正交試驗法優(yōu)選鹽黃柏的炮制工藝

胡 雨，麻雨樂，高 波，，羅 川，郭志俊，高 巍，張莉梅，王 榮

(1 安徽華潤金蟾藥業(yè)股份有限公司，安徽 淮北 235000；2 華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，廣東 深圳 518110)

黃柏是黃皮樹PhellodendronchinenseSchneid.的干燥樹皮。具有清熱解毒，燥濕療瘡的功能和效果。黃柏鹽炙后引藥入腎，偏于滋陰降火。用于陰虛火旺，盜汗骨蒸[1]。黃柏藥材中主要化學(xué)成分為黃酮類和生物堿類，其具有降血糖，降血壓以及免疫抑制等多種藥理作用[2]。在這些化學(xué)成分中，小檗堿是黃柏中最主要的有效成分之一，含量可以達到3.0%以上，是黃柏中主要的降血糖和抗炎成分[3]，也是《中國藥典》2020版黃柏質(zhì)量評價的量化指標(biāo)之一?！吨袊幍洹?020版鹽黃柏炮制工藝缺少可控的工藝參數(shù)，制備的鹽黃柏質(zhì)量不一。目前，關(guān)于鹽黃柏炮制工藝研究的文獻[3-7]，多以小檗堿和黃柏堿作為評價指標(biāo)，缺少對鹽黃柏標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率及浸出物的評價。而本研究以小檗堿、黃柏堿、標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率及浸出物為指標(biāo)，采用L9(34)正交實驗設(shè)計，采用L9(34)正交實驗設(shè)計，考察悶潤時間，炒制溫度，炒制時間3個因素，優(yōu)選鹽黃柏的炮制工藝，以期可以為鹽黃柏的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 儀器和試劑

1.1 儀 器

Thermofisher型高效液相色譜儀(包括柱溫箱、泵、進樣器、DAD檢測器)；色譜柱Kromasil-100-5-C18(5 μm，4.6 nm×250 nm)、色譜柱Agilent zorbax sb C18(5 μm，4.6 nm×250 nm)、KQ-500E型超聲清洗儀；AT系列溶劑過濾器(0.22 μm)，XP26型百萬分之一電子天平，梅特勒-托利多有限公司；DFY-300粉碎機，林大機械有限公司。

1.2 試 藥

黃柏飲片(批號：200905)；鹽酸小檗堿(批號：110713-201212，純度89.7%)；鹽酸黃柏堿(批號：111895-201504，純度94.9%)；甲醇(色譜純)；娃哈哈純凈水，杭州娃哈哈飲料科技有限公司；黃柏樣品購買于亳州某公司，經(jīng)鑒定為藥典收載基源黃皮樹的干燥樹皮。

2 方 法

2.1 小檗堿含量測定

2.1.1 液相色譜條件

C18色譜柱；以乙腈-0.1%磷酸溶液(50:50)(每100 mL加十二烷基磺酸鈉0.1 g)為流動相；檢測波長為265 nm。理論板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計算應(yīng)不低于4000[1]。見圖1。

圖1 鹽黃柏HPLC(小檗堿)

2.1.2 對照品溶液的制備

取鹽酸小檗堿對照品適量，參照《中國藥典》(2020版)黃柏藥材標(biāo)準(zhǔn)小檗堿含量測定項對照品溶液的制備方法制備對照品溶液，即得[1]。

2.1.3 供試品溶液的制備

參照《中國藥典》(2020版)黃柏藥材標(biāo)準(zhǔn)小檗堿含量測定項供試品溶液的制備方法制備樣品溶液，即可[1]。

2.2 黃柏堿含量測定

2.2.1 液相色譜條件

C18色譜柱；以乙腈-0.1%磷酸溶液(每100 mL加十二烷基磺酸鈉0.2 g)(36:64)為流動相；檢測波長為284 nm。理論板數(shù)按鹽酸黃柏堿峰計算應(yīng)不低于6000[1]。見圖2。

圖2 鹽黃柏HPLC(黃柏堿)

2.2.2 對照品溶液的制備

取鹽酸黃柏堿對照品適量，參照《中國藥典》(2020版)黃柏藥材標(biāo)準(zhǔn)黃柏堿含量測定項對照品溶液的制備方法制備對照品溶液，即得[1]。

2.2.3 供試品溶液的制備

參照《中國藥典》(2020版)黃柏藥材標(biāo)準(zhǔn)黃柏堿含量測定項供試品溶液的制備方法制備樣品溶液，即可[1]。

2.3 浸出物含量測定

依照《中國藥典》2020版(四部)通則“2201”浸出物測定項下冷浸法對黃柏樣品及炮制的鹽黃柏樣品的醇溶性浸出物進行測定。參照《中國藥典》一部“黃柏”項下浸出物含量規(guī)定：應(yīng)不低于14.0%。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率的測定

2.4.1 標(biāo)湯制備參數(shù)考察

基于《配方顆粒技術(shù)要求》(意見稿)制定鹽黃柏標(biāo)準(zhǔn)湯劑實驗方案[8]。按照鹽黃柏的藥性及用藥部位(皮類)選擇煎煮參數(shù)，對加水量(倍數(shù))的要求“煎煮開始時的用水量一般以浸過藥面2～5 cm為宜”進行考察，確定了鹽黃柏標(biāo)準(zhǔn)湯劑加水量及煎煮參數(shù)，具體參數(shù)見表1。

