MicroRNA與生精障礙的研究進(jìn)展

孫文文，阿周存

（大理大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2.農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南大理 671003）

精子發(fā)生是一個(gè)嚴(yán)格控制的、多步驟的過(guò)程，涉及眾多基因的表達(dá)調(diào)控。相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控異常會(huì)引起生精障礙。近年來(lái)大量研究表明，microRNA（miRNA）介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控是生精過(guò)程中基因表達(dá)調(diào)控的一種重要方式，對(duì)睪丸發(fā)育和精子生成至關(guān)重要。因此，miRNA 在生精障礙中的作用受到人們的關(guān)注，成為生精障礙遺傳病因?qū)W研究的一個(gè)新的領(lǐng)域，具有廣闊的探索空間。

1 miRNA在生精過(guò)程中的調(diào)節(jié)

miRNA 是一類長(zhǎng)度為20～25 個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，參與轉(zhuǎn)錄后基因水平的表達(dá)調(diào)控。其通過(guò)與RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（miRISC）的結(jié)合與靶mRNA 的3′-UTRs 堿基配對(duì)形成雙鏈，造成mRNA 碎片化進(jìn)而抑制靶基因翻譯表達(dá)。近年來(lái)，在人類和哺乳動(dòng)物研究中發(fā)現(xiàn)一些與精子發(fā)生相關(guān)的miRNA 基因。這些miRNA 可以調(diào)節(jié)生精過(guò)程中相關(guān)靶基因的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對(duì)整個(gè)生精過(guò)程的調(diào)控。見(jiàn)圖1（引自HE等[1]）。

圖1 miRNA調(diào)節(jié)生精過(guò)程示意圖

1.1 miRNA在精原干細(xì)胞自我更新和分化過(guò)程中的作用機(jī)制

精原干細(xì)胞（spermatogonial stem cells, SSCs）是睪丸中最原始的精原細(xì)胞，其通過(guò)自我更新、增殖、分裂等環(huán)節(jié)最終形成精子細(xì)胞[2]?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)調(diào)節(jié)人類SSCs 細(xì)胞的miRNA 基因，這些miRNA能通過(guò)靶向特定基因，對(duì)SSCs 增殖和DNA 的合成起調(diào)控作用。其中，miR-663a和miR-31-5p是比較明確的兩個(gè)。miR-663a使NFIX基因沉默，提高Cyclin A2、Cyclin B1 及Cyclin E1 細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子的水平，促進(jìn)人類SSCs 增殖和分化，同時(shí)抑制干細(xì)胞早期凋亡[3]。miR-31-5p具有與miR-663a相反的作用，miR-31-5p使JAZF1基因沉默，降低Cyclin A2 水平，進(jìn)而降低SSCs 增殖和DNA 合成，并促進(jìn)早期和晚期干細(xì)胞凋亡[4]。

除了在人類SSCs 中發(fā)現(xiàn)與生精相關(guān)的miRNA外，在動(dòng)物模型研究中也發(fā)現(xiàn)了許多的與SSCs 細(xì)胞調(diào)控相關(guān)的miRNA。一些miRNA 通過(guò)影響不同的信號(hào)傳導(dǎo)通路參與SSCs的發(fā)育調(diào)控。例如，miR-486、miR-322及miR-224分別沉默靶基因MMP2、RASSF8及DMRT1，激活WNT/β-catenin 信號(hào)傳導(dǎo)通路，參與對(duì)SSCs 自我更新和分化的調(diào)控[5-7]；而miR-19b-3p作用于靶基因PLZF后激活Jak-Stat 信號(hào)傳導(dǎo)通路，并通過(guò)這一信號(hào)通路調(diào)控SSCs 增殖分化過(guò)程[8]。除上述miRNA 外，還有一些miRNA 明確的靶基因，并且都能調(diào)控小鼠SSCs 的自我更新，但其調(diào)控過(guò)程中具體涉及哪些信號(hào)通路仍需進(jìn)一步研究。如miR-31、miR-100、miR-125a等[9-11]。此外，有研究[12]報(bào)道m(xù)iR-21也能促進(jìn)水牛SSCs 的分化，但其靶基因和調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

