基于二代測(cè)序技術(shù)ghrelin作用后人卵巢癌細(xì)胞差異表達(dá)lncRNA的生物信息學(xué)分析

宋婉瑩，薩日蓋，高海寧，趙鵬偉

（1.興安盟人民醫(yī)院，內(nèi)蒙古烏蘭浩特 137400；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古呼和浩特 010059；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)研究室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010059）

卵巢癌是一種異質(zhì)性的惡性腫瘤，占女性所有惡性腫瘤的2.5%，由于生存率低，卵巢癌死亡人數(shù)占女性癌癥死亡人數(shù)的5%[1]，是致死率最高的婦科腫瘤，嚴(yán)重威脅女性生命健康。新興的分子靶向治療可特異性干擾致癌靶點(diǎn)，可能是提高卵巢癌治療效果的有效途徑。但目前卵巢癌相關(guān)治療靶點(diǎn)十分有限，迫切需要研究卵巢癌關(guān)鍵靶基因和調(diào)控靶基因的藥物及網(wǎng)絡(luò)。ghrelin 是與惡性腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲等相關(guān)的生長(zhǎng)激素促分泌素受體的天然配體，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[2-3]，ghrelin 能夠調(diào)控人卵巢癌細(xì)胞的增殖、凋亡及自噬過程，但其在非編碼RNA（non-codingRNA, ncRNA）水平上是如何影響卵巢癌進(jìn)展的報(bào)道較少。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）是長(zhǎng)度＞200 bp的ncRNA，起初并不認(rèn)為其具有生物學(xué)功能，但隨著高通量測(cè)序、基因芯片等技術(shù)的日漸成熟，越來越多的lncRNA 被證實(shí)具有重要功能，尤其在腫瘤中的作用受到重視。研究發(fā)現(xiàn)上皮性卵巢癌與正常卵巢組織相比，lncRNA 表達(dá)有差異，這種差異與卵巢癌的發(fā)生及耐藥密切相關(guān)[4]。lncRNA SNHG8、lncRNA DSCR8也被證實(shí)參與卵巢癌進(jìn)展[5-6]。lncRNA 可能是卵巢癌治療的生物標(biāo)志物和潛在靶點(diǎn)，所以深入研究lncRNA 在卵巢癌細(xì)胞中的功能和分子機(jī)制十分有必要。為探討ghrelin 對(duì)卵巢癌細(xì)胞lncRNA 表達(dá)的影響，本研究采用二代測(cè)序技術(shù)，從添加ghrelin 作用后的人卵巢癌細(xì)胞中提取RNA 進(jìn)行測(cè)序，對(duì)差異表達(dá)lncRNA 進(jìn)行生物信息學(xué)分析，初探這些差異lncRNA 的功能及參與的信號(hào)通路，為卵巢癌的診療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑

人卵巢癌細(xì)胞株SK-OV-3 購自武漢普諾賽公司；ghrelin 購自美國(guó)Sigma 公司；總RNA 提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；Trizol 試劑盒購自日本TaKaRa 公司；氯仿購自北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組

人卵巢癌細(xì)胞株SK-OV-3 采用含10% FBS 和1%青霉素/鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基，于37℃、含5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組：無處理的SK-OV-3細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)組：600 ng/mL ghrelin 作用24 h 的SK-OV-3 細(xì)胞。

1.3 lncRNA測(cè)序生物信息分析

1.3.1 生物信息分析流程lncRNA 測(cè)序生物信息分析流程見圖1。

圖1 lncRNA測(cè)序生物信息分析流程

1.3.2 lncRNA 差異表達(dá)分析采用DESeq 對(duì)lncRNA 表達(dá)進(jìn)行差異分析，篩選差異表達(dá)lncRNA的條件：表達(dá)差異倍數(shù)|log2Fold Change|＞1，P＜0.05。采用R 語言ggplots 2 軟件包繪制差異表達(dá)lncRNA 火山圖。