表1 鹽黃柏標(biāo)準(zhǔn)湯劑參數(shù)表

2.4.2 不同工藝鹽黃柏標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備

取表4中各工藝鹽黃柏樣品約100 g，參照鹽黃柏標(biāo)準(zhǔn)湯劑參數(shù)表(表1)及文獻[9]中方法制備不同工藝鹽黃柏的標(biāo)準(zhǔn)湯劑。

2.4.3 出膏率測定

取合并水煎液約50 g，精密稱定，參照文獻[9]中出膏率的測定方法對表4中不同工藝條件下的樣品出膏率進行測定。

2.5 正交試驗

2.5.1 鹽黃柏工藝的正交試驗設(shè)計

基于鹽黃柏加工文獻檢索綜述[3-7]及單因素考察，利用L9(34)正交設(shè)計，考察悶潤時間(A)、炒制溫度(B)、炒制時間(C)3個因素，以小檗堿、黃柏堿、浸出物、標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率為指標(biāo)，優(yōu)選鹽黃柏的炮制工藝。各因素水平見表2。

表2 正交設(shè)計因素水平表

2.5.2 綜合評分標(biāo)準(zhǔn)

為了更準(zhǔn)確地反映鹽黃柏炮制工藝中各因素對其質(zhì)量的影響。本試驗以以小檗堿、黃柏堿、醇溶性浸出物和標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率為評價指標(biāo)，用加權(quán)平均法計算綜合評分[10]。其中小檗堿及黃柏堿權(quán)重均為0.3，醇溶性浸出物及標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率權(quán)重均為0.2。綜合的評分=小檗堿加權(quán)評分+黃柏堿加權(quán)評分+浸出物加權(quán)評分+出膏率的加權(quán)評分[11]。各指標(biāo)評分見表3，實驗安排及結(jié)果見表4，方差分析詳見表5。

表3 指標(biāo)加權(quán)評分表

表4 正交試驗結(jié)果及分析

表5 綜合評分方差分析

直觀分析的試驗結(jié)果由表4 的極差(R)可以看出：在黃柏鹽炙的正交試驗設(shè)定的因素及水平條件下，對綜合評分影響大小的因素進行分析，影響由大到小的順序為 B因素>A因素>C因素。方差分析表明因素B對炮制工藝具有顯著性影響，因素A，C對炮制工藝則無顯著性影響[12]。所以從直觀分析及方差分析的試驗結(jié)果可得出：鹽黃柏的最佳炮制加工工藝為 A3B1C1，即取凈黃柏300 g，加入30 g食鹽水(鹽水濃度為20%)拌勻，悶潤1.5 h，放在130 ℃的炒藥設(shè)備中，炒制時間約為10 min，取出，晾涼，篩去碎屑即可。

2.6 驗證性試驗

取黃柏絲300 g，按優(yōu)選的工藝制備鹽黃柏樣品3份，測定小檗堿、黃柏堿、浸出物及標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率，驗證結(jié)果見表6。

表6 驗證試驗結(jié)果

結(jié)果表明，采用該優(yōu)選工藝制備的鹽黃柏樣品小檗堿、黃柏堿、醇溶性浸出物和標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率均較穩(wěn)定，表明該炮制工藝穩(wěn)定可控。即鹽黃柏炮制的最佳工藝為：取凈黃柏300 g，加入30 g的食鹽水(鹽水濃度為20%)混勻，鹽水悶潤1.5 h，投到130 ℃的炒藥機中，炒制約10 min，取出，晾涼，篩去碎屑即可[11]。

3 結(jié) 論

中藥飲片鹽炙過程中，炒制的溫度不能夠太高，炒制時間不能過長，以免因食鹽快速的析出而達不到鹽水炙的目的。此外，炒制時溫度過高或炒制的時間過長，也會導(dǎo)致藥材中的有效成分降低太多[3，5]。文中鹽黃柏優(yōu)選的最佳炒制溫度為 130 ℃，這也和文獻研究結(jié)果相符合。

劉仁俊等[3]優(yōu)選得出鹽黃柏最佳炮制工藝為：鹽水的濃度2%左右，悶潤時間大約 1.5 h，炒制溫度為 100 ℃左右，炒制時間大概 20 min。陳新華等[5]優(yōu)選的鹽黃柏工藝是采用2%濃度的鹽水，置于 100 ℃條件下，烘烤 30 min。程中琴等[7]以生物堿總量、3，5-二咖啡?？?、黃柏內(nèi)酯、異綠原酸B為綜合評價指標(biāo)得出鹽黃柏工藝為：悶潤1.5 h，放入預(yù)熱至 180 ℃炒藥機翻炒15～20 min。上述文獻研究所得工藝各不相同，該研究以小檗堿、黃柏堿、醇溶性浸出物、出膏率結(jié)合外觀性狀等多指標(biāo)代替單一指標(biāo)來優(yōu)選鹽黃柏炮制工藝，更科學(xué)合理。優(yōu)選的鹽黃柏工藝穩(wěn)定可行，重現(xiàn)性良好，可在一定程度上為鹽黃柏的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供參考。