上述在動(dòng)物SSCs 發(fā)育調(diào)控中發(fā)揮作用的miRNA 與人類SSCs 的關(guān)系還有待進(jìn)一步證實(shí)，但這些miRNA 的發(fā)現(xiàn)為闡明人類SSCs 發(fā)育調(diào)控相關(guān)的miRNA 提供了有價(jià)值的線索。

1.2 miRNA對(duì)減數(shù)分裂及減數(shù)分裂后的調(diào)節(jié)

miRNA 在減數(shù)分裂和減數(shù)分裂后的生精細(xì)胞中發(fā)揮著重要作用。許多miRNA 基因序列在X 染色體上串聯(lián)重復(fù)，形成多個(gè)獨(dú)立、具有選擇驅(qū)動(dòng)性的miRNA 簇，導(dǎo)致哺乳動(dòng)物X 染色體miRNA 基因密度高于常染色體[13]。在雄性哺乳動(dòng)物減數(shù)分裂粗線期，X 和Y 染色體轉(zhuǎn)錄沉默的過(guò)程稱為減數(shù)分裂性染色體失活。減數(shù)分裂性染色體失活在哺乳動(dòng)物中高度保守，對(duì)雄性動(dòng)物正常生精功能是必須的[14]。研究表明，X 染色體上的miRNA（也稱為X 連鎖miRNA）多基因家族在男性生殖細(xì)胞中比其他類型的miRNA 具有更高的表達(dá)水平[15]。在減數(shù)分裂前期，性染色體基因通過(guò)減數(shù)分裂性染色體失活在精母細(xì)胞中發(fā)生表觀遺傳沉默。然而，通過(guò)基因重復(fù)擴(kuò)增的X 連鎖miRNA 家族，卻可以避免被減數(shù)分裂性染色體失活沉默并繼續(xù)在精母細(xì)胞和精子細(xì)胞中表達(dá)。

為了闡明X 連鎖miRNA 的功能，OTA 等[16]使用CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的基因組編輯系統(tǒng)敲除小鼠模型中連續(xù)位于X 染色體上的miR-741-3p、miR-871-3p、miR-465a-5p基因。雖然小鼠睪丸組織未發(fā)現(xiàn)異常，但miR-871-3p的缺失導(dǎo)致減數(shù)分裂在一些生精小管中停止。在培養(yǎng)的小鼠精原干細(xì)胞中，如果僅敲除表達(dá)最高的miR-741-3p，miR-465a-5p的表達(dá)會(huì)顯著上調(diào)并成為含量最豐富的miRNA，同時(shí)mRNA 的全基因組表達(dá)水平保持不變且小鼠的生精過(guò)程正常進(jìn)行。這表明與生精相關(guān)的miRNA 家族成員之間存在功能補(bǔ)償，并且其靶向標(biāo)志物之間存在強(qiáng)烈協(xié)同進(jìn)化。

miR-34家族是第一個(gè)被證明為哺乳動(dòng)物精子產(chǎn)生所必需的X 連鎖miRNA。缺乏miR-34家族成員的小鼠的減數(shù)分裂不能正常進(jìn)行且精子出現(xiàn)缺陷[17]。miR-29簇也被證明在生殖細(xì)胞減數(shù)分裂期對(duì)mRNA 靶標(biāo)進(jìn)行抑制，不過(guò)其靶mRNA 與miR-34簇的靶mRNA 有很大不同[18]。miR-449和miR-34簇的沉默模式相似，能夠靶向多個(gè)共同mRNA。雖然miR-34或miR-449簇的缺失在雄性生殖細(xì)胞發(fā)育中都沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的缺陷，但同時(shí)敲除這兩個(gè)基因會(huì)導(dǎo)致小鼠減數(shù)分裂異常，引起生精障礙[19]。這說(shuō)明miR-34和miR-449簇之間存在功能冗余，兩者在雄性生精過(guò)程中不可或缺。