1.3.3 聚類分析使用R 語言Pheatmap 軟件包對(duì)所有差異基因的并集和樣品進(jìn)行雙向聚類分析，根據(jù)同一lncRNA 在不同樣品中的表達(dá)水平和同一樣品中不同lncRNA 的表達(dá)模式進(jìn)行聚類。

1.3.4 靶基因預(yù)測(cè)根據(jù)差異表達(dá)lncRNA 的順式和反式靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果，使用Igraph 包繪制lncRNA與靶基因互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3.5 差異表達(dá)lncRNA 靶基因GO 和KEGG 通路富集分析利用GO term 注釋的差異lncRNA 靶基因?qū)γ總€(gè)term 的lncRNA 靶基因列表，并計(jì)算lncRNA靶基因數(shù)目，然后通過超幾何分布方法計(jì)算P值（顯著富集標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05），找出與整個(gè)基因組背景相比，差異lncRNA 靶基因顯著富集的GO term，從而確定差異lncRNA 靶基因的主要生物學(xué)功能及參與的生物過程。通過KEGG 數(shù)據(jù)庫對(duì)差異表達(dá)lncRNA 靶基因進(jìn)行KEGG 通路富集分析，預(yù)測(cè)這些差異lncRNA 參與的信號(hào)通路。

2 結(jié)果

2.1 ghrelin 對(duì)卵巢癌細(xì)胞lncRNA 及mRNA 表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組發(fā)生差異表達(dá)的lncRNA 有236 個(gè)（上調(diào)130 個(gè)，下調(diào)106 個(gè)）。發(fā)生差異表達(dá)mRNA 有71 個(gè)（上調(diào)66 個(gè)，下調(diào)5 個(gè)）?；鹕綀D展示的是lncRNA 分布情況、lncRNA 的表達(dá)倍數(shù)差異及顯著性結(jié)果。圖中紅點(diǎn)表示差異上調(diào)的lncRNA，藍(lán)點(diǎn)表示差異下調(diào)的lncRNA，灰點(diǎn)表示無差異表達(dá)lncRNA。見圖2。

圖2 差異表達(dá)lncRNA火山圖

2.2 差異表達(dá)lncRNA聚類分析

聚類分析結(jié)果見圖3。圖中橫向表示lncRNA，每一列為一個(gè)樣本，紅色代表高表達(dá)lncRNA，綠色代表低表達(dá)lncRNA。圖中左側(cè)的線圖表示各個(gè)基因在所有樣品中表達(dá)規(guī)律的相似性，在聚類中分支越近的基因，其表達(dá)量的變化規(guī)律就越接近，同一聚類模式的基因可能具有相同或相關(guān)的功能。

圖3 差異表達(dá)lncRNA聚類

2.3 差異表達(dá)lncRNA與mRNA靶向關(guān)系

差異表達(dá)lncRNA 與mRNA 靶向關(guān)系見圖4。圖中用藍(lán)色表示差異下調(diào)lncRNA，紫色表示差異上調(diào)lncRNA，紅色表示差異上調(diào)的mRNA，綠色表示差異下調(diào)的mRNA，連線代表靶向關(guān)系。多個(gè)lncRNA 可同時(shí)與一個(gè)mRNA 具有靶向關(guān)系，共同調(diào)節(jié)靶基因的變化。

圖4 差異表達(dá)lncRNA與mRNA靶向關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 差異表達(dá)lncRNA 靶基因與差異mRNA 交集分析

通過對(duì)差異表達(dá)lncRNA 預(yù)測(cè)到的靶基因與差異mRNA 取交集，得到57 個(gè)基因（上調(diào)54 個(gè)，下調(diào)3 個(gè)），統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖5。圖中紅色表示差異上調(diào)基因，綠色表示差異下調(diào)基因。

圖5 交集分析結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.5 差異表達(dá)lncRNA靶基因富集分析

