記憶性T淋巴細(xì)胞百分比及CD3+T細(xì)胞數(shù)。CD8+記憶性T細(xì)胞用CD8-PE、CD44-FITC、CD62L-cy5.5進(jìn)行標(biāo)記。4℃避光染色30 min后用 300 μl PBS洗滌細(xì)胞，1 200 r/min離心5 min，棄上清液。重復(fù)該步驟2次，最終加入500 μl PBS重懸，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD8+記憶性T細(xì)胞百分比。CD3+T細(xì)胞數(shù)檢測(cè)時(shí)采用CD3-FITC進(jìn)行標(biāo)記，細(xì)胞染色步驟同上，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)后可從軟件中直接獲得細(xì)胞CD3+T細(xì)胞數(shù)。

1.7 CD8+記憶性T細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 將剩余25只小鼠按照1.4、1.5中的方法重新制備5種小鼠模型，每組5只。在淋巴細(xì)胞產(chǎn)生最多的時(shí)間點(diǎn)（經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示為2個(gè)月）處死各組小鼠，按1.4操作步驟將小鼠脾臟制成淋巴細(xì)胞懸液，進(jìn)行CD8+記憶性T細(xì)胞分選、純化。具體步驟按照CD8+記憶性T淋巴細(xì)胞隱性分選試劑盒說明書操作：分別將50 μl CD8&CD44&CD62L生物素抗體與各組小鼠淋巴細(xì)胞懸液混合，孵育15 min后加入試劑盒中所配磁珠，將細(xì)胞與磁珠充分混勻后孵育15 min，過磁力架15 min，棄磁珠，所得淋巴細(xì)胞懸液重復(fù)上述步驟1次，即得CD8+記憶性T淋巴細(xì)胞。CD8+記憶性T淋巴細(xì)胞的分選純度使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，染色及操作步驟同上；檢測(cè)結(jié)果使用EXPO32流式軟件進(jìn)行分析，所分析細(xì)胞均為CD8+細(xì)胞。隨后建立十字坐標(biāo)系，橫軸指標(biāo)為CD62L，縱軸指標(biāo)為CD44，目的細(xì)胞CD8+記憶性T細(xì)胞表達(dá)情況為CD44+CD62L-，即落在第二象限的細(xì)胞比例為CD8+記憶性T細(xì)胞比例。

經(jīng)牛鮑計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，各組取相同數(shù)目的CD8+記憶性T淋巴細(xì)胞經(jīng)羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯（carboxy fluorescein diacetate succinimide ester，CFSE）染色，與經(jīng)過輻照的C57小鼠脾臟細(xì)胞共培養(yǎng)，1周后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CFSE染色陽(yáng)性細(xì)胞熒光強(qiáng)度，并將結(jié)果使用Modify 3.0軟件進(jìn)行分析，比較5組小鼠CD8+記憶性T細(xì)胞的增殖指數(shù)，從而評(píng)價(jià)其增殖能力。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；組內(nèi)不同時(shí)點(diǎn)的比較采用單因素重復(fù)測(cè)量方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5組小鼠不同時(shí)點(diǎn)CD8+記憶性T細(xì)胞百分比及CD3+T細(xì)胞總數(shù)的變化和比較 5組小鼠處理后1個(gè)月時(shí)CD8+記憶性T細(xì)胞百分比和CD3+T細(xì)胞總數(shù)的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。處理后2個(gè)月時(shí)，3個(gè)注射組小鼠CD8+記憶性T細(xì)胞百分比均高于移植組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），其中以1×106注射組百分比最高；移植組、1×106注射組、5×106注射組、1×107注射組CD3+T細(xì)胞總數(shù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），但與空白對(duì)照組比較均明顯升高（P＜0.05）；處理后 3個(gè)月時(shí)，5×106注射組CD8+記憶性T細(xì)胞百分比高于移植組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而5組間CD3+T細(xì)胞總數(shù)比較，結(jié)果同2個(gè)月時(shí)。

1×106注射組小鼠在處理后2個(gè)月時(shí)CD8+記憶性T細(xì)胞比例最高，與處理后1、3個(gè)月比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；5×106注射組、1×107注射組、移植組小鼠均在處理后3個(gè)月時(shí)CD8+記憶性T細(xì)胞比例最高，其中5×106組3個(gè)月時(shí)與1、2個(gè)月時(shí)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。移植組、1×106注射組、5×106注射組、1×107注射組小鼠CD3+T細(xì)胞總數(shù)均在處理后2個(gè)月時(shí)最高，與1、3個(gè)月時(shí)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。