精子發(fā)生過(guò)程中所必需的過(guò)渡蛋白（TNP）和魚精蛋白（PRM）在減數(shù)分裂特定階段受到miRNA 轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。miR-469簇以TNP2和PRM2為靶點(diǎn)在減數(shù)分裂起始階段高表達(dá)，抑制粗線期精母細(xì)胞和圓形精細(xì)胞中TNP 和PRM 蛋白的表達(dá)，使圓形精細(xì)胞生長(zhǎng)停滯[20]。miR-122a能降解TNP2轉(zhuǎn)錄物，其過(guò)度表達(dá)使圓形精細(xì)胞發(fā)生凋亡，進(jìn)而影響精子成熟[21]。此外，RAD51和HSF2基因也是減數(shù)分裂進(jìn)程中的兩個(gè)重要基因，這兩個(gè)基因分別是miR-10a和miR-18的靶向標(biāo)志物。miR-10a和miR-18的異常將導(dǎo)致上述這兩個(gè)靶基因表達(dá)水平改變，最終影響男性精子正常成熟[22-23]。

2 miRNA與生精障礙的關(guān)系

由于miRNA 在精子發(fā)生過(guò)程中具有重要作用，是精子生成所必需的，因此，miRNA 在男性生精障礙病因?qū)W中具有極大研究?jī)r(jià)值。目前，對(duì)miRNA 與生精障礙的關(guān)系已有了一些的研究和認(rèn)識(shí)，主要集中在表達(dá)譜分析和作為特異性標(biāo)志物的可行性等方面。

2.1 miRNA的表達(dá)譜研究

近年來(lái)，研究不育癥患者睪丸組織或精子中miRNA 的表達(dá)譜成為了解miRNA 在生精障礙中作用的重要方式和手段[24]。例如，在睪丸組織中發(fā)現(xiàn)梗阻性無(wú)精子癥患者與非梗阻性無(wú)精子癥患者之間精原細(xì)胞、粗線期精母細(xì)胞和圓形精子具有miRNA 的獨(dú)特表達(dá)譜。相應(yīng)地，在患者的這3 種細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)一些miRNA 表達(dá)水平改變：精原細(xì)胞中有9 種miRNA 表達(dá)水平異常；粗線期精母細(xì)胞中有11 種miRNA 的表達(dá)水平異常；圓形精子細(xì)胞有10 種miRNA 表達(dá)水平異常[25]。分析這些miRNA 的差異性表達(dá)為進(jìn)一步闡明生精障礙相關(guān)的miRNA提供了重要線索。表達(dá)譜的研究不只限于睪丸組織，在精液中也發(fā)現(xiàn)miRNA 表達(dá)譜的變化。例如，采用高通量測(cè)序技術(shù)分析弱精子癥病例和健康男性精液中的miRNA 圖譜，對(duì)比發(fā)現(xiàn)弱精子癥男性中有18 種miRNA 的表達(dá)水平發(fā)生改變[26]。提示這些miRNA 的改變可能與弱精子癥的發(fā)病有關(guān)。由于精液標(biāo)本相對(duì)睪丸組織標(biāo)本更容易獲取，生精障礙患者精液的miRNA 表達(dá)譜的研究為尋找生精障礙相關(guān)miRNA 提供了便利。

此外，隱睪癥引起的生精障礙也是男性不育的重要原因之一，但miRNA 與該疾病的關(guān)系目前尚不明確。miRNA 表達(dá)譜的研究為了解兩者的關(guān)系提供了新的探索思路。例如，分析隱睪癥患者睪丸組織的miRNA 表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)miR-299-5p、miR-206、miR-135a等多個(gè)miRNA 高表達(dá)，提示相關(guān)miRNA 的表達(dá)異常可能與隱睪癥發(fā)病有關(guān)。

總之，對(duì)生精障礙患者睪丸組織或精子細(xì)胞的miRNA 表達(dá)譜的分析為生精障礙遺傳病因?qū)W研究開(kāi)辟了一個(gè)新的領(lǐng)域。

2.2 miRNA為生精障礙診斷的生物標(biāo)志物

精液中的常規(guī)生化標(biāo)志物，如酸性磷酸酶、檸檬酸、鋅、果糖和α-葡萄糖苷酶，可用于診斷梗阻性生精障礙和生殖腺的功能異常。而現(xiàn)在對(duì)于非梗阻性生精障礙引起的不育癥卻缺乏用于臨床檢驗(yàn)的特異性生物標(biāo)志物，因此，探索具有診斷和預(yù)測(cè)功能的非侵入分子性標(biāo)志物顯得尤為重要。miRNA 以非常穩(wěn)定的形式存在于體液中，且具有組織特異性表達(dá)譜、序列保守性、檢測(cè)擴(kuò)增簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[27]。這些有利條件使其成為研究男性不育癥病因非侵入性生物標(biāo)志物的理想候選者。