2.5.1 GO 富集分析對(duì)取交集后靶基因進(jìn)行GO富集分析，按照分子功能（MF）、生物過程（BP）和細(xì)胞組分（CC）進(jìn)行GO 分類，挑選每個(gè)GO 分類中P值最小即富集最顯著的前10 個(gè)GO term 條目進(jìn)行展示，結(jié)果見圖6。圖中橙色柱狀圖表示富集最顯著的前10 個(gè)細(xì)胞組分，綠色柱狀圖表示富集最顯著的前10 個(gè)分子功能，藍(lán)色柱狀圖表示富集最顯著的前10 個(gè)生物過程。

圖6 GO富集分析柱狀圖

根據(jù)GO 富集分析結(jié)果，通過Rich factor、FDR值及富集到此GO term 上的lncRNA 靶基因個(gè)數(shù)來衡量富集的程度。挑選FDR 值最小的即富集最顯著的前20 個(gè)GO term 條目進(jìn)行展示，結(jié)果見圖7。圖中橫坐標(biāo)Rich factor 指該GO term 中富集到的差異lncRNA 靶基因個(gè)數(shù)與注釋到的差異lncRNA 靶基因個(gè)數(shù)的比值。Rich factor 越大，表示富集的程度越大?？v坐標(biāo)表示最顯著的前20 個(gè)GO term 條目。FDR 取值范圍為0～1，越接近于零，表示富集越顯著。

圖7 lncRNA靶基因GO富集分析氣泡圖

以上GO 富集分析結(jié)果顯示，這些差異表達(dá)lncRNA 的主要與精、賴氨酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，氧化應(yīng)激反應(yīng)及發(fā)育過程相關(guān)。

3.5.2 KEGG 通路富集分析根據(jù)差異表達(dá)的lncRNA 靶基因的KEGG 通路富集分析結(jié)果，挑選P值最小即富集最顯著的前20 個(gè)通路進(jìn)行展示，結(jié)果見圖8。由圖可知，這些通路主要涉及4 個(gè)方面，分別為Environmental Information Processing（橙色），Human Diseases （綠色），Metabolism （藍(lán)色），Organismal Systerms（紫色）。

圖8 lncRNA靶基因KEGG通路富集分析柱狀圖

根據(jù)KEGG 通路富集分析結(jié)果，通過Rich factor、FDR 值和富集到此通路上的lncRNA 靶基因個(gè)數(shù)來衡量富集的程度。挑選FDR 值最小的即富集最顯著的前20 條KEGG 通路進(jìn)行展示，結(jié)果見圖9。圖中橫坐標(biāo)表示Rich factor，縱坐標(biāo)表示富集最顯著的前20 條通路。氣泡大小表示富集到此通路上的lncRNA 靶基因的個(gè)數(shù)。

圖9 lncRNA靶基因KEGG通路富集分析氣泡圖

以上KEGG 富集分析結(jié)果顯示：這些差異表達(dá)lncRNA 主要富集在細(xì)胞因子受體信號(hào)通路、胰高血糖素和胰島素信號(hào)通路及癌癥相關(guān)信號(hào)通路上。

3 討論

卵巢癌始于卵巢，因其病死率高，卵巢腫瘤在婦科惡性腫瘤中是最致命的。據(jù)估計(jì)，只有30.6%的女性能存活5年。目前卵巢癌治療方式仍然是手術(shù)加放化療，但分子靶向治療的出現(xiàn)為卵巢癌的治療提供了新的可能，卵巢癌的生物標(biāo)志物之一CA125 被廣泛用于診斷卵巢癌[7]，然而卵巢癌的治療靶點(diǎn)十分有限，隨著基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及代謝組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，有望能夠發(fā)現(xiàn)更多的卵巢癌生物標(biāo)志物與治療靶點(diǎn)。

ghrelin 中文名為胃饑餓素或生長(zhǎng)激素釋放肽，是由28 個(gè)氨基酸構(gòu)成的多肽，主要由胃產(chǎn)生，胃切除后胰腺是其主要來源[8]。ghrelin 在體內(nèi)可發(fā)揮多種生物學(xué)功能，如促進(jìn)生長(zhǎng)激素的分泌、調(diào)節(jié)攝食和能量代謝等，并且參與調(diào)控消化道惡性腫瘤、食管癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌等多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展[9-11]。研究發(fā)現(xiàn)ghrelin 可抑制卵巢癌細(xì)胞增殖，且可能通過miR-1 和Bcl-2 以及抑制mTOR 和經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路調(diào)控該過程[3，12]。但ghrelin 對(duì)卵巢癌細(xì)胞lncRNA 表達(dá)的影響報(bào)道較少。