表1 5組小鼠不同時(shí)點(diǎn)CD8+記憶性T細(xì)胞百分比及CD3+T細(xì)胞總數(shù)的變化和比較

2.2 5組小鼠CD8+記憶性T細(xì)胞增殖能力變化與比較 5組小鼠脾臟CD8+記憶性T細(xì)胞分選純化后，純度達(dá)到95.3%（圖1），達(dá)到本研究所需要求。純化后的CD8+記憶性T細(xì)胞與C57小鼠淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后，各注射組與移植組增殖指數(shù)的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；各注射組、移植組與空白對(duì)照組比較，其增殖指數(shù)均有明顯提高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表 2。

圖1 CD8+記憶性T細(xì)胞分選、純化后純度檢測(cè)

表2 5組小鼠CD8+記憶性T細(xì)胞增殖指數(shù)的比較

3 討論

人體的免疫系統(tǒng)不僅具有實(shí)時(shí)免疫功能，同時(shí)也存在免疫記憶功能[9]，即在抗原初次對(duì)機(jī)體進(jìn)行刺激時(shí)，促使一系列免疫細(xì)胞增殖、活化，進(jìn)而發(fā)揮免疫功能[10]，如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞以及漿細(xì)胞等，在抗原完全被清除后，會(huì)形成少量具有記憶功能的免疫細(xì)胞儲(chǔ)存在機(jī)體免疫器官中，如CD8+T細(xì)胞，通常會(huì)在外界抗原入侵機(jī)體后1周左右達(dá)到高峰[11]。隨后，在抗原被完全清除后，大部分效應(yīng)性CD8+T細(xì)胞凋亡，并被脾臟所破壞，少部分則逐漸分化成為能夠長(zhǎng)期存活的記憶性T細(xì)胞[12]。記憶性T細(xì)胞無論是在器官移植排斥和抗腫瘤過程中，均發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，同時(shí)也是移植免疫和腫瘤免疫領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。近年來，關(guān)于記憶性T細(xì)胞的研究越來越多。由于機(jī)體在正常狀態(tài)下細(xì)胞免疫未受到激活，記憶性T細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)含量十分低。因此，如何獲取足夠的記憶性T細(xì)胞，是進(jìn)行記憶性T細(xì)胞研究的一個(gè)重要且困難的環(huán)節(jié)[13]。

本研究將傳統(tǒng)的應(yīng)用皮膚移植誘導(dǎo)CD8+記憶性T細(xì)胞的方法，與新的方法，即對(duì)小鼠進(jìn)行同種異基因脾臟淋巴細(xì)胞注射誘導(dǎo)CD8+記憶性T細(xì)胞的方法進(jìn)行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處理后2個(gè)月時(shí)最高CD8+記憶性T細(xì)胞比例可達(dá)到（42.28±2.74）%，高于傳統(tǒng)的移植組；處理后3個(gè)月時(shí)，各注射組小鼠脾臟中CD8+記憶性T細(xì)胞百分比最高達(dá)到（56.57±1.28）%，而此時(shí)小鼠開始逐漸進(jìn)入免疫記憶階段，體內(nèi)的CD3+T細(xì)胞總數(shù)開始下降，因此建議選取注射1×106個(gè)細(xì)胞，誘導(dǎo)時(shí)間為2個(gè)月，此時(shí)產(chǎn)生的CD8+記憶性T細(xì)胞百分比相對(duì)較高，CD3+T細(xì)胞總數(shù)較多，誘導(dǎo)周期相對(duì)較短，效果令人滿意。同時(shí)，各注射組、移植組與空白對(duì)照組比較，CD8+記憶性T細(xì)胞增殖指數(shù)均有明顯提高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

綜上所述，記憶性T細(xì)胞通常以低水平存在于脾臟及外周血中，本研究所采用的方法有助于獲取足夠的記憶性T細(xì)胞，在進(jìn)行記憶性T細(xì)胞的課題研究中具有一定的應(yīng)用價(jià)值。