目前，已經(jīng)有一些miRNA 被證實(shí)可作為潛在的生物標(biāo)志物用于臨床。例如，miR-34b和miR-122與其他常規(guī)檢測(cè)相結(jié)合可以提高不同形式非梗阻性無(wú)精子癥的診斷準(zhǔn)確性；多變量回歸分析證明miR-10b-3p和miR-34b-5p相較其他檢測(cè)標(biāo)志物在非梗阻性無(wú)精子癥中具有更高的表達(dá)水平，兩者聯(lián)合使用診斷效能更高[28]。miR-I9b和LET-7a基因在少精子癥不育患者中的表達(dá)水平明顯高于正常個(gè)體。因此，miR-19b和LET-7a被認(rèn)為是診斷少精子癥的良好分子生物標(biāo)志物[29]。從目前的研究情況來(lái)看，miRNA 作為生物標(biāo)志物在診斷生精障礙性疾病方面有很大的潛能，但其應(yīng)用于臨床的條件還不完全成熟，還需要進(jìn)一步的研究、篩選并優(yōu)化。

2.3 miRNA的SNP與生精障礙的關(guān)系

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms, SNP）是人類基因組中最豐富的DNA變異形式，研究表明miRNA 的SNP 與多種疾病的發(fā)生有關(guān)。miRNA 基因中的SNP 可通過(guò)影響前體miRNA 的轉(zhuǎn)錄、前體miRNA 的加工及miRNA 與mRNA 的結(jié)合調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，進(jìn)而參與疾病發(fā)生[30]。因此，分析生精相關(guān)的miRNA 的SNP 也成為了解miRNA 與生精障礙性疾病的關(guān)系的重要方法。許多研究證明，一些miRNA 的SNP 與生精障礙有關(guān)。通過(guò)生物信息學(xué)分析、病例對(duì)照研究和雙熒光素酶報(bào)告分析，發(fā)現(xiàn)miR-1302基因SNP 位點(diǎn)rs6631 會(huì)增加生精障礙的風(fēng)險(xiǎn)[31]。與MTHFR基因3′-UTR 結(jié)合的miR-34b的SNP 位點(diǎn)rs55763075 和miR-196a-2的SNPs 位點(diǎn)rs11614913 分別被證實(shí)是無(wú)精子癥的危險(xiǎn)因素[32-33]。最近，又發(fā)現(xiàn)miR-34b/c基因的SNP 位點(diǎn)rs4938723 的多態(tài)性與少精癥相關(guān)，且SNP rs4938723 的CC 基因型可能增加少精癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[34]。該研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明miRNA 在人類生精障礙中的作用提供有價(jià)值的資料。

由于生精相關(guān)的miRNA 的SNP 可能影響miRNA 的功能，引起生精過(guò)程相關(guān)靶基因表達(dá)調(diào)控出現(xiàn)異常，進(jìn)而影響正常生精過(guò)程導(dǎo)致生精障礙。因此，miRNA 的SNP 也被認(rèn)為是生精障礙臨床診斷的候選生物標(biāo)志物。研究鑒定生精障礙相關(guān)的miRNA 的SNP 對(duì)生精障礙的臨床診斷具有重要意義。

3 miRNA在生精障礙領(lǐng)域的展望

miRNA 對(duì)精子發(fā)生中的基因調(diào)控是男性不育癥病因?qū)W研究的重大突破之一，意味著找到了除蛋白質(zhì)之外的重要調(diào)控因子。miRNA 在不同生精階段和不同類型生精障礙性疾病的差異性表達(dá)使其具有極高的特異性和敏感性，在未來(lái)男性生精障礙性疾病的分子機(jī)制研究和臨床診斷與治療上具有很大的發(fā)展空間，有望取得突破性的研究成果。