基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)[13]人類基因中只有不到2%具有編碼蛋白質(zhì)的潛力，而其余大部分均被轉(zhuǎn)錄為ncRNA，包括微小RNA（microRNA，miRNA）、lncRNA 以及環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）。由于沒有編碼蛋白的功能，讓學(xué)者們一度認(rèn)為ncRNA是可有可無的存在，甚至是轉(zhuǎn)錄過程當(dāng)中的“噪音”。但隨著研究的深入學(xué)者們發(fā)現(xiàn)ncRNA 并不是一無是處，功能性ncRNA 參與調(diào)節(jié)多種生命過程，尤其近年來高通量測(cè)序、基因芯片等技術(shù)日漸成熟，讓學(xué)者掀開ncRNA 的神秘面紗。本研究以lncRNA 作為關(guān)注對(duì)象，lncRNA 是一類長(zhǎng)度超過200 bp 并具有更高組織器官特異性的ncRNA[14]。lncRNA 在多種生命活動(dòng)中均可發(fā)揮重要生物學(xué)功能，尤其在腫瘤領(lǐng)域占有至關(guān)重要的位置，研究發(fā)現(xiàn)lncRNA 可參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、自噬、遷移以及凋亡等多種過程[15-17]，lncRNA 已被確定為癌癥發(fā)展過程中的關(guān)鍵調(diào)控分子。在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程中已有多種lncRNA 被證實(shí)發(fā)生差異表達(dá)并發(fā)揮重要作用，如lncRNA TP73-AS1 在卵巢癌組織和卵巢癌細(xì)胞中上調(diào)，而TP73-AS1 上調(diào)與預(yù)后不良有關(guān)。敲低TP73-AS1 可顯著抑制SK-OV-3 細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移，而且，敲低TP73-AS1 抑制體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)[18]。lncRNA EIBC 在卵巢癌組織中高表達(dá)，lncRNA EBIC 的過度表達(dá)可通過Wnt/β-catenin 信號(hào)通路促進(jìn)卵巢癌的增殖、侵襲及遷移，并提高細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性[19]。LINC 00152 在卵巢癌組織和細(xì)胞系中上調(diào)，敲除LINC 00152 可抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)[20]。lncRNA MALAT1 可能使miR-211 成為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA，并可能上調(diào)PHF19 表達(dá)，從而促進(jìn)卵巢癌發(fā)展[21]。此外，lncRNA MALAT1 也可以負(fù)性靶向miR-503-5p 表達(dá)，通過JAK2-STAT3 途徑進(jìn)一步促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖并抑制其凋亡[22]。lncRNA 有望成為新的卵巢癌生物標(biāo)志物與治療靶標(biāo)。

本研究采用第二代測(cè)序技術(shù)，基于illumina HiSeq 測(cè)序平臺(tái)，從ghrelin 作用的人卵巢癌細(xì)胞及對(duì)照組中提取RNA 進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果篩選實(shí)驗(yàn)組人卵巢癌細(xì)胞中差異表達(dá)lncRNA 及mRNA，對(duì)差異表達(dá)lncRNA 進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，將預(yù)測(cè)到的靶基因與差異mRNA 做交集分析，并對(duì)取交集后得到的基因進(jìn)行GO 富集分析、KEGG 信號(hào)通路富集分析，初步探討這些差異表達(dá)lncRNA 在卵巢癌中的主要功能及參與的信號(hào)通路，為卵巢癌的診療提供潛在靶點(diǎn)。